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Dokumentenidentifikation DE102005020003B4 11.10.2007
Titel Fluoreszenzmikroskop
Anmelder Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V., 80539 München, DE
Erfinder Hell, Stefan, Prof.Dr., 37073 Göttingen, DE;
Engelhardt, Johann, Dr., 76669 Bad Schönborn, DE
Vertreter Rehberg Hüppe + Partner, 37073 Göttingen
DE-Anmeldedatum 27.04.2005
DE-Aktenzeichen 102005020003
Offenlegungstag 09.11.2006
Veröffentlichungstag der Patenterteilung 11.10.2007
Veröffentlichungstag im Patentblatt 11.10.2007
IPC-Hauptklasse G02B 21/00(2006.01)A, F, I, 20051017, B, H, DE

Beschreibung[de]

Die Erfindung betrifft ein Fluoreszenzmikroskop mit einer Anregungslichtquelle für Anregungslicht, um einen Fluoreszenzfarbstoff in einer Probe während eines begrenzten Zeitraums in einem räumlichen Bereich zur spontanen Emission von Fluoreszenzlicht mit Wellenlängen in einem Wellenlängenbereich anzuregen, und mit einer gepulsten Abregungslichtquelle für Abregungslicht, um den Fluoreszenzfarbstoff bis auf einen gegenüber dem räumlichen Bereich verkleinerten Restbereich wieder abzuregen, wobei Licht von der Probe mit anderen Wellenlängen als denjenigen des Anregungslichts und des Abregungslichts der spontanen Emission von Fluoreszenzlicht aus dem Restbereich des räumlichen Bereichs zuordbar ist.

Das Wiederabregen des Fluoreszenzfarbstoffs kann dabei so betrieben werden, dass der Restbereich, d. h. der Teilbereich der Probe, in dem der Fluoreszenzfarbstoff angeregt bleibt und aus dem spontan emittiertes Fluoreszenzlicht von der Probe ausschließlich stammt, kleiner als die Beugungsgrenze wird. D. h., mit einem Fluoreszenzmikroskop der eingangs beschriebenen Art kann die Abbe'sche Beugungsgrenze bei der räumlichen Auflösung unterschritten werden.

Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf ein solches Fluoreszenzmikroskop, bei dem die Abregungslichtquelle vorgesehen ist, um den Fluoreszenzfarbstoff außerhalb des Restbereichs durch stimulierte Emission mit der Wellenlänge des Abregungslichts wieder abzuregen. Ein derartiges Fluoreszenzmikroskop wird auch als STED-Fluoreszenzmikroskop bezeichnet, wobei die Abkürzung STED für Stimulated Emission Depletion = Entvölkerung (des fluoreszenzfähigen Zustands) durch stimulierte Emission steht.

STAND DER TECHNIK

Ein STED-Fluoreszenzmikroskop der eingangs beschriebenen Art ist aus der WO 95/21393 bekannt. Zu einem gepulsten Laser, der als Anregungslichtquelle verwendet werden kann, ist hier angegeben, dass er das Anregungslicht vorzugsweise mit einer Pulsbreite von 1 fs bis 1 ns abgibt. Ein als Abregungslichtquelle verwendeter Laser soll das Anregungslicht hingegen mit einer bevorzugten Pulsbreite von 1 ps bis 1 ns abgeben. Mit welchen Lasern dies realisiert werden soll, ist in der WO 95/21393 nicht offenbart. Beide angegebenen Pulsbreiten sind deutlich kürzer als die Lebensdauer des fluoreszierenden Zustands eines typischen Fluoreszenzfarbstoffs von einigen wenigen Nanosekunden.

In der Praxis der STED-Fluoreszenzmikroskopie hat sich herausgestellt, dass die Pulsbreite des Abregungslichts vorzugsweise länger als etwa 100 ps sein sollte. Längere Pulse führen zu einer Ineffizienz bei der stimulierten Emission, kürzere hingegen bei den für eine vollständige Abregung erforderlichen hohen Energien pro Puls zu die Probe schädigenden Prozessen, vermutlich durch Mehrfotonenabsorption. Als Abregungslichtquellen für die STED-Fluoreszenzmikroskopie werden derzeit verschiedene Dioden- und Festkörperlaser verwendet. Mit Diodenlasern werden die für STED-Fluoreszenzmikroskopie benötigten Energien pro Puls kaum erreicht. Bei Festkörperlasern, z. B. Titan-Saphir Lasern, sind die im gepulsten Betrieb erreichbaren Pulsbreiten deutlich kürzer als 100 ps und müssen durch nachgeschaltete Systeme gestreckt werden, die jedoch die Strahlqualität beeinträchtigen. Zudem ist die Linienbreite von gepulsten Festkörperlasern mit einigen Nanosekunden vergleichsweise breit.

Eine weitere Anforderung an die Abregungslichtquelle und auch an die Anregungslichtquelle besteht in der Praxis der STED-Fluoreszenzmikroskopie darin, für die Verwendung verschiedener Fluoreszenzfarbstoffe Anregungslicht mit unterschiedlichen Wellenlängen und hierauf abgestimmtes Anregungslicht mit entsprechend ebenfalls unterschiedlichen Wellenlängen bereitzustellen. Hierzu sind durchstimmbare Laserlichtquellen bekannt, z. B. Titan-Saphir Laser mit nachgeschaltetem optisch parametrisiertem Oszillator (OPO). Diese durchstimmbaren Laserlichtquellen sind jedoch als solche extrem komplex und weisen zudem die oben zu Festkörperlasern aufgeführten grundsätzlichen Nachteile auf.

Für ein konfokales Fluoreszenzmikroskop, also ein Fluoreszenzmikroskop, bei dem keine Erhöhung der räumlichen Auflösung durch Wiederabregen des Fluoreszenzfarbstoffs in der räumlichen Umgebung eines interessierenden Teilbereichs der Probe erfolgt, ist es aus der WO 99/42884 bekannt, akusto-optische Elemente als spektral selektive Elemente einzusetzen, um das von der Probe kommende Fluoreszenzlicht von dem Anregungslicht zu trennen. Akusto-optische Elemente zeichnen sich durch eine besonders hohe spektrale Selektivität aus. So ist es mit einem akusto-optischen Element möglich, Licht mit einer Linienbreite von 1 nm auszublenden. Derart schmalbandiges Licht wird in aktuellen konfokalen Fluoreszenzmikroskopen von als Anregungslichtquellen verwendeten und als Dauerstrichlaser betriebenen Festkörperlasern bereitgestellt.

Diese Filterbreite von akusto-optischen Elementen kann nicht erhöht werden, um sie an auszublendendes Licht mit größerer Linienbreite anzupassen.

Neben gepulsten Dioden- und Festkörperlasern sind auch gepulste Gaslaser in Form so genannter modengekoppelter Gaslaser bekannt. Diese sind jedoch derzeit nicht kommerziell verfügbar. Kommerziell verfügbar sind derzeit nur als Dauerstrichlaser zu betreibende Gaslaser.

Ein bekannter Gaslaser ist der ArKr-Laser, der als Dauerstrichlaser z. B. in der konfokalen Fluoreszenzmikroskopie eingesetzt wird. Ein Vorteil des ArKr-Lasers ist, dass er eine Mehrzahl von Wellenlängen im zur Anregung von Fluoreszenzfarbstoff nutzbaren Spektralbereich aufweist. Es besteht jedoch eine grundsätzliche Tendenz, alle Gaslaser aus Kosten- und Stabilitätsgründen durch Festkörperlaser zu ersetzen. Aus den genannten Kosten- und Stabilitätsgründen ist es häufig sogar sinnvoll, statt eines ArKr-Lasers mehrere Festkörperlaser, möglicherweise kombiniert mit optisch parametrisierten Oszillatoren (OPOs) einzusetzen, um bei einem konfokalen Fluoreszenzmikroskop Anregungslicht mit unterschiedlicher Wellenlänge bereitzustellen.

In der DE 101 05 391 B4 , die ebenfalls ein STED-Fluoreszenzmikroskop der eingangs beschriebenen Art beschreibt, wird ausgeführt, dass als Abregungslichtquelle hauptsächlich Laser, insbesondere Pulslaser verwendet werden. Dabei sollen insbesondere Diodenlaser, Festkörperlaser, Farbstofflaser und Gaslaser einsetzbar sein. In den konkreten Ausführungsbeispielen der DE 101 05 391 B4 ist die Abregungslichtquelle ein Festkörperlaser.

AUFGABE DER ERFINDUNG

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Fluoreszenzmikroskop der eingangs beschriebenen Art, insbesondere ein STED-Fluoreszenzmikroskop, aufzuzeigen, bei dem grundsätzlich besonders günstige Voraussetzungen für das Trennen des Fluoreszenzlichts aus einem interessierenden Teilbereich der Probe von anderem Licht von der Probe gegeben sind.

LÖSUNG

Die Aufgabe der Erfindung wird durch ein Fluoreszenzmikroskop mit den Merkmalen des unabhängigen Patentanspruchs 1 gelöst. Bevorzugte Ausführungsformen des neuen Fluoreszenzmikroskops sind in den abhängigen Patentansprüchen 2 bis 11 beschrieben.

BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Bei dem neuen Fluoreszenzmikroskop ist die Abregungslichtquelle ein modengekoppelter Gaslaser mit einer Linienbreite des Abregungslichts von weniger als 2 nm. Überraschenderweise stellt sich heraus, dass der Aufwand für einen kommerziell nicht verfügbaren modengekoppelten Gaslaser und auch die mit seinem Betrieb verbundenen Stabilitätsprobleme dadurch aufgewogen werden, dass insbesondere das Abregungslicht mit einer Linienbreite von weniger als 2 nm bereitgestellt werden kann. Modengekoppelte Gaslaser sind ohne weiteres in der Lage, gepulstes Abregungslicht mit einer Linienbreite von maximal 1,0 nm und auch noch deutlich weniger bereitzustellen. Dies ermöglicht es, Licht von der Probe mit der Wellenlänge des Abregungslichts sehr schmalbandig von dem spontan emittierten Fluoreszenzlicht von der Probe zu trennen. Hierdurch werden Bandbreitenverluste bei der Detektion des aus dem jeweiligen Restbereich der Probe spontan emittierten Fluoreszenzlichts minimiert. Mit einem modengekoppelten Gaslaser als Abregungslichtquelle sind jedoch noch weitere grundsätzliche Vorteile verbunden. Die Kohärenzlänge von modengekoppelten Gaslasern ist vergleichsweise lang, so dass die gezielte Ausbildung von Interferenzmustern mit dem Abregungslicht, wie sie beispielsweise im Rahmen der so genannten 4 Pi-Fluoreszenzmikroskopie zur räumlichen Verteilung des Abregungslichts um einen interessierenden Teilbereich einer Probe eingesetzt wird, ohne kritische Justagen im Strahlengang möglich ist. Modengekoppelte Gaslaser besitzen auch eine ausgezeichnete transversale Mode TEM00 mit sehr guter Strahlqualität. Daneben können modengekoppelte Gaslaser zur gezielten Beeinflussung des abgestrahlten Laserlichts auch selektiv in einer höheren Mode, wie beispielsweise TEM01, TEM10, TEM11 usw. betrieben werden. Die verfügbaren Pulsenergien sind bei einem Gaslaser ausreichend hoch, und dies bei in aller Regel mehreren für das Abregungslicht verfügbaren Linien, bei denen der Gaslaser selektiv oder auch simultan betrieben werden kann.

Die Vorteile eines modengekoppelten Gaslasers als Abregungslichtquelle sind zum Beispiel voll nutzbar, wenn die Abregungslichtquelle vorgesehen ist, um den Fluoreszenzfarbstoff außerhalb des Restbereichs der Probe durch stimulierte Emission wieder abzuregen. Die von dem Abregungslicht stimulierte Emission der Probe weist die Wellenlänge des Abregungslichts auf. Das heißt, wenn die Linienbreite des Abregungslichts, wie bei dem modengekoppelten Gaslaser besonders schmal ist, gilt dies auch für die stimulierte Emission der Probe. Diese kann also mit einem schmalbandigen Filter zusammen mit reflektierten Anteilen des Abregungslichts von dem spontan emittierten Fluoreszenzlicht abgetrennt werden. Selbst wenn die Wellenlänge des Abregungslichts mitten innerhalb des Wellenlängenbereichs liegt, in dem der Fluoreszenzfarbstoff spontan emittiert, bleibt es daher bei nur kleinen Bandbreitenverlusten bei der Detektion des in einem interessierenden Teilbereich der Probe spontan emittierten Fluoreszenzlichts. Da jedoch festzustellen ist, dass der relative Anteil der stimulierten Emission der Probe an dem Licht von der Probe mit der Wellenlänge des Abregungslichts gegenüber den von der Probe reflektierten Anteilen des Abregungslichts in aller Regel vernachlässigbar gering ist, stellen sich wesentlichen Vorteile des neuen Fluoreszenzmiroskops allein dadurch ein, dass das Abregungslicht spektral schmalbandig ist und entsprechend seine von der Probe reflektierten Anteile von dem Fluoreszenzlicht spektral schmalbandig, d.h. mit geringen Detektionsbandbreitenverlusten, von der Probe abtrennbar sind.

Ein weiterer wichtiger Vorteil von modengekoppelten Gaslasern ist, dass sie in der Lage sind, Licht mit Pulsbreiten in einem Bereich von 50 bis 1000 ps und dabei insbesondere auch in einem Bereich von 100 bis 500 ps bereitzustellen. Hierdurch wird der für die STED-Fluoreszenzmikroskopie ideale Pulsbreitenbereich des Abregungslichts von mehr als 100 bis etwa 300 ps voll abgedeckt.

Wenn der modengekoppelte Gaslaser des neuen Fluoreszenzmikroskops ein ArKr-Gaslaser ist, so kann bei dem Abregungslicht auf die Vielzahl der für die Abregung eines Fluoreszenzfarbstoffs brauchbaren Linien eines ArKr-Gaslasers zurückgegriffen werden. Dabei kann auch die Lichtquelle für das Anregungslicht ein ArKr-Gaslaser sein. Es ist sogar möglich, einen einzigen ArKr-Gaslaser sowohl als Anregungslichtquelle als auch als Abregungslichtquelle vorzusehen, wobei er Laserlicht mit mindestens zwei unterschiedlichen Wellenlängen zugleich abgibt. In diesem Fall sind für das Anregungslicht und das Abregungslicht vorzugsweise partiell unterschiedliche Strahlengänge zu der Probe vorzusehen, wobei die Weglänge mindestens eines der beiden Strahlengänge gegenüber derjenigen des anderen Strahlengangs veränderbar ist, um die zeitliche Abfolge des Eintreffens des Anregungslichts und des Abregungslichts in der Probe einzustellen.

Der modengekoppelte Gaslaser als Abregungslichtquelle des neuen Fluoreszenzmikroskops kann aber auch in an sich bekannter Wiese mit einem weiteren Laser synchronisiert sein, der die Anregungslichtquelle ausbildet. Der weitere Laser kann, wie im Zusammenhang mit dem ArKr-Gaslaser schon angedeutet wurde, ein weiterer modengekoppelter Gaslaser sein. Es kann sich aber beispielsweise auch um einen Dioden- oder Festkörperlaser handeln. Eine Synchronisation des modengekoppelte Gaslaser des neuen Fluoreszenzmikroskops mit einem oder mehreren weiteren Lasern gleicher oder unterschiedlicher Bauart kann auch zum Zweck von Mehrfarbenanwendungen erfolgen.

In besonders bevorzugten konkreten Ausführungsformen des neuen Fluoreszenzmikroskops ist mindestens ein akusto-optisches Element vorgesehen, das Licht mit der Wellenlänge des Abregungslichts von dem Fluoreszenzlicht von der Probe abtrennt. Aufgrund der geringen Linienbreite des Abregungslichts kann bei dem neuen Fluoreszenzmikroskop ein akusto-optisches Element eingesetzt werden, um das von der Probe kommende Licht mit der Wellenlänge des Abregungslichts selektiv auszublenden. Dabei kann das akusto-optische Element ein so genanntes AOD (Acousto-Optical-Deflector) oder ein AOTF (Acousto-Optical-Tuneable-Filter) sein.

Jedes akusto-optische Element kann gleichzeitig auch dazu vorgesehen sein, von der Probe reflektiertes Anregungslicht von dem Fluoreszenzlicht von der Probe abzutrennen. Auf diese Weise bleibt nur das spontan emittierte Fluoreszenzlicht aus dem interessierenden Teilbereich der Probe übrig.

Mindestens eines der akusto-optischen Elemente kann auch zur Ausbildung eines akusto-optischen Strahlteilers verwendet werden, mit dem zugleich das Anregungslicht und/oder das Abregungslicht in den Strahlengang zwischen einem Fotodetektor und der Probe eingekoppelt wird.

Der Restbereich des räumlichen Bereichs, dessen spontaner Emission von Fluoreszenzlicht das Licht von der Probe mit anderen Wellenlängen als denjenigen des Anregungslichts und des Anregungslichts zuordbar ist, kann aus einem einzelnen punktförmigen oder linienförmiger Teilbereich der Probe oder aus einem Muster aus mehreren punkt- oder linienförmigen Teilbereichen bestehen. D. h., der durch das Abregungslicht gegenüber dem räumlichen Bereich, in dem die Anregung des Fluoreszenzfarbstoffs mit dem Anregungslicht erfolgte, verkleinerte Restbereich kann sowohl einen als auch mehrere punktförmige Teilbereiche, aber auch einen oder mehrere linienförmige Teilbereiche umfassen. eine Verbesserung der räumlichen Auflösung bis unter die Beugungsgrenze wird bereits dann erreicht, wenn die Abmessungen der jeweiligen Teilbereiche die Beugungsgrenze in einer einzigen Richtung unterschreiten.

Vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindung ergeben sich aus den abhängigen Patentansprüchen und der gesamten Beschreibung. Weitere Merkmale sind den Zeichnungen – insbesondere den dargestellten Geometrien und den relativen Abmessungen mehrerer Bauteile zueinander sowie deren relativer Anordnung und Wirkverbindung – zu entnehmen. Die Kombination von Merkmalen unterschiedlicher Ausführungsformen der Erfindung oder von Merkmalen unterschiedlicher Patentansprüche abweichend von den gewählten Rückbeziehungen ist ebenfalls möglich und wird hiermit angeregt. Dies betrifft auch solche Merkmale, die in separaten Zeichnungsfiguren dargestellt sind oder bei deren Beschreibung genannt werden. Diese Merkmale können auch mit Merkmalen unterschiedlicher Patentansprüche kombiniert werden.

KURZBESCHREIBUNG DER FIGUREN

Im Folgenden wird die Erfindung anhand in den Figuren dargestellter bevorzugter Ausführungsbeispiele weiter erläutert und beschrieben.

1 zeigt die Energieniveaus eines Fluoreszenzfarbstoffs, die im Rahmen seiner Verwendung bei der STED-Fluoreszenzmikroskopie eine Rolle spielen.

2 skizziert den zeitlichen Ablauf der Pulse des Anregungslichts und des Abregungslichts bei der STED-Fluoreszenzmikroskopie.

3 skizziert die zu 1 zugehörigen Wellenlängen und Wellenlängenspektren.

4 zeigt ein Blockdiagramm zu dem neuen Fluoreszenzmikroskop.

5 skizziert eine Realisation des Fluoreszenzmikroskops gemäß 4; und

6 zeigt eine Anordnung von zwei akusto-optischen Elementen im Strahlengang zwischen einer Probe und einem Fotodetektor gemäß 4 oder 5.

FIGURENBESCHREIBUNG

1 zeigt das Energiespektrum eines Fluoreszenzfarbstoffs. Durch Anregungslicht 5 gelangt der Fluoreszenzfarbstoff aus seinem Grundzustand 1 innerhalb seines elektrischen S0-Zustands in einen angeregten Zustand 4 innerhalb seines elektrischen S1-Zustands. Dieser angeregte Zustand 4 zerfällt innerhalb des elektrischen S1-Zustands in den fluoreszierenden Zustand 3. Aus dem fluoreszierenden Zustand 3 gelangt der Fluoreszenzfarbstoff unter spontaner Emission von Fluoreszenzlicht 6 wieder in einen Zustand innerhalb seines elektrischen S0-Zustands. Der Fluoreszenzfarbstoff kann aber auch durch Abregungslicht 7 zu stimulierter Emission gezwungen werden, insbesondere dann, wenn die Intensität des Abregungslichts 7 über einer Sättigungskonzentration für die Stimulation des Fluoreszenzfarbstoffs zu der stimulierten Emission liegt. Die Stimulation des Fluoreszenzfarbstoffs zu der stimulierten Emission wird bei der STED-Fluoreszenzmikroskopie dazu genutzt, eine mit dem Fluoreszenzfarbstoff markierte Probe, die aufgrund der Abbe'schen Beugungsgrenze nur innerhalb eines einen interessierenden Teilbereich einschließenden und größeren räumlichen Bereichs mit dem Anregungslicht 5 zur spontanen Fluoreszenz angeregt werden kann, außerhalb des Teilbereichs mit dem Abregungslicht 7 wieder abzuregen, wodurch die räumliche Auflösung beim Messen der Probe durch Erfassen des aus dem Teilbereich emittierten Fluoreszenzlichts unter deutlichem Überschreiten der Beugungsgrenze gesteigert werden kann. Aufgrund der Lebensdauer des fluoreszierenden Zustands 3 von typischerweise einigen wenigen Nanosekunden ist es eine technische Herausforderung, das interessierende Fluoreszenzlicht 6 aus dem jeweiligen Teilbereich der Probe sowohl von reflektierten Anteilen des Anregungslichts 5 als auch von reflektierten Anteilen des Abregungslichts 7 zu separieren. Daneben tritt zwar auch noch zusätzliches Licht in Form der mit dem Abregungslicht 7 stimulierten Emission des Fluoreszenzfarbstoffs auf; diese stimulierte Emission weist aber dieselbe Wellenlänge wie das Abregungslicht 7 auf, ist also von diesem nicht zu unterscheiden, und ihre Intensität ist viele Größenordnungen kleiner als diejenige der reflektierten Anteile des Abregungslichts 7. D. h., dieses zusätzliche Licht ist in aller Regel praktisch vernachlässigbar, auch wenn es im Folgenden extra angesprochen wird.

2 zeigt ein Beispiel für die zeitliche Abfolge der Intensitäten des Anregungslichts 5, des spontan emittierten Fluoreszenzlichts 6 und des Abregungslichts 7 bei der STED-Fluoreszenzmikroskopie. Einem Puls 8 des Anregungslichts 5 folgt ein Puls 9 des Abregungslichts 7. Der Puls 9 weist günstiger Weise eine Pulsdauer von über 100 ps bis zu etwa 300 ps auf, um einerseits deutlich kürzer als der Zeitraum zu sein, über den das Fluoreszenzlicht 6 von dem Fluoreszenzfarbstoff spontan emittiert wird, und um andererseits trotz der gewünschten Sättigung bei der stimulierten Emission die Probe und den Fluoreszenzfarbstoff nicht mit übermäßigen Energiedichten zu belasten. Der Puls 8 des Anregungslichts 5 kann, wie hier dargestellt, kürzer als der Puls des Abregungslichts 7 sein. Dies ist jedoch nicht zwingend. Auch der zeitliche Abstand der beiden Pulse 8 und 9 ist hier nur als Beispiel zu verstehen. So ist auch eine weitgehende zeitliche Überschneidung der Pulse 8 und 9 möglich. Die zeitliche Relativlage der Pulse 8 und 9 ist dahingehend zu optimieren, dass das Signal des Fluoreszenzlichts 6 aus dem interessierenden Teilbereich der Probe besonders deutlich ist. Eine zeitliche Separation des Fluoreszenzlichts 6 aus dem interessierenden Teilbereich der Probe ist aufgrund der dichten Abfolge der Pulse 8 und 9 und des sich daran unmittelbar anschließenden interessierenden Fluoreszenzlichts 6 allerdings allenfalls mit extremem Aufwand möglich und bislang nicht realisiert worden.

Praktisch erfolgt daher die Abtrennung des Anregungslichts 5 und des Abregungslichts 7 von dem interessierenden Fluoreszenzlicht 6 durch eine spektrale Selektion. 3 skizziert die Wellenlängen Lambda, die bei dem anhand der 1 und 2 erläuterten Vorgang auftreten. Wenn man von vernachlässigbar kleinen Anteilen des spontan emittierten Fluoreszenzlichts 6 absieht, weist das Anregungslicht 5 die kürzeste Wellenlänge, d. h. die höchste Quantenenergie, auf. Das Fluoreszenzlicht 6 weist auch in dem hier dargestellten Fall von spektral schmalbandigem Anregungslicht 5 Wellenlängen Lambda aus einem vergleichsweise ausgedehnten Wellenlängenbereich 10 von einigen Nanometern Breite auf. Die Wellenlänge des Abregungslichts 7 ist länger als diejenige des Anregungslichts 5 und hier auch länger als die meisten auftretenden Wellenlängen des spontan emittierten Fluoreszenzlichts 6. Damit bleibt ein Detektionsfenster 11 zwischen den Wellenlängen des Anregungslichts 5 und des Abregungslichts 7, in dem spontan emittiertes Fluoreszenzlicht 6detektiert werden kann, ohne zugleich von der jeweiligen Probe reflektiertes Anregungslicht 5 oder Abregungslicht 7 bzw. die stimulierte Emission mit derselben Wellenlänge wie das Abregungslicht 7 aus anderen Bereichen der Probe als dem interessierenden Teilbereich zu detektieren. Die spektrale Breite des Detektionsfenster 11 hängt stark davon ab, wie groß die Linienbreiten des Anregungslichts 5 und des Abregungslichts 7 tatsächlich sind, die hier sehr schmalbandig wiedergegeben sind. Insbesondere kommt es dabei auf die Linienbreite des Abregungslichts 7 an, da sich dessen Wellenlänge grundsätzlich viel tiefer innerhalb des Wellenlängenbereichs 10 befindet, während die Wellenlänge des Abregungslichts 5 immer am äußeren Rand des Wellenlängenbereichs 10 liegt. Insbesondere dann, wenn die Wellenlänge des Abregungslichts 7 noch tiefer als in 3 dargestellt in dem Wellenlängenbereich 10 liegt, kann es zur Erzielung einer großen Detektionsbandbreite nötig werden, auch Anteile des Fluoreszenzlichts 6 mit größerer Wellenlänge als der Wellenlänge des Abregungslichts 7 zu detektieren. Hierzu muss dann aus einem sich weiter zu größeren Wellenlängen hin erstreckenden Detektionsfenster 11 das Abregungslicht 7 selektiv ausgeblendet werden. Dies gelingt nur mit sehr schmalbandigen Filtern. Als solche schmalbandigen Filter sind konkret akusto-optische Elemente bekannt, mit denen Licht mit einer Linienbreite von etwa 1 nm selektiv ausgeblendet werden kann. Diese spektral schmalbandigen Filter können jedoch nur dann sinnvoll eingesetzt werden, wenn das Abregungslicht 7 und die von ihm stimulierte Emission gleicher Wellenlänge eine entsprechend schmale Linienbreite aufweisen. Dies wird bei dem im nachfolgend beschriebenen Fluoreszenzmikroskop erreicht.

Das Blockdiagramm gemäß 4 gibt eine Übersicht über den Aufbau eines STED-Fluoreszenzmikroskops 12 als konkrete Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Fluoreszenzmikroskops. Ein modengekoppelter Gaslaser 13 ist hier sowohl als Anregungslichtquelle 14 als auch als Abregungslichtquelle 15 vorgesehen. Das Anregungslicht 5 und das Abregungslicht 7 werden von den modengekoppelten Gaslaser 13 in gleichzeitigen Pulsen abgegeben. In einem Verzögerungsgenerator 16 wird eine Verzögerung zwischen den Pulsen des Abregungslichts 7 gegenüber den Pulsen des Anregungslichts 5 herbeigeführt (vgl. 2). In einer Phasenkontrolleinrichtung 17 wird die räumliche Verteilung der Phasen des Abregungslichts 7 in einer solchen Weise moduliert, dass sich in dem den interessierenden Teilbereich der Probe einschließenden räumlichen Bereich die gewünschte Intensitätsverteilung des Abregungslichts 7 relativ zu dem Anregungslicht 5 ergibt. In einer Einkoppeleinrichtung 18 wird das Anregungslicht 5 und das Abregungslicht 7 in den Strahlengang des STED-Fluoreszenzmikroskops 12 zwischen der Probe 19 und einem Fotodetektor 20 eingekoppelt. Von der Einkoppeleinrichtung 18 gelangt das Anregungslicht 5 und das Abregungslicht 7 zu der Probe 19. Von der Probe 19 zurück gelangen neben reflektierten Anteilen des Anregungslichts 5 und des Abregungslichts 7 sowohl das interessierende Fluoreszenzlicht 6 von der spontanen Emission aus dem jeweiligen Teilbereich der Probe als auch die stimulierte Emission der Probe 19 mit derselben Wellenlänge wie das Abregungslicht 7. Eine Separation des Fluoreszenzlichts 6 erfolgt in einer Filtereinrichtung 21, die vor dem Fotodetektor 20 angeordnet ist. Auch die Einkoppeleinrichtung 18 kann an der Filterung beteiligt sein, damit nur das interessierende Fluoreszenzlicht 6 den Detektor 20 erreicht.

5 zeigt eine Realisation des STED-Mikroskops 12 gemäß dem Blockdiagramm in 4. Der modengekoppelte Gaslaser 13 ist ein ArKr-Gaslaser 22, in dessen Laserkavität ein Modenkoppler 23 vorgesehen ist, um das Anregungslicht 5 und das Abregungslicht 7 mit dem Gaslaser 13 in Form von einzelnen Pulsen zu erzeugen. Dabei ist die Laserkavität des Gaslasers 13 mit einem Umlenkspiegel 24 gefaltet, um die Gesamtbaulänge des Gaslasers 13 zu reduzieren. Um bei der Modenkopplung eine Dispersionskompensation zwischen dem Anregungslicht 5 und dem Abregungslicht 7 herbeizuführen, ist die Laserkavität des Gaslasers 13 jenseits des Modenkopplers 13 in zwei unterschiedliche Arme für das Anregungslicht 5 und das Abregungslicht 7 aufgeteilt. Dabei kann die dispersive Wirkung des Modenkopplers 23 für die Aufteilung der Laserkavität in die unterschiedlichen Arme für das Anregungslicht 5 und das Abregungslicht 7 ausreichend sein oder beispielsweise durch eine zusätzliche dispersive Wirkung des Umlenkspiegels 24 unterstützt werden. Die Linienspezifizität der Laserkavität für das Anregungslicht 5 und das Abregungslicht 7 ist jeweils durch eine Lochblende 25 bzw. 26 vor dem in unterschiedlichem Abstand zu dem Umlenkspiegel 24 angeordneten Resonatorspiegeln 27 und 28 realisiert. Der modengekoppelte Gaslaser 22 wird in der transversalen TEM00-Mode betrieben, in der er eine hohe Strahlqualität mit hoher Kohärenzlänge aufweist. Insbesondere in dem Bereich der Laserkavität des Gaslasers 13 jenseits des Modenkopplers 23 kann aber auf die Mode auch willentlich so Einfluss genommen werden, dass der Gaslaser 13, z. B. zur Strahlformung, gezielt in einer höheren Mode, so wie TEM01, TEM10 oder TEM11, betrieben wird. Der Verzögerungsgenerator 16 ist in 5 durch eine Anordnung mit einem dichroitischen Spiegel 29, zwei Umlenkprismen 31 und 32 und einem Umlenkspiegel 33 realisiert. Durch die Verschiebung eines der Umlenkprismen 31 und 32, was hier bei dem Umlenkprisma 32durch einen Doppelpfeil 34 angedeutet ist, verändert sich die Weglänge für das Abregungslicht 7 gegenüber dem Anregungslicht 5 und damit die zeitliche Lage des Pulses 9 gemäß 2 gegenüber dem Puls 8 gemäß 2. Über weitere Umlenkspiegel 34 und 35 sowie durch ein Linsensystem 36 aus mindestens einer Linse gelangt das Anregungslicht 5 zusammen mit dem Abregungslicht 7 zu einem dichroitischen Spiegel 37. Von dort gelangt das Anregungslicht 5 durch ein weiteres Linsensystem 39 aus mindestens einer Linse zu einem akusto-optischen Strahlteiler 40 und wird dort in dem Strahlengang zwischen der Probe 19 und dem Fotodetektor 20 eingekoppelt. Das Abregungslicht 7 gelangt von dem dichroitischen Spiegel 37 durch ein Linsensystem 41 aus mindestens einer Linse zu einem so genannten Spatial Light Modulator 42 als Realisation der Phasenkontrolleinrichtung 17. Von dort gelangt das modulierte Abregungslicht 7 durch ein weiteres optisches System 43 aus mindestens einer Linse zu einem dichroitischen Spiegel 44, der hier zum Einkoppeln des Abregungslichts 7 in den Strahlengang zwischen der Probe 19 und dem Fotodetektor 20 dient. In diesem Strahlengang ist zwischen dem dichroitischen Spiegel 44 und der Probe 19 ein Objektiv 45 vorgesehen. Durch dieses Objektiv 45 gelangt von der Probe 19 das Fluoreszenzlicht 6 zusammen mit reflektierten Anteilen des Anregungslichts 5 und des Abregungslichts 7 sowie die von dem Abregungslicht 7 stimulierte Emission gleicher Wellenlänge zurück zu dem dichroitschen Spiegel 44. Von dort gelangt das von der Probe kommende Licht durch ein optisches System 46 aus mindestens einer Linse zu dem akusto-optischen Strahlteiler 40, der sowohl Licht mit der Wellenlänge des Anregungslichts 5 als auch Licht mit der Wellenlänge des Abregungslichts 7 auskoppelt. Dasselbe gilt für einen weiteren akusto-optischen Strahlteiler 47, der hier ausschließlich zum Herausfiltern weiterer Anteile von Licht mit den Wellenlängen des Anregungslichts 5 und des Abregungslichts 7 dient. Von dort gelangt das Fluoreszenzlicht 6 durch ein optisches System aus mindestens einer Linse 48 durch eine konfokal zu dem interessierenden Teilbereich der Probe 19 angeordnete Lochblende 49 sowie durch ein Sperrfilter 50 zu dem Fotodetektor 20. Das Sperrfilter 50 ergänzt die Sperrwirkung der akusto-optischen Strahlteiler 40 und 47 für das von der Probe 19 reflektierte Abregungslicht 7 und die von dem Abregungslicht 7 in der Probe stimulierte Emission gleicher Wellenlänge. Der Einsatz der akusto-optischen Strahlteiler 40 und 47 zum Ausblenden sowohl des Anregungslichts 5 als auch des Abregungslichts 7 und der von diesem außerhalb des jeweils interessierenden Teilbereichs der Probe stimulierten Emission gleicher Wellenlänge ist bei dem STED-Fluoreszenzmikroskop 12 deshalb möglich, weil der ArKr-Gaslaser 22 sowohl das Anregungslicht 5 als auch das Abregungslicht 7 mit jeweils schmaler Linienbreite von weniger als 1 nm bereitstellt. Bei einer derart schmalen Linienbreite weisen akusto-optische Elemente für die durch Ihre akustische Ansteuerung ausgewählten Wellenlängen eine gute Sperrwirkung auf. Weiterhin können die Pulse des modengekoppelten ArKr-Gaslasers direkt in dem Fluoreszenzmikroskop 12 verwendet werden, ohne dass sie in ihrer Länge verändert werden müssen. Sie weisen die für STED-Fluoreszenzmikroskopie optimale Pulsbreite von wenigen 100 ps auf. Durch Veränderung der Lagen der zur Linienselektion dienenden Lochblenden 25 und 26 ist es unter gleichzeitiger Abstimmung der Dispersionskorrektur mit den Resonatorspiegeln 27 und 28 überdies möglich, aus der Vielzahl der bei einem ArKr-Gaslaser grundsätzlich zur Verfügung stehenden Linien jeweils die beiden auszuwählen, die für die Anregung und Abregung eines bestimmten Fluoreszenzfarbstoffs in der Probe 19 besonders gut geeignet sind.

6 zeigt als vergrößertes Detail von 5 den Aufbau des akusto-optischen Strahlteilers 40. Der akusto-optische Strahlteiler 40 weist zwei akusto-optische Elemente 51 und 52 auf. Das akusto-optische Element 51 wird aktiv angesteuert, um das Anregungslicht 5 über einen Umlenkspiegel 53 in den Strahlengang zwischen dem Detektor 20 und der Probe 19 einzukoppeln und um im Gegenzug sowohl das von der Probe reflektierte Anregungslicht 5 als auch das von der Probe reflektierte Abregungslicht 7 sowie die von diesem stimulierte Emission gleicher Wellenlänge von dem spontan emittierten Fluoreszenzlicht 6 abzutrennen. Das zweite akusto-optische Element 52 dient hier im Wesentlichen zur Kompensation von Dispersions- und Doppelbrechungseffekten, da das akusto-optische Element 51 auch das Fluoreszenzlicht 6, das keine feste Wellenlänge aufweist (s. 3) spektral aufspaltet. D. h., das zweite akusto-optische Element 52 richtet die einzelnen spektralen Anteile des Fluoreszenzlichts 6 wieder parallel zueinander aus. Es kann zusätzlich zur Ein- und insbesondere Auskopplung bzw. Ausfilterung weiterer Anteile des Anregungslichts 5 und des Abregungslichts 7 dienen. Die hier verwendeten akusto-optischen Elemente 51 und 52 sind als Acousto-Optical Tuneable Filters bekannt. Es können auch so genannte Acousto-Optical Deflectors als die akusto-optischen Elemente 51 und 52 eingesetzt werden. Weiterhin sind auch bekannte akusto-optische Elemente verwendbar, die einen speziellen Kristall mit dispersionsfreier nullter Ordnung umfassen, so dass keine Dispersionskorrektur benötigt wird, sondern vielmehr mit jedem akusto-optischen Element eine Unterdrückung einer oder mehrerer Linien aus dem Licht von der Probe betrieben werden kann. Die typische Extinktion jedes als AOTF realisierten akusto-optischen Elements liegt für die selektierten Linien mit der Linienbreite von ca. 1 nm bei etwa 95 %. Bei Verwendung mehrerer aktiver akusto-optischer Elemente 51 in Verbindung mit dem Sperrfilter 50 gemäß 5 können das Anregungslicht 5 und das Abregungslicht 7 sowie die von diesem stimulierte Emission gleicher Wellenlänge sehr effektiv von dem Fotodetektor 20 ferngehalten werden.

1
Zustand
2
Zustand
3
Zustand
4
Zustand
5
Anregungslicht
6
Fluoreszenzlicht
7
Abregungslicht
8
Puls
9
Puls
10
Wellenlängenbereich
21
Filtereinrichtung
22
ArKr-Gaslaser
23
Modenkoppler
24
Umlenkspiegel
25
Lochblende
26
Lochblende
27
Resonatorspiegel
28
Resonatorspiegel
29
dichroitischer Spiegel
41
Linsensystem
42
Spatial Light Modulator
43
Linsensystem
44
dichroitischer Spiegel
45
Objektiv
46
Linsensystem
47
akusto-optischer Strahlteiler
48
Linsensystem
49
Lochblende
50
Sperrfilter
11
Detektionsfenster
12
STED-Fluoreszenzmikroskop
13
modengekoppelter Gaslaser
14
Anregungslichtquelle
15
Abregungslichtquelle
16
Verzögerungsgenerator
17
Phasenkontrolleinrichtung
18
Einkoppeleinrichtung
19
Probe
20
Detektor
31
Umlenkprisma
32
Umlenkprisma
33
Umlenkspiegel
34
Umlenkspiegel
35
Umlenkspiegel
36
Linsensystem
37
dichroitischer Spiegel
39
Linsenssystem
40
akusto-optischer Strahlteiler
51
akusto-optisches Element
52
akusto-optisches Element
53
Umlenkspiegel


Anspruch[de]
Fluoreszenzmikroskop mit einer Anregungslichtquelle für Anregungslicht, um einen Fluoreszenzfarbstoff in einer Probe während eines begrenzten Zeitraums in einem räumlichen Bereich zur spontanen Emission von Fluoreszenzlicht mit Wellenlängen in einem Wellenlängenbereich anzuregen, und mit einer gepulsten Abregungslichtquelle für Abregungslicht, um den Fluoreszenzfarbstoff bis auf einen gegenüber dem räumlichen Bereich verkleinerten Restbereich wieder abzuregen, wobei Licht von der Probe mit anderen Wellenlängen als denjenigen des Anregungslichts und des Abregungslichts der spontanen Emission von Fluoreszenzlicht aus dem Restbereich des räumlichen Bereichs zuordbar ist, dadurch gekennzeichnet, dass die Abregungslichtquelle (15) ein modengekoppelter Gaslaser (13) mit einer Linienbreite des Abregungslichts (7) von weniger als 2 nm ist. Fluoreszenzmikroskop nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Abregungslichtquelle (15) vorgesehen ist, um den Fluoreszenzfarbstoff außerhalb des Restbereichs durch stimulierte Emission mit der Wellenlänge des Abregungslichts (7) wieder abzuregen. Fluoreszenzmikroskop nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Pulsbreite des Anregungslichts (7) 100 bis 500 ps beträgt. Fluoreszenzmikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass der modengekoppelte Gaslaser (13) ein ArKr-Gaslaser (22) ist. Fluoreszenzmikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass der modengekoppelte Gaslaser (13) für einen Laserbetrieb in der transversalen Grundmode oder einer höheren Mode ausgebildet ist. Fluoreszenzmikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass der modengekoppelte Gaslaser (13) für einen Laserbetrieb bei einer einzelnen, aber aus einer Mehrzahl von möglichen Wellenlängen auswählbaren Wellenlänge ausgebildet ist. Fluoreszenzmikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass der modengekoppelte Gaslaser zugleich als die Anregungslichtquelle (14) vorgesehen ist, wobei er für einen gleichzeitigen Laserbetrieb bei zwei Wellenlängen ausgebildet ist. Fluoreszenzmikroskop nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass für das Anregungslicht (5) und das Abregungslicht (7) partiell unterschiedliche Strahlengänge zu der Probe (19) vorgesehen sind, wobei die Weglänge mindestens eines der beiden Strahlengänge gegenüber derjenigen des anderen Strahlengangs veränderbar ist, um die zeitliche Abfolge des Eintreffens des Anregungslichts (5) und des Abregungslichts (7) in der Probe (19) einzustellen. Fluoreszenzmikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein akusto-optisches Element (51) vorgesehen ist, das Licht mit der Wellenlänge des Abregungslichts (7) von dem Fluoreszenzlicht (6) von der Probe (19) abtrennt. Fluoreszenzmikroskop nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass jedes akusto-optische Element (51) auch von der Probe reflektiertes Anregungslicht (5) von dem Fluoreszenzlicht (6) von der Probe (19) abtrennt. Fluoreszenzmikroskop Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein akusto-optisches Element (51, 52) einen akusto-optischen Strahlteiler (40) ausbildet, der zugleich das Anregungslicht (5) und/oder das Abregungslicht (7) in den Strahlengang zwischen einem Fotodetektor (20) und der Probe (19) einkoppelt. Fluoreszenzmikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass der Restbereich des räumlichen Bereichs aus einem einzelnen punktförmigen oder linienförmiger Teilbereich der Probe oder aus einem Muster aus mehreren punkt- oder linienförmigen Teilbereichen besteht.






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