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Dokumentenidentifikation DE102006016023A1 11.10.2007
Titel Funktionale Expression von Triacylglycerol-Lipasen
Anmelder BASF AG, 67063 Ludwigshafen, DE
Erfinder Hauer, Bernhard, Prof. Dr., 67136 Fußgönheim, DE;
Häring, Dietmar, Dr., 68535 Edingen-Neckarhausen, DE;
Branneby, Cecilia, Dr., 67069 Ludwigshafen, DE;
Schmid, Rolf, Prof. Dr., 70569 Stuttgart, DE;
Rusnak, Monika, 52070 Aachen, DE;
Liu, Danni, 70563 Stuttgart, DE
Vertreter Reitstötter, Kinzebach & Partner (GbR), 81679 München
DE-Anmeldedatum 05.04.2006
DE-Aktenzeichen 102006016023
Offenlegungstag 11.10.2007
Veröffentlichungstag im Patentblatt 11.10.2007
IPC-Hauptklasse C12N 15/55(2006.01)A, F, I, 20060405, B, H, DE
IPC-Nebenklasse C12N 9/20(2006.01)A, L, I, 20060405, B, H, DE   C12N 15/70(2006.01)A, L, I, 20060405, B, H, DE   C12Q 1/44(2006.01)A, L, I, 20060405, B, H, DE   
Zusammenfassung Die vorliegende Erfindung betrifft für Triacylglycerol-Lipasen codierende Nukleinsäuren, solche Nukleinsäuren umfassende Vektoren, Wirtszellen, welche solche Nukleinsäuren oder Vektoren umfassen, Verfahren zur Expression von Triacylglycerol-Lipasen in Prokaryoten, Verfahren zum Nachweis und zur Herstellung von Triacylglycerol-Lipasen, dadurch erhältliche Triacylglycerol-Lipasen sowie die Verwendung von Triacylglycerol-Lipase-codierenden Nukleinsäuren, Vektoren und rekombinanten Wirtszellen für die genannten Verfahren.

Beschreibung[de]

Die vorliegende Erfindung betrifft für Triacylglycerol-Lipasen codierende Nukleinsäuren, solche Nukleinsäuren umfassende Vektor, Wirtszellen, welche solche Nukleinsäuren oder Vektoren umfassen, Verfahren zur Expression von Triacylglycerol-Lipasen in Prokaryoten, Verfahren zum Nachweis und zur Herstellung von Triacylglycerol-Lipasen, dadurch erhältliche Triacylglycerol-Lipasen, sowie die Verwendung von Triacylglycerol-Lipase-codierenden Nukleinsäuren, Vektoren und rekombinanten Wirtszellen für die genannten Verfahren.

Hintergrund der Erfindung

Triacylglycerol-Lipasen (EC 3.1.1.3) sind geschätzte und effiziente Katalysatoren für verschiedenste industrielle Anwendungen, wie z.B. in der Detergens-Industrie, Oleochemie, Nahrungsmittelindustrie und bei der Herstellung von Feinchemikalien (Schmid 1998). Lipasen sind Carbonsäureester-Hydrolasen, welche die Hydrolyse wie auch die Synthese von Triglyceriden und anderen meist hydrophoben Estern katalysieren. Alle Triacylglycerinlipasen, deren dreidimensionale Kristallstruktur aufgeklärt wurde, sind Angehörige der &agr;/&bgr;-Hydrolasefaltungs-Proteinfamilie, welche eine ähnliche Gesamtarchitektur aufweisen (Ollis 1992).

Candida antarctica-Lipase B (CalB) ist ein effizienter Katalysator für viele Reaktionen und wird beispielsweise für stereoselektive Transformationen und die Polyestersynthese verwendet (Anderson 1998). CalB hat ein Lösungsmittel-zugängliches aktives Zentrum (Uppenberg 1994) und zeigt keinelnterphasen-Aktivierung (Martinelle et al., 1995). Das aktive Zentrum ist ein enger Trichter und CalB weist aus diesem Grund eine höhere Aktivität gegenüber Carbonsäureestern, wie beispielsweise Ethyloctanoat, auf als gegenüber Triglyceriden (Martinelle 1995). Die Tatsache, dass die Aktivität von CalB in organischen Medien denen in Wasser vergleichbar ist, sowie insbesondere die hohe Enantioselektivität von CalB gegenüber sekundären Alkoholen machen dieses Enzym zu einer der wichtigsten Lipasen, die gegenwärtig in der Biotechnologie verwendet werden.

In der Vergangenheit wurde CalB für Anwendungen im großindustriellen Maßstab hauptsächlich in Aspergillus oryzae exprimiert (Hoegh 1995). Für Forschungsanwendungen wurde das Enzym erfolgreich in den Hefen Pichia pastoris (Rotticci-Mulder et al. 2001) und Saccharomyces cerevisiae (Zhang et al. 2003) exprimiert. Die Expression von CalB in dem einfach handhabbaren prokaryotischen Expressionssystem Escherichia coli (E.coli) scheiterte (Rotticci-Mulder 2003). Eine erstmalige Expression in E.coli gelang zwar später, führte aber nur zu geringen Ausbeuten an funktionaler CalB (Rusnak 2004). Dies ist bedauerlich, da E.coli im Vergleich mit anderen Expressionssystemen viele signifikante Vorteile aufweist und das schnelle und billige Hochdurchsatz-Screening großer Gen-Bibliotheken ermöglicht.

Kürzlich wurde die Modifizierung von CalB durch zufällige Mutagenese beschrieben (Chodorge et al., 2005). In der Literatur wurde weiterhin über mehrere Versuche berichtet, CalB für spezielle Anwendungen durch rationales Enzymdesign zu verbessern. Obwohl einige davon zu guten Ergebnissen führten (Patkar et al. 1998; Rotticci 2000), sind die Möglichkeiten des rationalen Enzymdesigns immer noch durch das mangelnde Verständnis der katalytischen Eigenschaften des Enzyms beschränkt.

Das bisher nicht gelöste Hauptproblem besteht jedoch nach wie vor in der unzureichenden Funktionalität von CalB bei Expression in E.coli, welche eine Voraussetzung für die Verbesserung von Enzymen durch gerichtete Evolution ist. Als Grund dafür wird die komplexe Tertiärstruktur des Enzyms gesehen, welche die Bildung von drei Disulfidbrücken erfordert, um eine funktionale Konformation zu gewährleisten. Die Herstellung eines solchen Proteins in E.coli oder anderen Prokaryoten ist mit Schwierigkeiten verbunden, weil die zelluläre Umgebung, die Faltungsmaschinerie und die Checkpoints der Faltungs-Qualitätskontrolle von Prokaryoten sich von denen der Eukaryoten unterscheiden (Baneyx und Mujacic 2004). In Übereinstimmung damit stellten die Erfinder bei anfänglichen Expressionsexperimenten von CalB in E.coli die Bildung von Einschlusskörpern und fehlende Aktivität von CalB fest (Ergebnisse nicht gezeigt).

Zusätzliche Probleme können auf der Ebene der Translation auftreten. Die Menge der tRNA-Spezies kann in den verschiedenen Organismen stark variieren. Dieses Problem kann durch Codon-Optimierung überwunden werden, und tatsächlich wurden die Expressionsgrade einiger eukaryotischer Proteine, z.B. einer Domäne des menschlichen Typ 1 Neurofibrominproteins, signifikant gesteigert (Hale 1998).

Allerdings korreliert die Menge an funktionalem Enzym nicht direkt mit dem Expressionsgrad und daher auch nur konditional mit der Codon-Nutzung.

Zusätzlich zur tatsächlichen Gensequenz spielt der Promotor eine zentrale Rolle bei der Expressionseffizienz. In der Biotechnologie enthalten häufig verwendete Vektorsysteme, z.B. das pET Vektorsystem (Novagen), den T7-Promoter, der sie für die strenge Regulation der starken Überexprimierung heterologer Proteine in E.coli geeignet macht. Hohe Expressionsgrade heterolog exprimierter Enzyme führen allerdings sehr oft zu inkorrekt gefalteten Proteinen.

Es wurde gezeigt, dass kälteempfindliche Promotoren eine effiziente Genexpression bestimmter Proteine bei verringerten Temperaturen erleichtern können. Insbesondere wurde der Promotor des Haupt-Kälteschockgens cspA in den vergangenen Jahren verwendet (Goldstein et al. 1990). Wie aus Vergleichsstudien hervorgeht, ist die Expression löslichen Proteins in E.coli allerdings nach wie vor problematisch und hängt vom Protein sowie vom Ursprungsorganismus des Proteins ab (Qing et al. 2004).

Die zelluläre Umgebung kann ebenfalls einen Einfluss auf die Ausbeute an funktionalem, d.h. enzymatisch aktivem Protein ausüben. Es wurde berichtet, dass Mutationen in den Genen der Glutathion-Reduktase (gor) und Thioredoxin-Reduktase (trxB) zu verstärkter Ausbildung von Disulfidbrücken in Proteinen bei Expression im Cytoplasma von E.coli führen können (Prinz et al. 1997).

Ein Ansatz zur Verbesserung der Ausbeute an löslichen Proteinen im Cytoplasma von E. coli umfasst die Co-Expression molekularer Chaperone, die an der de novo-Proteinfaltung beteiligt sind. So wurde in der Vergangenheit berichtet, dass die Überexpression der Chaperone DnaK-DnaJ oder Trigger Faktor (TF) die Löslichkeit ausgewählter Proteine bei Expression in E.coli erhöhte (Nishihara et al. 2000). Für Zielproteine > 60 kD wurden gute Ergebnisse berichtet. Ein weiterer Mechanismus auf der Basis von GroEL-GroES kann nützlich sein für Zielproteine, die kleiner sind als etwa 60 kD (Baneyx und Mujacic 2004).

Ungeachtet der in der Vergangenheit erzielten Fortschritte hinsichtlich der funktionalen Expression von heterologen Proteinen in E.coli ist eine erfolgreiche Expression jedoch nach wie vor nicht vorhersagbar, sondern hängt stark vom jeweils verwendeten Protein ab.

Bisher liegen keine Berichte über die Erhöhung der funktionalen Expression von rekombinanter Triacylglycerol-Lipase, wie insbesonder CalB, vor.

Der vorliegenden Erfindung lag somit die Aufgabe zugrunde, für Triacylglycerol-Lipasen codierende Nukleinsäuren sowie Verfahren zu deren verbesserter funktionaler Expression in Prokaryoten bereitzustellen. Eine weitere Aufgabe bestand in der Bereitstellung eines Nachweisverfahrens für Triacylglycerol-Lipasen, eines Verfahrens für das Screening solcher Triacylglycerol-Lipasen und von Verfahren zur Herstellung solcher Triacylglycerol-Lipasen.

Kurze Beschreibung der Erfindung

Die der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe wurde gelöst durch ein Verfahren zur Expression von Triacylglycerol-Lipasen, bei dem die erhöhte funktionale Expression der Proteine erreicht wird durch Expression in prokaryotischen, insbesondere E.coli-Wirtsstämmen, unter den im Folgenden näher beschriebenen speziellen Bedingungen.

Die Aufgabe wurde weiterhin gelöst durch Bereitstellung von codierenden Nukleotidsequenzen, welche hinsichtlich der Expression von Lipase B in Prokaryonten, insbesondere E.coli, optimiert sind.

Die Aufgabe wurde weiterhin gelöst durch ein Nachweisverfahren von Triacylglycerol-Lipasen, insbesondere CalB, der Verwendung des Nachweisverfahren zum Screenen von Triacylglycerol-Lipasen, und ein Verfahren zu deren Herstellung.

Figurenbeschreibung

1: Sequenzvergleich zwischen aus C.antarctica amplifizierten calB_wt und dem aus dem Vektor pPCR/calB stammenden synthetischen sequenzoptimierten Gen calB_syn. Unterschiede sind hervorgehoben.

2: SDS-PAGE-Auftrennung löslicher (S) und unlöslicher (I) Fraktionen, die bei 15°C unter Verwendung der Expressionsvektoren pET32-b(+) (in OrigamiTM 2 (DE3)-Zellen) bzw. pColdIII (in OrigamiTM B-Zellen) in den CalB-Expressionsexperimenten erhalten wurden. CalB-Banden (33 kDa) und Trx-CalB-Fusionsprotein-Banden (45 kDa) sind mit Pfeilen markiert. M: Molekulargewichtsstandard. C: Fraktionen einer Kontrolle mit leerem Vektor.

3: SDS-PAGE-Auftrennung löslicher (S) und unlöslicher (I) Fraktionen, die durch Co-Expressionsexperimente von CalB unter Verwendung von pColdIII-Konstrukten mit unterschiedlichen Chaperon-Plasmiden (a: pGro7, b: pG-Tf2, c: pTf16, d: pKJE7, e: pG-KJE8) in OrigamiTM B-Zellen erhalten wurden. CalB (33 kDa) und Chaperone (GroEL: 60 kDa, Tf: 56 kDa, DnaK: 70 kDa, DnaJ: 40 kDa) sind mit Pfeilen markiert. M: Molekulargewichtsstandard (29, 43 und 66 kDa). C: Fraktionen von einer Kontrolle mit leerem Vektor.

4 : Hydrolytische Aktivität gegenüber Tributyrin von geklärten Zelllysaten aus E.coli OrigamiTM 2(DE3)-Zellen (im Fall von pET32b(+)-Expression) und OrigamiTM B-Zellen (alle anderen Konstrukte), welche die angegebenen Konstrukte tragen. Der Mittelwert und die Standardabweichung aus 4-6 unabhängigen Expressionsexperimenten sind angegeben.

5 : Hydrolyse von pNPP in 96-Well-Miktotiterplatten durch geklärte Zelllysate von Origami B-Zellen, welche pColdIII/calB_wt oder _syn) und GroES/GroEL(pGro7) enthalten. Im Fall CalB-exprimierender Zellen wurden 17 (calB_wt) and 18 (calB_syn) Wells untersucht. 6 Wells mit OrigamiTM B-Zellen, welche den leeren pColdIII-Vektor und pGro7 enthielten, wurden als Kontrollen verwendet. Die Werte waren durch Hintergrundextinktionswerte (Substrat ohne Zelllysat) normalisiert.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Ein erster Gegenstand der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Expression funktionaler Triacylglycerol-Lipase in Prokaryoten, wobei man eine Triacylglycerol-Lipase codierende Nukleotidsequenz unter der Kontrolle eines induzierbaren Promotors in einer prokaryotischen Zelle, bevorzugt in E.coli, exprimiert. Die Expression erfolgt insbesondere in einer rekombinanten prokaryotischen Zelle.

Erfindungsgemäß werden unter Triacylglycerol-Lipasen Enzyme der Klasse E.C. 3.1.1.3 gemäß der IUBMB Enzym-Nomenklatur verstanden (http://www.iubmb.unibe.ch; http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/). Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich darüber hinaus insbesondere zur funktionalen Expression von Lipasen, die in ihrer funktionalen Form eine oder mehrere S-S-Brücken (Disulfidbrücken) benötigen, beispielsweise 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 S-S-Brücken pro Peptidkette, wobei die S-S-Brücken zwischen schwefelhaltigen Aminosäuren der gleichen Peptidkette (intramolekular) und/oder schwefelhaltigen Aminosäuren verschiedener Peptidketten (intermolekular) ausgebildet sein können. Weitere Beispiele für Lipasen mit S-S-Brücken sind Lipase aus Aspergillus oryzae (Tsuchiya et al., 1996), Lipase aus Penicillum camenbertii (Yamaguchi et al., 1991), Lipase aus Rhizomucor mihei (Boel et al., 1988) und Lipase aus Candida rugosa (Longhi et al., 1992).

In einer besonderen Ausführungsform erfolgt die Expression bei niedrigen Temperaturen. Im Rahmen dieser Erfindung werden unter niedrigen Temperaturen Raumtemperatur oder unter Raumtemperatur liegende Temperaturen verstanden, also Temperaturen von etwa 25°C oder weniger, beispielsweise 25°C, 24°C, 23°C, 22°C, 21°C, 20°C, 19°C, 18°C, 17°C, 16°C, 15°C, 14°C, 13°C, 12°C, 11°C, 10°C, 9°C, 8°C, 7°C, 6°C, 5°C, 4°C, 3°C, 2°C, 1°C, 0°C, oder zwischen diesen Werten liegende Temperaturen.

Gemäß weiteren Ausführungsformen ist die Temperatur für die Expression ausgewählt aus einem Bereich von 1°C bis 20°C, insbesondere einem Bereich von 10°C bis 20°C, beispielsweise 10°C, 11°C, 12°C, 13°C, 14°C, 15°C, 16°C, 17°C, 18°C, 19°C oder 20°C, und insbesondere einem Bereich von 13°C bis 16°C, beispielsweise 13°C, 14°C, 15°C oder 16°C. In einer speziellen Ausführungsform beträgt die für die Expression verwendete Temperatur etwa 15°C.

Ein Gegenstand der Erfindung betrifft die Expression in einem Thioredoxin-Reduktase-defizienten und/oder Gluthathion-Reduktase-defizienten E.coli-Stamm. Beispiele für solche Stämme sind OrigamiTM 2((DE3) und OrigamiTM B (Novagen, Darmstadt, Deutschland).

Ohne sich auf eine Theorie festzulegen, wird angenommen, dass diese Enzyme die Ausbildung von S-S-Brücken in Proteinen verhindern oder zur Reduktion bereits gebildeter S-S-Brücken beitragen. Das Fehlen eines oder mehrerer dieser Enzyme oder die Unterdrückung ihrer enzymatischen Aktivität stabilisiert somit die Konformation solcher S-S-Brücken enthaltender Proteine.

Gemäß einer speziellen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die funktional exprimierte Triacylglycerol-Lipase Lipase B, das Genprodukt von calB aus Candida antarctica. Das calB-Gen wurde beschrieben (Uppenberget al., 1994) und seine Nukleotid- bzw. Proteinsequenz unter den Zugangsnummern Z30645 bzw. CAA83122.1 bei GenBank hinterlegt. Sofern nicht genauer bezeichnet, bedeutet hier calB eine Nukleotidsequenz dieser Zugangsnummer. Ein Beispiel für eine weitere Triacylglycerol-Lipase ist die Lipase B aus Pseudozyma tsukubaensis (Suen et al. 2004).

Gemäß einer weiteren speziellen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Triacylglycerol-Lipase codierende Sequenz calB_wt (SEQ ID NO:2). calB_wt entstammt einem früheren Projekt der Erfinder, bei dem CalB funktional in Pichia pastoris exprimiert wurde, und ist im pPICZ&agr;A/calB-Konstrukt enthalten (Rusnak 2004). In jenem Projekt zeigte das aus genomischer DNA von Candida antarctica amplifizierte calB-Gen zwei Veränderungen gegenüber der veröffentlichten CalB-Sequenz (CAA83122.1) auf Aminosäure-Ebene (T57A, A89T; SEQ ID NO:13). Die zwei Abweichungen zeigten sich in zwei unabhängigen Amplifizierungsansätzen, in denen das Gen aus zwei verschiedenen Extrakten genomischer DNA amplifiziert wurde. Aus diesem Grund sind sie höchstwahrscheinlich natürliche Variationen des Lipase-Gens. Die Lipase zeigte bei Expression in Pichia pastoris eine mit den veröffentlichten Werten des Wildtyp-CalB vergleichbare Aktivität, so dass die Erfinder in den früheren Projekten mit dem amplifizierten Gen weiterarbeiteten (Rotticci-Mulder et al., 2001; Rusnak 2004).

Gemäß einer weiteren speziellen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Triacylglycerol-Lipase codierende Sequenz calB_syn (SEQ ID NO:1). calB_syn stellt das Ergebnis einer Sequenzoptimierung dar. Sequenzoptimierungsstrategien sind dem Fachmann bekannt und können eine oder eine Kombination mehrerer Maßnahmen umfassen. Beispielsweise werden Codons für Aminosäuren so ausgewählt, dass sie den relativ am häufigsten im ausgewählten Wirt vorkommenden Transfer-RNAs entsprechen. Darüber hinaus kann es vorteilhaft sein, Regionen mit sehr hohem (> 80%) oder niedrigem (< 30%) GC-Gehalt oder bestimmte Sequenzmotive zu vermeiden, die einen Einfluss auf die Expression, also die Transkription der DNA und/oder die Translation der mRNA haben. Für die Herstellung von calB_syn wurde unter Verwendung der GeneOptimizerTM-Technologie (GeneArt, Regensburg, Deutschland) die Codon-Verwendung optimiert und zusätzlich Regionen mit sehr hohem (> 80%) oder niedrigem (< 30%) GC-Gehalt falls möglich vermieden. Darüber hinaus wurden cis-wirkende Sequenzmotive wie beispielsweise interne TATA-Boxen, Chi-Stellen, ribosomale Andockungsstellen, ARE-, INS- und CRS-Sequenzelemente ebenso wie repetitive Sequenzen und RNA-Sekundärstrukturen vermieden. Das Gen unterscheidet sich in 253 Nukleotiden (26,5%) von der calB_wt-Sequenz (1). Auf Aminosäure-Ebene kodiert das synthetische Gen das veröffentlichte Protein (CAA83122.1; SEQ ID NO:12).

Gemäß weiteren speziellen Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens sind die Triacylglycerol-Lipase codierenden Sequenzen Homologe von calB_wt oder calB_syn. calB von C.antarctica, insbesondere calB_wt und/oder calB_syn sowie deren Homologe, insbesondere funktionale Äquivalente codierende Homologe, stellen in jedem hier beschriebenen Zusammenhang bevorzugte Vertreter für Triacylglycerol-Lipasen codierende Nucleotidsequenzen dar.

Unter einer homologen Nukleotidsequenz oder einer homologen Nukleinsäure oder einem Homologen wird erfindungsgemäß verstanden, dass nicht mehr als 40% der Nukleotide, insbesondere nicht mehr als 35% der Nukleotide, wie z.B. nicht mehr als 30% der Nukleotide oder nicht mehr als 26%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2% oder 1% der Nukleotide beim Vergleich mit einer Referenznukleotidsequenz oder Referenznukleinsäure unterschiedlich sind. Beispielsweise ist eine zu SEQ ID NO:1 homologe Sequenz hinsichtlich nicht mehr als 40% der Nukleotide, insbesondere nicht mehr als 35% der Nukleotide, wie z.B. nicht mehr als 30% der Nukleotide oder nicht mehr als 26%, 25%, 20%, 15% oder 10% der Nukleotide verschieden von SEQ ID NO:1.

Homologe Nuklotidsequenzen stellen insbesondere solche Sequenzen dar, die mit oben genannten Referenznukleotidsequenzen unter „stringenten Bedingungen" hybridisieren. Unter dieser Eigenschaft versteht man die Fähigkeit eines Poly- oder Oligonukleotids unter stringenten Bedingungen an eine nahezu komplementäre Sequenz zu binden, während unter diesen Bedingungen unspezifische Bindungen zwischen weniger komplementären Partnern unterbleiben. Dazu sollten die Sequenzen zu 70-100%, vorzugsweise zu 75%, 80%, 85% oder 90% bis 100% komplementär sein. Die Eigenschaft komplementärer Sequenzen, spezifisch aneinander binden zu können, macht man sich beispielsweise in der Northern- oder Southern-Blot-Technik oder bei der Primerbindung in PCR oder RT-PCR zunutze. Üblicherweise werden dazu Oligonukleotide ab einer Länge von 30 Basenpaaren eingesetzt. Unter stringenten Bedingungen versteht man beispielsweise in der Northern-Blot-Technik die Verwendung einer 50-70°C, vorzugsweise 60-65°C warmen Waschlösung, beispielsweise 0,1× SSC-Puffer mit 0,1% SDS (20× SSC: 3M NaCl, 0,3M Na-Citrat, pH 7,0) zur Elution unspezifisch hybridisierter cDNA-Sonden oder Oligonukleotide. Dabei bleiben, wie oben erwähnt, nur in hohem Maße komplementäre Nukleinsäuren aneinander gebunden. Die Einstellung stringenter Bedingungen ist dem Fachmann bekannt und ist z.B. in Ausubel et al. (1989) beschrieben (Kapitel 6.3.1-6.3.6). Homologe Nukleinsäuren lassen sich beispielsweise bei der Durchmusterung von genomischen oder cDNA-Banken auffinden und gegebenenfalls daraus mit geeigneten Primern mittels PCR vermehren und anschließend beispielsweise mit geeigneten Sonden isolieren.

Homologe der erfindungsgemäßen Triacylglycerol-Lipasen, insbesondere der erfindungsgemäßen Lipasen B aus Candida antarctica, können durch Screening kombinatorischer Banken von Mutanten, wie z.B. Verkürzungsmutanten, identifiziert werden. Beispielsweise kann eine Bank von Protein-Varianten durch kombinatorische Mutagenese auf Nukleinsäureebene erzeugt werden, wie z.B. durch enzymatisches Ligieren eines Gemisches synthetischer Oligonukleotide. Es gibt eine Vielzahl von Verfahren, die zur Herstellung von Banken potentieller Homologer aus einer degenerierten Oligonukleotidsequenz verwendet werden können. Die chemische Synthese einer degenerierten Gensequenz kann in einem DNA-Syntheseautomaten durchgeführt werden, und das synthetische Gen kann dann in einen geeigneten Expressionsvektor ligiert werden. Die Verwendung eines degenerierten Gensatzes ermöglicht die Bereitstellung sämtlicher Sequenzen in einem Gemisch, die den gewünschten Satz an potentiellen Proteinsequenzen kodieren. Verfahren zur Synthese degenerierter Oligonukleotide sind dem Fachmann bekannt (z.B. Narang 1983; Itakura et al., 1984; Ike et al., 1983).

Gemäß weiterer Ausführungsformen steht die Triacylglycerol-Lipase codierende und insbesondere erfindungsgemäßes calB codierende Nukleotidsequenz unter der Kontrolle des T7-Promotors, beispielsweise eines Promotors gemäß SEQ ID NO:3 oder dazu homologer Sequenzen. Geeignete Vektoren, die eine Expression unter Kontrolle des T7-Promotors erlauben, sind dem Fachmann bekannt, beipielsweise das pET-Vektorsystem (Novagen), z.B. die Vektoren pET-32a-c(+). Erfindungsgemäß werden bereitgestellt calB_syn bzw. calB_wt in pET-32b(+) (SEQ ID NO:7 bzw. SEQ ID NO:8). Die Expression aus diesen Vektoren erfolgt insbesondere bei Temperaturen gemäß obenstehender Definition. Erfindungsgemäß wurde überraschend gefunden, dass bei Expression von calB_wt oder calB_syn aus pET-Vektoren ohne Verwendung besonderer, durch Kälte induzierbarer Promotoren durch Inkubation bei niedrigen Temperaturen ein erhöhter Anteil an funktionalem Protein gebildet wurde.

Gemäß weiteren Ausführungformen steht die Triacylglycerol-Lipase codierende und insbesondere erfindungsgemäßes calB codierende Nukleotidsequenz unter der Kontrolle eines durch Kälteschock induzierbaren Promotors. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird unter Kälteschock verstanden, dass der Promotor niedrigen Temperaturen ausgesetzt wird. Ein geeigneter durch Kälteschock induzierbarer Promotor ist der Promotor des Haupt-Kälteschockgens cspA von E.coli (SEQ ID NO:4) (Goldstein et al., 1990). Diesen Promotor enthaltende Expressionsvektoren, die eine Klonierung eines gewünschten Zielgens über übliche Verfahren ermöglichen, sind dem Fachmann bekannt, beispielsweise die Vektoren pCOLD in ihren verschiedenen Variationen von Takara Bio Inc., Japan (Takara 2003). Erfindungsgemäß werden bereitgestellt calB_syn bzw. calB_wt in pCOLDIII (SEQ ID NO:9 bzw. SEQ ID NO:10). Es wurde überraschend gefunden, dass bei Expression aus diesen Vektoren in OrigamiTM 2(DE3)-Zellen und OrigamiTM B-Zellen eine erhöhte Menge an funktionalem Protein gebildet wird. Die Induktion des Kälteschock-Promotors erfolgt durch Inkubation bei niedrigen Temperaturen und gegebenenfalls unter Zugabe weiterer für die Expression erforderlicher Faktoren (beispielsweise IPTG bei Genen, die unter der Kontrolle des lac-Operators stehen). Eine kontrollierte Einstellung niedriger Temperaturen kann gegebenenfalls durch vorherige Inkubation (beispielsweise 30-minütige Inkubation) auf Eis erleichtert werden. Dem Fachmann sind weitere, durch Kälte induzierbare Promotoren bekannt, die beispielsweise beschrieben sind in Qoronfleh et al., 1992, Nakashima et al. 1996 oder Giladi et al. 1995.

Ohne auf eine Theorie festgelegt zu sein, wird angenommen, dass eine Strategie zur erhöhten funktionalen Expression von Triacylglycerol-Lipasen, insbesondere CalB und deren funktionalen Äquivalenten, darin besteht, die Expression des Proteins im wesentlichen nur bei niedrigen Temperaturen zuzulassen. Erfolgt eine Expression bei darüberliegenden Temperaturen, so kann sich falsch gefaltetes Protein bilden, das als Kristallisationskeim fungiert, der die Bildung von funktionalem Protein stört, selbst wenn die Expression später unter Bedinungen erfolgt, die normalerweise zu funktionalem Protein führen (beispielsweise niedrige Temperaturen). Eine erfindungsgemäße Umsetzung dieser Strategie umfasst die Expression unter Kontrolle von Promotoren, die eine nennenswerte Expression nur bei niedrigen Temperaturen zulassen (beispielsweise den in pCOLD-Vektoren enthaltenen Promotoren), wobei die Expression gegebenenfalls zusätzlich kontrolliert wird durch Repressoren der Transkription (beispielsweise das Genprodukt von lacI, welches bei Fehlen von IPTG die Transkription verhindert und diese bei Gegenwart von IPTG zulässt). Eine weitere Umsetzung besteht darin, Promotoren, insbesondere starke Promotoren, zu verwenden, deren Transkriptionsaktivität streng kontrolliert werden kann, und eine Transkription von diesen Promotoren nur bei niedrigen Temperaturen zuzulassen. Neben pET-Vektoren, die T7-Promotoren umfassen, sind dem Fachmann wietere Promotoren bzw. Kombinationen von Promotoren und regulativen Elementen (beispielsweise Repressoren) bekannt, z.B. C1-regulierte Promotoren (Schofield et al., 2002), der PltetO-1-Promotor (Lutz und Bujard, 1997) oder rhaT-Promotoren (Giacalone et al. 2006).

Die Inkubationsdauer wird für jedes verwendete Vektorsystem so gewählt, dass eine maximale Menge an funktionalem Protein gebildet wird, und kann von Fachmann über Routineversuche für das jeweils aus einer gegebenen Nukleinsäure zu exprimierende Protein leicht ermittelt werden. Übliche Zeiträume sind 1 bis 48 Stunden, beispielsweise 8, 12, 16 und 24 Stunden.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verfahrens werden gleichzeitig mit der Triacylglycerol-Lipase codierenden und insbesondere der calB codierenden Nukleotidsequenz ein oder mehrere Chaperone exprimiert. Die Chaperone sind beispielsweise ausgewählt unter GroES, GroEL, DnaK, DnaJ, GrpE und Trigger Factor (TF) von E.coli. Eine Expression ist in beliebigen Kombinationen möglich, insbesondere werden die jedoch co-exprimiert die Kombinationen GroEL und GroES; oder DnaK, DnaJ und GrpE; oder DnaK, DnaJ, GrpE, GroES und GroEL; oder es wird Trigger Factor, optional zusammen mit GroES und GroEL co-exprimiert. Die Chaperone können gemeinsam mit der für die Triacylglyderol-Lipase codierenden Nukleotidsequenz von einem Vektor exprimiert werden. Alternativ können die Triacylglycerol-Lipase codierende Nukleotidsequenz und die Chaperon(e) codierende(n) Nukleotidsequenz(en) von getrennten Vektoren exprimiert werden. Geeignete Vektoren sind im kommerziell erhältlichen „Chaperone Plasmid Set" enthalten, das die Plasmide pG-KJE8, pGro7, pKJE7, pG-Tf2 und pTf16, umfasst (Takara Biomedicals, Japan, Takara 2003b).

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von Triacylglycerol-Lipasen, wobei man

  • i) ein Protein, für das man eine Triacylglycerol-Lipase Aktivität vermutet, gemäß einem der oben genannten erfindungsgemäßen Verfahren exprimiert,
  • ii) das Expressionsprodukt mit einem von Triacylglycerol-Lipase hydrolysierbaren Substrat in Kontakt bringt, und
  • iii) die Hydrolyseaktivität bestimmt.

Dieses Verfahren ist geeignet für das Auffinden, d.h. Screenen neuer Triacylglycerol-Lipasen, insbesondere solcher mit einer der Lipase B von Candida antarctica vergleichbaren Enzymaktivität. Für den Fachmann ist es weiterhin ersichtlich, dass das Verfahren analog angewendet werden kann für Lipasen, in ihrer funktionalen Form eine oder mehrere S-S-Brücken benötigen, beispielsweise 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 S-S-Brücken pro Peptidkette, wobei die S-S-Brücken zwischen schwefelhaltigen Aminosäuren der gleichen Peptidkette (intramolekular) und/oder schwefelhaltigen Aminosäuren verschiedener Peptidketten (intermolekular) ausgebildet sein können.

Geeignete hydrolysierbare Substrate sind dem Fachmann bekannt, der Nachweis der Hydrolyseaktivität kann ebenfalls in fachüblicher Weise erfolgen. Beispielsweise führt Tributyrin bei Zugabe zu Agarplatten in geeigneten Konzentrationen (z.B. 1%) zu deren Trübung, die bei enzymatischer Hydrolyse verschwindet. Weitere geeignete Substrate sind Verbindungen, deren hydrolytische Spaltung zu einer beispielsweise photometrisch nachweisbaren Farbveränderung führt (z.B. p-Nitrophenylpalmitat). Die Hydrolyseaktivität kann weiterhin durch enzymatische Spaltung von Carbonsäureestern im pH-stat Assay bestimmt werden. Dabei wird das durch die freiwerdenden Carbonsäuren bedingte Absinken des pH-Werts durch Titration mit NaOH konstant gehalten. Der Verbrauch an NaOH, der proportional ist zur Menge an freigesetzer Carbonsäure, gibt somit einen Aufschluss über die Hydrolyseaktivität des Enzyms. Hinsichtlich der oben genannten Nachweisverfahren wird auf Rusnak, 2004 (Kapitel 8.4.2) verwiesen, auf das vollumfänglich Bezug genommen wird.

Weitere, durch Triacylglycerol-Lipase hydrolysierbare Substrate können ermittelt werden, indem man versucht, ein in Frage kommendes Substrat über dem Fachmann bekannte Triacylglycerol-Lipasen (beispielsweise CalB mit der Sequenz CAA83122.1) zu hydrolysieren. Lässt sich eine Hydrolyse feststellen, so kann das Substrat in dem erfindungsgemäßen Verfahren zum Nachweis von Triacylglycerol-Lipasen verwendet werden.

Wenngleich das oben beschriebene Nachweisverfahren in fachüblichen Petrischalen oder Gefäßen für die Zellkultur durchgeführt werden kann, so ist in einer speziellen Ausführungsform die Verwendung von Mikrotiterplatten vorgesehen. Beispielsweise kann die Expression des Proteins mit vermuteter Triacylglycerol-Lipase-Aktivität bereits in der Mikrotiterplatte erfolgen, etwa durch Kultivierung der Prokaryoten in der Mikrotiterplatte und Induzierung der Expression des Proteins. Weiterhin kann auch der Nachweis der Hydrolyseaktivität in der Mikrotiterplatte erfolgen, wobei je nach den Parametern der vorliegenden Kultur der Nachweis ohne vorherige Abtrennung der Mikroorganismen erfolgend kann. Beispielsweise kann bei geringen Zelldichten in den jeweiligen Wells der Mikrotiterplatte eine direkte Bestimmung der Hydrolyseaktivität durch Änderung der Trübungseigenschaften des Mediums oder Umsetzung eines photometrischen Substrats bestimmt werden, ohne dass die jeweiligen Messwerte durch eine hohe Zelldichte verfälscht würden. Alternativ können die prokaryotischen Zellen nach Expression des in das Kulturmedium freigesetzten Proteins mit vermuteter Triacylglycerol-Lipase-Aktivität vom Medium abgetrennt werden (beispielsweise durch Sedimentation der Zellen über Zentrifugation und Entfernen des Überstandes oder sofortiges Entfernen des Mediums im Falle adhärent an der Well-Oberfläche wachsender oder trägergebundener Zellen) und das Protein mit vermuteter Triacylglycerol-Lipase enthaltende Medium zur Bestimmung der Hydrolyseaktivität in neue Mikrotiterplatten überführt werden.

Gemäß einer speziellen Ausführungsform erfolgt die Expression des Proteins mit vermuteter Triacylglycerol-Lipase-Aktivität in Gegenwart eines hydrolysierbaren Substrats, beispielsweise eines in einem Kulturmedium gelösten Substrats. Gemäß einer weiteren Ausführungsform können Prokaryoten, die ein Protein mit vermuteter Triacylglycerol-Lipase-Aktivität exprimieren, beispielsweise auf einem Nährboden kultiviert werden, der ein hydrolysierbares Substrat enthält. Besonders geeignet sind in diesem Zusammenhang Agarnährböden, die durch ihren Gehalt an Tributyrin trüb sind. Bei Expression einer hydrolytisch aktiven Triacylglycerol-Lipase, beispielsweise nach Induktion des Triacylglycerol-Lipase codierenden Gens durch chemische Substanzen oder Temperaturveränderung je nach verwendetem Expressionsvektor, erfolgt eine Spaltung des Tributyrins und dadurch eine Klärung des trüben Agars. An Stellen des Agars mit ausreichender Triacylglycerol-Lipase-Aktivität entsteht somit ein Hof, der visuell oder automatisiert über geeignete Bildverarbeitungssysteme (z.B. Quantimet 500 Qwin; Leica, Cambridge, Großbritannien) erfasst werden kann und zur Identifizierung einer Triacylglycerol-Lipase-Aktivität hervorbringenden Bakterienkolonie dienen kann. Für den Fachmann erschließen sich weitere Modifikationen des Verfahrens, beispielsweise die Beimpfung von Tributyrin-Agar-gefüllten Wells von Mikrotiterplatten mit Bakteriensuspensionen in Verdünnungen, die pro Well einzelne Bakterienkolonien entstehen lassen, und anschließende visuelle oder automatisierte Bildauswertung.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird das exprimierte Protein mit vermuteter Triacylglycerol-Lipase-Aktivität von den exprimierenden prokaryotischen Zellen, insbesondere E.coli, abgetrennt und anschließend in zellfreiem Zustand mit dem hydrolysierbaren Substrat in Kontakt gebracht. Dem Fachmann sind geeignete Verfahren zur Abtrennung bekannt, beispielsweise Sedimentation der Zellen durch Zentrifugation oder Abtrennung durch Filtration. Diese Ausführungsform weist den Vorteil auf, dass der nachfolgende Nachweis der Hydrolyseaktivität nicht durch die Anwesenheit der prokaryotischen Zellen beeinflusst wird.

Gemäß einer speziellen Ausführungsform erfolgt dieser Nachweis photometrisch durch Bestimmung der Abnahme eines hydrolysierbaren Substrats oder Zunahme des Hydrolyseprodukts. Dem Fachmann sind geeignete Substrate bekannt, beispielsweise p-Nitrophenylester wie p-Nitrophenylpalmitat oder p-Nitrophenylacetat. Die Parameter der photometrischen Messung können vom Fachmann ohne weiteres auf die verwendeten Substrate und Lösungen angepasst werden (beispielsweise empfiehlt sich bei Verwendung von p-Nitrophenylpalmitat (pNPP) die Messung der Zunahme der Extinktion bei 410 nm).

In einer speziellen Ausführungsform wird das erfindungsgemäße Nachweisverfahren zum Screenen (Screeing) mutagenisierter Proteine oder durch mutagenisierte Nukleinsäuren codierter Proteine auf Triacylglycerol-Lipase-Aktivität verwendet. Dabei kann es sich um Proteine handeln, denen durch Mutagenese Triacylglycerol-Lipase-Aktivität verliehen werden soll (beispielsweise durch Einbau von Sequenzmotiven, die als für diese Enzymaktivität wichtig erkannt wurden, in Proteine, die keine oder nur geringe Triacylglycerol-Lipase-Aktivität aufweisen), oder um Proteine mit bereits bekannter Triacylglycerol-Lipase-Aktivität, die durch Einführung einer oder mehrerer Mutationen modifiziert werden soll. Unter einer Mutagenese (die zu einer Mutation oder zu einer mutierten Nukleotidsequenz oder einem mutierten Protein führt) wird in Bezug auf Nukleotidsequenzen das Hinzufügen, Entfernen oder Austauschen wenigstens eines Nukleotids verstanden. In Bezug auf Proteine wird darunter das Hinzufügen, Entfernen oder Austauschen wenigstens einer Aminosäure verstanden. Bei einem mutagenisierten erfindungsgemäßen Protein handelt es sich insbesondere um ein solches Protein, dessen codierende Nukleotidsequenz die Lipase B aus Candida antarctica codierende Nukleotidsequenz (calB) umfasst, oder um ein Protein, dessen codierende Nukleotidsequenz wenigstens eine Mutation im Vergleich mit der codierenden Nukleotidsequenz einer Lipase B aus Candida antarctica (calB) aufweist, oder um ein Protein, dessen codierende Nukleotidsequenz homolog ist zur codierenden Nukleotidsequenz einer Lipase B aus Candida antarctica (calB), oder um ein Protein, das ein funktionales Äquivalent zu einer Lipase B aus Candida antarctia (CalB) darstellt. Bei all diesen Proteinen muss eine Mutagenisierung der das jeweilige Protein codierenden Nukleotidsequenz nicht zwangsläufig zu einer Veränderung der Aminosäuresequenz des exprimierten Proteins führen. Wie oben bereits erwähnt, sind dem Fachmann Verfahren bekannt, um die Nukleotidsequenz von Genen beispielsweise hinsichtlich der im für die Expression vorgesehenen Wirtsorganismus bevorzugten Codon-Nutzung (codon usage), der Vermeidung von mRNA-Sekundärstrukturen oder bestimmter Sequenzmotive zu optimieren (z.B. die GeneOptimizerTM-Technologie von GeneArt, Regensburg, Deutschland). Diese Optimierungen können der Verbesserung der Expression sowohl auf Transkriptionsebene als auch auf Translationsebene dienen und gleichzeitig unter Ausnützung des degenerierten Codes, der für bestimmte Aminosäuren mehrere Basentripletts zulässt, zur Translation eines unveränderten Proteins dienen. In diesem Fall dient das erfindungsgemäße Nachweisverfahren der Kontrolle der Expression eines funktionalen Proteins. Andererseits können durch Mutagenese codierender Nucleotidsequenzen Proteine hergestellt werden, deren Aminosäuresequenz im Vergleich mit Proteinen, die von nicht-mutagenisierten Ausgangssequenzen exprimiert werden, unterschiedlich sind. In diesem Fall kann mit dem erfindungsgemäßen Nachweisverfahren überprüft werden, ob die durch die mutagenisierten Nukleotidsequenzen codierten Proteine eine im Vergleich mit den durch die nicht-mutageniserten Ausgangssequenzen codierten Proteine gleichbleibende oder eine modifizierte, beispielsweise eine verringerte (oder fehlende), eine erhöhte, oder eine hinsichtlich eines oder verschiedener Parameter der enzymatischen Aktivität veränderte Hydrolyseaktivität aufweist. Als solche Parameter, die insbesondere getestet werden können durch Wahl der Bedingungen, bei denen ein mutagenisertes Protein mit vermuteter Triacylglycerol-Lipase-Aktivität gemäß Schritt ii) des erfindungsgemäßen Nachweisverfahrens mit einem hydrolysierbaren Substrat in Kontakt gebracht wird, kommen beispielsweise in Frage die Substratspezifität, Enantioselektivitat oder Wechselzahl des Proteins sowie deren Abhängigkeit beispielsweise von Temperatur, pH, Ionenkonzentration und/oder Anwesenheit möglicher Inhibitoren oder Aktivatoren.

Die Mutagenese durch gezielte Veränderungen der Nukleotidsequenz, beispielsweise über die Polymerase-Kettenreaktion (PCR), sowie durch ungerichteter Veränderungen, beispielsweise über chemische Mutagenese, ist dem Fachmann bekannt und beispielsweise beschrieben in Roufa 1996 oder Kirchhoff und Desrosiers 1996.

Die oben beschriebene Verwendung des erfindungsgemäßen Nachweisverfahrens eignet sich insbesondere für das Screening von Genbanken. Beispielsweise kann eine Bank von Protein-Varianten durch kombinatorische Mutagenese auf Nukleinsäureebene erzeugt werden, wie z.B. durch enzymatisches Ligieren eines Gemisches synthetischer Oligonukleotide. Es gibt eine Vielzahl von Verfahren, die zur Herstellung von Banken potentieller Homologer aus einer degenerierten Oligonukleotidsequenz verwendet werden können. Die chemische Synthese einer degenerierten Gensequenz kann in einem DNA-Syntheseautomaten durchgeführt werden, und das synthetische Gen kann dann in einen geeigneten Expressionsvektor ligiert werden. Die Verwendung eines degenerierten Gensatzes ermöglicht die Bereitstellung sämtlicher Sequenzen in einem Gemisch, die den gewünschten Satz an potentiellen Proteinsequenzen kodieren. Verfahren zur Synthese degenerierter Oligonukleotide sind dem Fachmann bekannt (z.B. Narang 1983; Itakura et al., 1984); Itakura et al. 1984; Ike et al. 1983).

Die erfindungsgemäße Verwendung ist insbesondere geeignet zum Hochdurchsatz-Screening von Proben (High Throughput Screening), beispielsweise dem Screening einer Vielzahl von Proben nacheinander in kurzer Zeit oder dem gleichzeitigen Screening mehrerer paralleler Proben oder einer Kombination daraus. Sie stellt somit insbesondere ein geeignetes Verfahren für das Screening der oben beschriebenen Genbanken dar. Beispielsweise können diese auf Klone gescreent werden, die eine besonders hohe funktionale Expression von Triacylglycerol-Lipasen zeigen, oder solche, die Triacylglycerol-Lipasen mit veränderten Eigenschaften exprimieren. In diesem Zusammenhang ist insbesondere die Verwendung von Mikrotiterplatten zur Expression eines oder mehrerer untersuchter Protein und/oder zur Bestimmung von dessen/deren Hydrolyseaktivität vorteilhaft. Wie dem Fachmann bekannt ist, kann dabei ein hoher Probendurchsatz durch Automatisierung erreicht werden, beispielsweise durch Pipettierroboter, welche Protein mit vermuteter Hydrolaseaktivität enthaltende Überstände aus den zur Expression dieser Proteine verwendeten Wells der Mikrotiterplatten in für den Nachweis der Hydrolyseaktivität bestimmte Wells überführen oder Nachweisreagenzien in die solche Überstände enthaltenden Wells pipettieren. Weiterhin kann die photometrische Auswertung bei Verwendung von Mikrotiterplatten insbesondere durch Ptattenlesegeräte erfolgen, welche automatisch die Extinktion der in den einzelnen Wells enthaltenen Lösungen messen. Bei Verwendung von Agarplatten kann der Nachweis von durch die Hydrolyseaktivität entstanden klaren Höfen oder anderweitig optisch nachweisbaren Höfen wie bereits oben beschrieben beispielsweise durch geeignete Bildverarbeitungssysteme (z.B. Quantimet 500 Qwin; Leica, Cambridge, Großbritannien) erfolgen.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer Triacylglycerol-Lipase (E.C. 3.1.1.3), wobei man über eines der oben beschriebenen Nachweisverfahren ein exprimiertes Protein mit Aktivität einer Triacylglycerol-Lipase (E.C. 3.1.1.3) nachweist, den dieses Protein exprimierenden Stamm unter Lipaseexprimierenden Bedingungen kultiviert und gegebenenfalls die exprimierte Lipase isoliert. Geeignete Isolierungsverfahren, die erforderlichenfalls durch Routineversuche für das jeweilige Protein angepasst werden können, sind dem Fachmann bekannt und beipielhaft unten beschrieben. Für den Fachmann ist es ersichtlich, dass das Verfahren analog angewendet werden kann für Lipasen, die in ihrer funktionalen Form eine oder mehrere S-S-Brücken benötigen, beispielsweise 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 S-S-Brücken pro Peptidkette, wobei die S-S-Brücken zwischen schwefelhaltigen Aminosäuren der gleichen Peptidkette (intramolekular) und/oder schwefelhaltigen Aminosäuren verschiedener Peptidketten (intermolekular) ausgebildet sein können.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft durch das oben beschriebene Herstellungsverfahren erhältliche Triacylglycerol-Lipasen, beispielsweise sich in der zellulären Umgebung des prokaryontischen Wirts befindliche Triacylglycerol-Lipasen oder teilweise, weitgehend oder vollständig aufgereinigte Triacylglycerol-Lipasen. Besonders geeignete Triacylglycerol-Lipasen sind Lipasen B aus Candida antarctica, die sich von der unter der Zugangsnummer CAA83122.1 bei GenBank hinterlegten Sequenz um wenigstens eine Aminosäure unterscheiden, sowie zur unter der GenBank-Zugangsnummer hinterlegten Sequenz CAA83122.1 homologe Proteine, die funktionale Äquivalente darstellen.

Unter „funktionalen Äquivalenten" versteht man erfindungsgemäß insbesondere Mutanten, welche sich in wenigstens einer Sequenzposition der Aminosäuresequenz einer zugrundegelegten Triacylgylcerol-Lipase, insbesondere einer beliebigen Lipase B, von dieser unterscheiden, aber trotzdem eine der oben genannten biologischen Aktivitäten besitzen, beispielsweise gleichbleibende, verringerte oder erhöhte Hydrolyseaktivität, oder veränderte Substratspezifität, Enantioselektivitat oder Wechselzahl sowie deren Abhängigkeit beispielsweise von Temperatur, pH, Ionenkonzentration, oder Anwesenheit möglicher Inhibitoren oder Aktivatoren.

„Funktionale Äquivalente" umfassen somit die durch eine oder mehrere Aminosäure-Additionen, -Substitutionen, -Deletionen und/oder -Inversionen erhältlichen Mutanten, wobei die genannten Veränderungen in jeglicher Sequenzposition auftreten können, solange sie zu einer Mutante mit dem erfindungsgemäßen Eigenschaftsprofil führen. Funktionale Äquivalenz ist insbesondere auch dann gegeben, wenn die Reaktivitätsmuster zwischen Mutante und unverändertem Polypeptid qualitativ übereinstimmen, d.h. beispielsweise gleiche Substrate mit unterschiedlicher Geschwindigkeit umgesetzt werden.

„Funktionale Äquivalente" im obigen Sinne sind auch „Präkursoren" der beschriebenen Polypeptide sowie „funktionale Derivate" und „Salze" der Polypeptide.

„Präkursoren" sind dabei natürliche oder synthetische Vorstufen der Polypeptide mit oder ohne der gewünschten biologischen Aktivität.

Unter dem Ausdruck „Salze" versteht man in diesem Zusammenhang sowohl Salze von Carboxylgruppen als auch Säureadditionssalze von Aminogruppen der erfindungsgemäßen Proteinmoleküle. Salze von Carboxylgruppen können in an sich bekannter Weise hergestellt werden und umfassen anorganische Salze, wie zum Beispiel Natrium-, Calcium-, Ammonium-, Eisen- und Zinksalze, sowie Salze mit organischen Basen, wie zum Beispiel Aminen, wie Triethanolamin, Arginin, Lysin, Piperidin und dergleichen. Säureadditionssalze, wie zum Beispiel Salze mit Mineralsäuren, wie Salzsäure oder Schwefelsäure und Salze mit organischen Säuren, wie Essigsäure und Oxalsäure sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung.

„Funktionale Derivate" erfindungsgemäßer Enzyme können an funktionalen Aminosäure-Seitengruppen oder an deren N- oder C-terminalen Ende mit Hilfe bekannter Techniken ebenfalls hergestellt werden. Derartige Derivate umfassen beispielsweise aliphatische Ester von Carbonsäuregruppen, Amide von Carbonsäuregruppen, erhältlich durch Umsetzung mit Ammoniak oder mit einem primären oder sekundären Amin; N-Acylderivate freier Aminogruppen, hergestellt durch Umsetzung mit Acylgruppen; oder O-Acylderivate freier Hydroxygruppen, hergestellt durch Umsetzung mit Acylgruppen.

"Funktionale Äquivalente" umfassen natürlich auch Polypeptide, welche aus anderen Organismen zugänglich sind, sowie natürlich vorkommende Varianten. Beispielsweise lassen sich durch Sequenzvergleich Bereiche homologer Sequenzregionen festlegen und in Anlehnung an die konkreten Vorgaben der Erfindung äquivalente Enzyme ermitteln.

„Funktionale Äquivalente" umfassen ebenfalls Fragmente, insbesondere einzelne Domänen oder Sequenzmotive, der erfindungsgemäßen Polypeptide, welche z.B. die gewünschte biologische Aktivität aufweisen.

„Funktionale Äquivalente" sind außerdem Fusionsproteine, welche eine der natürlichen Racemasesequenzen oder davon abgeleitete funktionale Äquivalente und wenigstens eine weitere, davon funktional verschiedene, heterologe Sequenz in funktionaler N- oder C-terminaler Verknüpfung (d.h. ohne gegenseitigen wesentliche funktionale Beeinträchtigung der Fusionsproteinteile) aufweisen. Nichtlimitierende Beispiele für derartige heterologe Sequenzen sind z.B. Signalpeptide oder Enzyme.

Erfindungsgemäß umfasste „funktionale Äquivalente" sind zu den natürlichen Proteinen homologe Proteine. Diese besitzen wenigstens 60%, vorzugsweise wenigstens 75%, insbesondere wenigstens 85%, wie z.B. wenigstens 90%, 95% oder 99%, Homologie zu einer der natürlichen Aminosäuresequenzen, berechnet nach dem Algorithmus von Pearson und Lipman (Pearson und Lipman 1988). Eine prozentuale Homologie eines erfindungsgemäßen homologen Polypeptids bedeutet insbesondere prozentuale Identität der Aminosäurereste bezogen auf die Gesamtlänge einer der Aminosäuresequenzen eines erfindungsgemäßen Enzyms oder einer Enzymuntereinheit. Die vorliegende Erfindung umfasst insbesondere funktionale Äquivalente gemäß den vorstehend genannten Definitionen, die zusätzlich eine Homologie von wenigstens 60%, vorzugsweise wenigstens 75%, insbesondere wenigstens 85%, wie z.B. wenigstens 90%, 95% oder 99%, zur Ausgangssequenz aufweisen.

Im Falle einer möglichen Proteinglykosylierung umfassen erfindungsgemäße „funktionale Äquivalente" Proteine des oben bezeichneten Typs in deglykosylierter bzw. glykosylierter Form sowie durch Veränderung des Glykosylierungsmusters erhältliche abgewandelte Formen.

Funktionale Äquivalente können unter Anwendung der erfindungsgemäßen Verfahren ermittelt werden. Beispielsweise können Proteine, deren funktionale Äquivalenz zu Triacylglycerol-Lipasen und insbesondere CalB bestimmt werden soll, über das erfindungsgemäße Expressionsverfahren exprimiert und das erfindungsgemäße Nachweisverfahren untersucht werden. Exprimierte Proteine, die Hydrolyseaktivität aufweisen, insbesondere veränderte Hydrolyseaktivität im Vergleich mit der Triacylglycerol-Lipase bzw. CalB, stellen funktionale Äquivalente dar.

In diesem Zusammenhang können erfindungsgemäße Triacylglycerol-Lipase exprimierende Prokaryonten nach bekannten Verfahren kultiviert und fermentiert werden. Die Zellen werden dann, falls die Polypeptide nicht in das Kulturmedium sezerniert werden, aufgeschlossen und das Produkt nach bekannten Proteinisolierungsverfahren aus dem Lysat gewonnen. Die Zellen können wahlweise durch hochfrequenten Ultraschall, durch hohen Druck, wie z.B. in einer French-Druckzelle, durch Osmolyse, durch Einwirkung von Detergenzien, lytischen Enzymen oder organischen Lösungsmitteln, durch Homogenisatoren oder durch Kombination mehrerer der aufgeführten Verfahren aufgeschlossen werden.

Eine Aufreinigung der Polypeptide kann mit bekannten, chromatographischen Verfahren erzielt werden, wie Molekularsieb-Chromatographie (Gelfiltration), wie Q-Sepharose-Chromatographie, Ionenaustausch-Chromatographie, Affinitätschromatographie und hydrophobe Chromatographie, sowie mit anderen üblichen Verfahren wie Ultrafiltration, Kristallisation, Aussalzen, Dialyse und nativer Gelelektrophorese. Geeignete Verfahren werden beispielsweise in Cooper (1980) oder in Scopes (1981) beschrieben.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft eine für Triacylglycerol-Lipase codierende Nukleinsäure, insbesondere eine für Lipase B aus Candida antarctica codierende Nukleinsäure, die eine codierende Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO:1 umfasst, oder eine sich von SEQ ID NO:2 um wenigstens ein Nukleotid unterscheidende Nukleotidsequenz umfasst, oder eine dazu homologe Nukleotidsequenz umfasst. Die vorstehend genannte Nukleotidsequenzen codieren beispielsweise ein funktionales Äquivalent von CalB. Gemäß einer speziellen Ausführungsform umfasst die Nukleinsäure eine codierende Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO:1 oder eine dazu homologe Nukleotidsequenz.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft einen rekombinanten Vektor, der eine für eine Triacylglycerol-Lipase codierende Nukleinsäure umfasst, welche mit wenigstens einer regulativen Nukleinsäuresequenz operativ verknüpft ist. Gemäß einer weiteren speziellen Ausführungsform umfasst die Triacylglycerol-Lipase codierende Nukleinsäuresequenz eine Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO:1 oder SEQ ID NO:2. Unter einer „operativen Verknüpfung" versteht man die sequentielle Anordnung von Promotor, kodierender Sequenz, Terminator und gegebenenfalls weiterer regulativer Elemente derart, dass jedes der regulativen Elemente seine Funktion bei der Expression der kodierenden Sequenz bestimmungsgemäß erfüllen kann. Beispiele für operativ verknüpfbare Sequenzen sind Targeting-Sequenzen sowie Enhancer, Polyadenylierungssignale und dergleichen. Weitere regulative Elemente umfassen selektierbare Marker, Amplifikationssignale, Replikationsursprünge und dergleichen. Geeignete regulatorische Sequenzen sind z.B. beschrieben in Goeddel 1990. Erfindungsgemäß wurde beispielsweise gefunden, dass insbesondere bei Co-Expression mit pGR07 calB_syn (SEQ ID NO:1) und calB_wt (SEQ ID NO:2) erhöht funktional exprimiert wurden.

Unter Vektoren sind außer Plasmiden und Phagen auch alle anderen dem Fachmann bekannten Vektoren, also z.B. Viren, wie SV40, CMV, Baculovirus und Adenovirus, Transposons, IS-Elemente, Phasmide, Cosmide, und lineare oder zirkuläre DNA zu verstehen. Diese Vektoren können autonom im Wirtsorganismus repliziert oder chromosomal repliziert werden. Diese Vektoren stellen eine weitere Ausgestaltung der Erfindung dar. Geeignete Plasmide sind beispielsweise in E. coli pLG338, pACYC184, pBR322,, pUC19, pKC30, pRep4, pHS1, pKK223-3, pDHE19.2, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, pIN-III113-B1, Igt11 oder pBdCl, in Streptomyces pIJ101, pIJ364, pIJ702 oder pIJ361, in Bacillus pUB110, pC194 oder pBD214, in Corynebacterium pSA77 oder pAJ667. Die genannten Plasmide stellen eine kleine Auswahl der möglichen Plasmide dar. Weitere Plasmide sind dem Fachmann wohl bekannt und können beispielsweise aus dem Buch Cloning Vectors (Hrsg. Pouwels P. H. et al. Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018) entnommen werden. Geeignete Vektoren sind solche, welche die funktionale Expression der für ein Protein mit Triacylgylcerol-Lipase-Aktivität codierenden Nukleotidsequenz ermöglichen, weiche wiederum durch das oben beschriebene Nachweisverfahren bestimmt werden kann.

Spezielle Ausführungsformen umfassen den Vektor pET32b(+) sowie die weiteren Vertreter der pET-Vektorfamilie (Novagen 1999), insbesondere pET-32a-c, pET-41a-c und pET-42a-c, und pCOLD III sowie weitere Vertreter der pCOLD-Vektorfamilie (zB. pCOLD I, pCOLD II, pCOLD IV, pCOLD TF, erhältlich beispielsweise von Takara Bio Europe S.A.S, Gennevilliers, Frankreich). Gemäß ganz besonderen Ausführungsformen werden als rekombinante Vektoren, die für eine Triacylglycerol-Lipase codierende Nukleinsäure umfassen, erfindungsgemäß bereitgestellt pET-32b(+)/calB_syn (SEQ ID NO:7, calB_syn in pET-32b(+)),

pET-32b(+)/calB_wt (SEQ ID NO:8, calB_wt in pET-32b(+)),

pCOLDIIIIcalB_syn (SEQ ID NO:9, calB_syn in pCOLDIII) und

pCOLDIII/calB_wt (SEQ ID NO:10, calB_wt in pCOLDIII).

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft eine rekombinante Wirtszelle, die einen solchen Vektor oder eine für Triacylglycerol-Lipase codierende Nukleinsäure, welche eine codierende Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO:1 oder eine dazu homologe Nukleotidsequenz umfasst. Die rekombinante Zelle kann insbesondere eine prokaryotische Zelle sein, insbesondere eine E.coli-Zelle. Weitere Beispiele für prokaryotische Zellen sind unter den gramnegativen Bakterien Vertreter der Enterobacteriaceae wie Salmonella, Shigella, Serratia, Proteus, Klebsiella oder Enterobacter, Pseudomonas, unter den grampositiven Bakterien beispielsweise Vertreter der Gattung Bacillus, z.B. B.subtilis und B.licheniformis.

Weitere Gegenstände der Erfindung betreffen die Verwendung erfindungsgemäßen codierenden Nukleinsäuresequenz, eines erfindungsgemäßen Vektors oder einer erfindungsgemäßen Wirtszelle zur Durchführung eines erfindungsgemäßen Verfahrens zur Expression einer funktionalen Triacylglycerol-Lipase, eines erfindungsgemäßen Verfahrens zum Nachweis einer funktionalen Triacylglycerol-Lipase, oder eines erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung einer funktionalen Triacylglycerol-Lipase. Es wurde gefunden, dass bei Verwendung der erfindungsgemäßen Vektoren in einem erfindungsgemäßen Expressionsverfahren, insbesondere bei niedrigen Inkubationstemperaturen, calB_wt und calB_syn überraschenderweise in pET-32b(+) (SEQ ID NO:8 bzw. SEQ ID NO:7) oder in pCOLDIII (SEQ ID NO:10 bzw. SEQ ID NO:9) in erhöhtem Maße funktional exprimiert wurden. Erfindungsgemäß wurde weiterhin gefunden, dass bei Co-Expression mit pG-KJE8 und insbesondere Co-Expression mit pGR07, pG-Tf2, oder pTf16 calB_syn (SEQ ID NO:1) und calB_wt (SEQ ID NO:2) in besonderem Maße erhöht funktional exprimiert wurden.

Für den Fachmann ist es ersichtlich, dass das erfindungsgemäße Verfahren zur Expression funktionaler Triacylglycerol-Lipasen, das Verfahren zu deren Nachweis und das Verfahren zu deren Herstellung auch auf weitere, von Triacylglycerol-Lipasen unterschiedliche Enzyme analog angewendet werden können. Beispielsweise können diese Verfahren auf Enzyme der EC-Klasse 3.1 (Ester-Hydrolasen) oder allgemein auf die der EC-Klasse 3 (Hydrolasen) adaptiert werden (http://www.iubmb.unibe.ch; http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/). Die erfindungsgemäßen Verfahren erstrecken sich dementsprechend auf alle Enzyme, die unter Verwendung der in diesen Verfahren offenbarten allgemeinen Prinzipien exprimiert, nachgewiesen oder hergestellt werden können, insbesondere solche Enzyme, für deren Funktionalität die Ausbildung einer oder mehrerer S-S-Brücken, beispielsweise 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 S_S-Brücken, erforderlich ist, wobei die S-S-Brücken zwischen schwefelhaltigen Aminosäuren der gleichen Peptidkette (intramolekular) und/oder schwefelhaltigen Aminosäuren verschiedener Peptidketten (intermolekular) ausgebildet sein können.

Beispiele I. Allgemeine Angaben Chemikalien

Soweit nicht anders angegeben, wurden alle Chemikalien von Fluka (Buchs, Schweiz), Sigma-Aldrich (Taufkirchen, Deutschland) und der Roth GmbH (Karlsruhe, Deutschland) bezogen.

Stämme und Plasmide

E. coli DH5&agr; wurde von Clontech (Heidelberg, Deutschland) bezogen. E. coli OrigamiTM2(DE3), OrigamiTM B und das Plasmid pET-32b(+) wurden von Novagen bezogen (Darmstadt, Deutschland). Das Plasmid pUC18 wurde von MBI Fermentas (St. Leon-Rot, Deutschland), pColdIII und das Chaperon-Plasmid Set, das die Plasmide pG-KJE8, pGro7, pKJe7, pG-Tf2 und pTf16 enthält, wurden von Takara (Otsu, Japan) bezogen. Das Konstrukt pPCR/calB, welches das Codon-optimierte calB-Gen enthielt, wurde von GENEART synthetisiert (Regensburg, Deutschland). Das Konstrukt pPICZ&agr;A/calB wurde früher beschrieben (Rusnak 2004).

Klonierung von calB-Varianten

calB_wt wurde aus dem Templat-Konstrukt pPICZ&agr;A/calB unter Verwendung der Primer wt_pUC18_fw und wt_UC18_rev (Tabelle 1) amplifiziert und anschließend in den Vektor pUC18 kloniert, wodurch das Konstrukt pUC18/calB_wt erhalten wurde. Für die Subklonierung in pET-32b(+) wurde das Lipasegen unter Vewendung der Primer wt_pET-32b(+)_fw und wt_pET32b(+)_rev (Tabelle 1, s. unten) amplifiziert und anschließend in den Vektor über die EcoR1- und NotI-Restriktionsschnittstellen kloniert (pET-32b(+)/calB_wt). Für die Subklonierung in pColdIII wurde CalB unter Verwendung der Primer wt_pColdIII_fw und wt_pColdIII_rev (Tabelle 1) amplifiziert und anschließend unter Verwendung von Standardverfahren in den Vektor kloniert (pColdIII/CalB_wt).

CalB_syn wurde aus pPCR/calB unter Verwendung der Primer syn_pUC18/pET-32b(+)_fw und syn_pUC18_rev, syn_pUC18lpET-32b(+)_fw und syn_pET-32b(+)_rev bzw. syn_pColdIII_fw und syn-pColdIII_rev (Tabelle 1) amplifiziert und anschließend in die Plasmide pUC18/calB_syn, pET-32b(+)/calB_syn und pColdIII/calB_syn kloniert, wobei Standardverfahren verwendet wurden, wodurch man die Konstrukte pUC18/calB_syn, pET-32b(+)/calB_syn und pColdIII/calB_syn erhielt.

Die nachfolgende Tabelle 1 zeigt die für die Subklonierung von calB-Varianten verwendeten Primer. Die Restriktionsschnittstellen sind unterstrichen.

Tabelle 1

Lipase-Expression und Co-Expression von Chaperonen

Expressionsexperimente wurden vier- bis sechsmal wiederholt und Aktivitäten als Mittelwerte angegeben.

pUC18-Expression:

OrigamiTM B und DH5&agr;-Zellen wurden mit pUC18-Konstrukten transformiert. Man ließ die Zellen bis zu einer optischen Dichte von 0,6 bei 600 nm bei 37°C und 180 U/min in 100 ml LB-Medium (Luria 1960) wachsen, das 100 &mgr;g/ml Ampicillin enthielt (LBamp). Anschließend wurde die Lipase-Expression durch Zugabe von IPTG induziert (Endkonzentration 1 mM). Man ließ die Zellen zusätzliche 4 Stunden bei 30°C und 180 U/min wachsen und erntete durch 30minütige Zentrifugation mit 4000 g bei 4°C.

pET-32b(+)-Expression:

OrigamiTM 2(DE3)-Zellen wurden mit pET32b(+)-Konstrukten transformiert. Man ließ die Zellen bei 37°C und 180 U/min bis zu einer optischen Dichte von 0,6 bei 600 nm in 100 ml LBamp wachsen und verarbeitete wie zuvor beschrieben. Alternativ wurden die Zellen vor der Induktion auf Eis gekühlt und die Expression 24 Stunden bei 15°C durchgeführt.

pColdIII-Expression:

OrigamiTM B-Zellen wurden mit pColdIII-Konstrukten transformiert. Man ließ die Zellen bei 37°C und 180 U/min bis zu einer optischen Dichte von 0,4-0,6 bei 600 nm in 100 ml LBamp wachsen. Anschließend kühlte man die Kulturen 30 min auf Eis und induzierte die Lipase-Expression durch Zugabe von IPTG (Endkonzentration 1 mM). Man ließ die Zellen weitere 24 Stunden bei 15°C und 180 U/min wachsen und erntete durch 30minütige Zentrifugation mit 4000 g bei 4°C.

Co-Expression von Chaperon-Plasmiden und pColdIII-Konstrukten:

OrigamiTM B-Zellen wurden mit Chaperon-Plasmiden transformiert. Man ließ die Zellen bei 37°C in 100 ml LB wachsen, das 34 &mgr;g/ml Chloramphenicol enthielt, und stellte über fachübliche Verfahren kompetente Zellen her. Die rekombinanten Zellen wurden mit den pColdIII-Konstrukten transformiert und auf LBcm+amp selektiert. Für die Expression ließ man die Zellen bei 37°C und 180 U/min bis zu einer optischen Dichte von 0,4-0,6 bei 600 nm in LBcm+amp wachsen, das (im Fall von pGro7, pKJE7 und pTf16) 1 mg/ml L-Arabinose und (im Fall von pG-Tf2) 5 ng/ml Tetracyclin oder (im Fall von pG-KJE8) L-Arabinose und Tetracyclin in den oben angegebenen Konzentrationen enthielt. Die Kulturen wurden 30 min auf Eis gekühlt. Anschließend wurde die Expression von Lipase durch Zugabe von IPTG (Endkonzentration 1 mM) induziert.

Man ließ die Zellen weitere 24 Stunden bei 15°C und 180 U/min wachsen und erntete durch 30minütige Zentrifugation mit 4000 g bei 4°C.

Tributyrin-Agarplatten-Assay

Zellen wurden auf LB-Agarplatten kultiviert, die 1% emulgiertes Tributyrin und die entsprechenden Antibiotika sowie 1 mg/ml L-Arabinose bei Co-Expression von pGro7, pKJE7 oder pTf16, 5 ng/ml Tetracyclin bei Co-Expression von pG-Tf2, oder L-Arabinose und Tetracyclin bei Co-Expression von pG-KJE8 enthielten. Nach 24-stündigem Wachstum der Zellen bei 37°C wurden die Platten mit Weichagar (0,6% Agar in Wasser) überschichtet, der 1 mM IPTG enthielt, und für die Expression bei 30°C, 15°C oder Raumtemperatur inkubiert. Die Expression funktionaler Lipase wurde durch die Bildung klarer Halos um die Kolonien angezeigt.

Lipase-Aktivitäts-Assay, SDS-PAGE und densitometrische Analyse

Man schloss die Zellen durch dreimalige Ultraschallbehandlung für eine Dauer von jeweils 30 sec in 50 mM Natriumphosphat-Puffer (pH 7,5) auf und entfernte Zelltrümmer durch Zentrifugation. Die Zell-Lysate wurden unter Verwendung der pH Stat-Vorrichtung (Metrohm, Filderstadt, Deutschland) auf Aktivität getestet. Die Hydrolyse des Substrats (5% Tributyrin, in Wasser mit 2% Gummi arabicum emulgiert) wurde durch Titration mit 10 mM NaOH überwacht. Der Proteingehalt des Zelllysats wurde über den Bradford-Assay gemessen (Bradford 1976). Eine Lipase-Aktivitätseinheit wurde definiert als Freisetzung von 1 &mgr;mol Fettsäure pro Minute.

Unlösliche und lösliche Fraktionen wurden über SDS-PAGE nach Standardverfahren (Laemmli 1970) untersucht, wobei 50 &mgr;g des geklärten Zelllysats (entsprechend 0,2-0,4 ml Zellkultur) bzw. unlösliche Zelltrümmer aus 0,5 ml Zellkultur verwendet wurden. Die Gele wurden mit Coomassie Brilliant Blue gefärbt. Der Prozentsatz an löslichem CalB bezogen auf das gesamte Zellprotein wurde densitometrisch unter Verwendung des Programms „Scion Image" (Frederick, Maryland, USA) ermittelt.

Hochdurchsatz-Expression und Aktivitäts-Assay

Man ließ pColdIII-Konstrukte und das Chaperon-Plasmid tragende OrigamiTM B-Zellen bis zu einer optischen Dichte von 0,4-0,6 bei 37°C und 400 U/min in einer 96-Well-Mikrotiterplatte (Greiner, Nürtingen, Deutschland) wachsen, die 150 &mgr;l LBcm+amp plus Chaperon-Induktor (siehe oben) enthielt. Die Zellen wurden 30 min auf Eis gekühlt und die Lipase-Expression durch Zugabe von IPTG auf eine Endkonzentration von 1 mM induziert. Nach 24-stündiger Expression bei 15°C und Schütteln mit 200 U/min wurden die Zellen durch Zentrifugation geerntet und durch Zugabe von 50 &mgr;l Lysepuffer (50 mM Natriumphosphat pH 7,5, 1 mg/ml Lysozym, 1 &mgr;l/DNAse) lysiert. Die Lysate wurden bei 37°C unter Schütteln (300 U/min) inkubiert und 30 min auf Eis gekühlt. Nach einstündiger Inkubation bei –80°C wurden die Zellen bei Raumtemperatur (RT) aufgetaut und Zelltrümmer durch 30-minütige Zentrifugation mit 4000 U/min bei 4°C entfernt.

Zum Nachweis von Lipaseaktivität gab man 20 &mgr;l geklärtes Zelllysat zu 180 &mgr;l Assay-Lösung (162 &mgr;l Lösung B (1 g Triton X-100 + 0,2 g Gummi arabicum in 200 ml 0,1 M Tris-HCl pH 7,5) + 18 &mgr;l Lösung A (60 mg pNPP in 20 ml n-Propanol). Die Bildung von p-Nitrophenolat wurde nach 5 min durch Messung der Extinktion bei 410 nm gemessen (Spectra Max 340PC, Molecular Devices Corp., Sunnyvale, CA, USA). Alternativ wurde die Lipase-Aktivität über den pH-Stat-Assay (wie oben beschrieben) quantifiziert.

II. Ausführungsbeispiele 1. Klonierung von calB aus Candida antarctica

calB_wt-Gen ohne die für die N-terminale Prä-Pro-Peptidsequenz codierende Nukleotidsequenz wurde in die E. coli-Expressions-Vektoren pUC18, pET-32b(+) bzw. pColdIII kloniert (Tabelle 2). Das pPICZ&agr;A/calB-Konstrukt (Rusnak 2004), welches das calB-Gen aus Candida antarctica enthielt, diente als Template für die Amplifizierung des Lipase-Gens.

Das calB-Gen wurde unter Verwendung der GeneOptimizerTM-Technologie optimiert. Dabei wurde zusätzlich zur Optimierung der Codon-Präferenz wurden Regionen mit sehr hohem (> 80%) oder niedrigem (< 30%) GC-Gehalt falls möglich vermieden. Darüber hinaus wurden cis-wirkende Sequenzmotive wie beispielsweise interne TATA-Boxen, Chi-Stellen, ribosomale Andockungsstellen, ARE-, INS- und CRS-Sequenzelemente ebenso wie repetitive Sequenzen und RNA-Sekundärstrukturen vermieden. Das optimierte Gen (calB_syn) unterscheidet sich in 253 Nukleotiden (26,5%) von der calB_wt-Sequenz, die vorgenommenen Änderungen sind in 1 gezeigt. Auf Aminosäure-Ebene kodiert das synthetische Gen das veröffentlichte Protein (CAA83122.1). Anschließend wurde das synthetische Gen in die in Tabelle 2 erwähnten Expressionsvektoren subkloniert.

Tabelle 2 Tabelle 2: Verwendete Plasmide und Stämme. Pro: Promotor, Ori: Replikationsursprung

2. Lipase-Expression in drei unterschiedlichen Vektor-Systemen

Für die Expression von calB codierenden Vektoren wurden die Stämme E. coli OrigamiTM B und OrigamiTM 2(DE3) verwendet, die durch ihre Thioredoxin-Reduktase- und Glutathion-Reduktase-Defizienz charakterisiert sind. pUC18/calB_wt-transformierte OrigamiTM B-Zellen zeigten Halo-Bildung auf Tributyrin-Agarplatten, während dies beim Vergleichsstamm DH5&agr; nicht der Fall war (Daten nicht gezeigt). Jedoch war die CalB-Aktivität in den mit pUC18/calB_wt oder pUC18/calB_syn transformierten OrigamiTM B-Zellen sehr niedrig und entsprach für beide Konstrukte einer Hydrolyse von nur etwa 2 U Tributyrin pro Milligramm gesamtes lösliches Protein (4). 1 U (Unit) ist definiert als der Umsatz von 1 &mgr;Mol Substrat pro Minute. In einer SDS-PAGE-Analyse wurde in der löslichen Fraktion keine Proteinbande nachgewiesen, die der Masse von CalB (33 kD) entsprach (Daten nicht gezeigt), während der CalB-Gehalt der unlöslichen Fraktion 10-12% betrug (Tabelle 3).

Tabelle 3 Tabelle 3: Densitometrische Analyse des CalB-Gehalts in Zellextrakten aus verschiedenen Expressionsexperimenten. Für die Auswertung des Coomassie Bluegefärbten SDS-PAGE-Gele wurde das Program Scion Image verwendet. N.d.: nicht nachweisbar.

Zur Erhöhung der Ausbeute an aktivem Enzym wurden die Gene calB_wt und calB_syn unter Verwendung des Vektors pET-32b(+) mit einem Thioredoxin-Tag (Trx •TAGTM) fusioniert und in E.coli OrigamiTM2 (DE3) exprimiert. Die transformierten Zellen zeigten bei Inkubation bei Raumtemperatur eine klare Halo-Bildung, während eine Kultivierung bei 37°C zu keiner nachweisbaren Enzymaktivität führte. Während die Expression von Trx-CalB in Schüttelkolbenkultur bei 30°C zu einem starken Anstieg der Enzymmenge in der unlöslichen Fraktion führte (18-19%, Tabelle 3), nicht dagegen jedoch zu einem Anstieg der Löslichkeit und damit der Aktivität von CalB, ergab eine Expression bei 15°C bis zu 17 U/mg lösliches Protein beim wt-Gen (calB_wt) und 8 U/mg beim synthetischen Gen (calB_syn) (4). In diesem System wurde weiterhin eine Halo-Bildung auf Tributyrin-Agarplatten nur bei niedrigen Kultivierungstemperaturen beobachtet. Trotzdem wurde durch SDS-PAGE eine hohe Menge an unlöslichem Protein bei Expression aus pET-32b(+) (24% bzw. 26%) und aus pColdIII (42% bzw. 38%) nachgewiesen, selbst bei Expression bei 15°C (2, Tabelle 3).

3. Lipase-Expression mit Co-Expression molekularer Chaperone

Die pColdIII-Konstrukte gemäß Ausführungsbeispiel 2 wurden mit mehreren Kombinationen aus Chaperonen co-exprimiert, die im TaKaRa Chaperone Plasmid Set bereitgestellt werden (s. nachfolgende Tabelle 4).

Tabelle 4 Tabelle 4: Bestandteile des verwendeten Chaperon Plasmid Sets von TaKaRa

Alle rekombinanten OrigamiTM B-Zellen, die sowohl CalB- als auch Chaperon-Expressionsplasmide trugen, zeigten bei einer Inkubationstemperatur von 15°C eine klare Halo-Bildung auf Tributyrin-Agarplatten und Expression von CalB im Schüttelkolbenmaßstab (3), während sich die Menge von löslicher Lipase deutlich unterschied (4). CalB_wt wurde am effizientesten bei Expression zusammen mit pGro7 (61 U/mg) exprimiert (4). Die Expression von funktionalem Enzym wurde auch durch Expression zusammen mit pG-Tf2 (33 U/mg), pTf16 (24 U/mg) und, in geringerem Ausmaß, durch Expression zusammen mit pG-KJES (18 U/mg) gesteigert. Co-Expression zusammen mit pKJE7 beeinflusste die Expression von CalB nicht signifikant. Die Ergebnisse des Aktivitäts-Assay wurden densitometrisch bestätigt, wobei die größte Menge an löslichem CalB bei Co-Expression mit pGro7 gefunden wurde, gefolgt von Co-Expression mit pG-Tf2 und pTf16 (Tabelle 3).

Ähnliche Ergebnisse wurden mit dem synthetischen calB-Gen erhalten, wodurch ein positiver Einfluss der Co-Expression von pGro7, pG-Tf2, pTf16 und pG-KJE8 gezeigt wurde. Wie bei der pET-32b(+)- und der pColdIII-Expression waren die erhaltenen Werte für Lipase-Aktivitäten und Gehalt an löslichem Enzym beim synthetischen Gen calB_syn niedriger als beim Wildtyp-Gen calB_wt (4, Tabelle 3).

4. Lipase-Expression auf Tributyrin-Agarplatten

GroES und GroEL (durch pGro7 kodiert) und CalB_wt bzw. CalB_syn exprimierende OrigamiTM B-Zellen zeigten bei Inkubation bei 15°C eine klare Halo-Bildung auf Tributyrin-supplementierten Agarplatten. Weder bei DH5&agr;-Zellen, welche die gleichen Konstrukte enthielten, noch bei OrigamiTM B-Kontrollzellen, dis pGro7-Vektor und pColdIII-Vektor ohne das Lipase-Gen enthielten, war Halo-Bildung zu beobachten (Daten nicht gezeigt).

5. Lipase-Expression im Mikrotiterplatten-Maßstab

Als Modell für ein Hochdurchsatz-Screening-System für von CalB abgeleitete Enzymvarianten wurde die Co-Expression von CalB_wt oder CalB_syn mit pGro7 in OrigamiTM B-Zellen in einem 96-Well-Mikrotiterplatten-Maßstab durchgeführt. Die Aktivitäten der geklärten Zelllysate wurden über einen kolorimetrischen Assay unter Verwendung von pNPP als Substrat quantifiziert. Wie durch die Bildung von gelbem p-Nitrophenolat gezeigt wurde (6), wurden beide Konstrukte in vergleichbaren Mengen funktional exprimiert. Kontrollzellen ohne das Lipase-Gen zeigten signifikant verringerte Extinktionswerte bei 410 nm.

Zum Vergleich der Aktivitäten bei Expression in Mikrotiterplatten mit den Werten, die bei Co-Expression der Konstrukte pColdIII/calB_wt and pGro7 in Schüttelkolben erhalten wurden, wurden die Aktivitäten von 5 repräsentativen Wells mit dem Substrat Tributyrin über den pH-Stat-Assay untersucht. Die Wachstumsbedingungen in den einzelnen Wells waren identisch. Als Ergebnis wurden spezifische Aktivitäten von 57 bis 81 U/mg lösliches Protein im geklärten Zelllysat bzw. Gesamtaktivitäten von 10 bis 15 U/ml Zellkultur ermittelt. Der Expressionsgrad an Gesamt-Lipase in den Wells wurde über densitometrische Analyse als 0,04 ± 0,01 &mgr;g CalB/ml Zellkultur bestimmt.

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Folgende Sequenzen bzw. Plasmide, auf die in der vorangegangenen Beschreibung Bezug genommen wurde, sind im nachfolgenden Sequenzprotokoll unter den angegebenen SEQ ID NOs erfasst:

calB_syn: SEQ ID NO:1

calB_wt: SEQ ID NO:2

Promotor von T7: SEQ ID NO:3

cspA Promotor (E.coli): SEQ ID NO:4

calB_syn in pUC19 (pUC18/calB_syn): SEQ ID NO:5

calB_wt in pUC19 (pUC18/calB_swt): SEQ ID NO:6

calB_syn in pET-32b(+) (pET-32b(+)/calB_syn): SEQ ID NO:7

calB_wt in pET-32b(+) (pET-32b(+)/calB_wt): SEQ ID NO:8

calB_syn in pCOLDIII (pCOLDIII/calB_syn): SEQ ID NO:9

calB_wt in pCOLDIII (pCOLDIII/calB_wt): SEQ ID NO:10

pPCR/calB: SEQ ID NO:11

CalB (CAA83122.1): SEQ ID NO:12

CalB mit Austausch T57A und A89T: SEQ ID NO:13

Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.


Anspruch[de]
Verfahren zur Expression funktionaler Triacylglycerol-Lipase (E.C. 3.1.1.3) in Prokaryoten, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Triacylglycerol-Lipase codierende Nukleotidsequenz unter der Kontrolle eines induzierbaren Promotors in einer prokaryotischen Wirtszelle exprimiert. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Expression der Triacylglycerol-Lipase bei einer niedrigen Temperaturen erfolgt. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die niedrige Temperatur ausgewählt ist aus einem Bereich von 1°C bis 25°C. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Expression in einem Thioredoxin-Reduktase-defizienten und Glutathion-Reduktase-defizienten E.coli-Stamm erfolgt. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Triacylglycerol-Lipase codierende Nukleotidsequenz eine Lipase B aus Candida antarctica (calB) codiert. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Lipase B durch eine Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO:1 (calB_syn) oder SEQ ID NO:2 (calB_wt) oder durch eine dazu homologe Nukleotidsequenz codiert wird. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Triacylglycerol-Lipase codierende Nukleotidsequenz unter der Kontrolle des Promotors von T7 (SEQ ID NO:3) steht. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Triacylglycerol-Lipase codierende Nukleotidsequenz unter der Kontrolle eines durch Kälteschock induzierbaren Promotors steht. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass der durch Kälte induzierbare Promotor der Promotor des cspA-Gens von E.coli (SEQ ID NO:4) ist. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass ein oder mehrere Chaperone co-exprimiert werden. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass das co-exprimierte Chaperon ausgewählt ist bzw. die co-exprimierten Chaperone ausgewählt sind unter GroES, GroEL, DnaK, DnaJ, GrpE und Trigger Factor (TF) von E.coli. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass GroEL und GroES co-exprimiert werden. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass DnaK, DnaJ und GrpE co-exprimiert werden. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass Trigger Factor, gegebenenfalls zusammen mit GroES und GroEL, co-exprimiert wird. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass DnaK, DnaJ, GrpE, GroES und GroEL co-exprimiert werden. Verfahren zum Nachweis von Triacylglycerol-Lipasen, wobei man

i) ein Protein, für das man Triacylglycerol-Lipase-Aktivität vermutet, gemäß einem der Verfahren 1 bis 15 exprimiert,

ii) die Expressionsprodukt mit einem von Triacylglycerol-Lipase hydrolysierbaren Substrat in Kontakt bringt, und

iii) die Hydrolyseaktivität bestimmt.
Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Expression des Proteins und/oder die Bestimmung von dessen Hydrolyseaktivität auf einer Mikrotiterplatte erfolgt. Verfahren nach Anspruch 16 oder 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Expression des Proteins gemäß Schritt i) in Gegenwart eines von der Lipase hydrolysierbaren Substrats erfolgt. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Expression des Proteins auf einem Nährboden erfolgt, der ein von der Lipase hydrolysierbares Substrat enthält. Verfahren nach Anspruch 16 oder 17, dadurch gekennzeichnet, dass

i) das exprimierte Protein aus der Zellkultur abgetrennt wird,

ii) mit einem von einer Triacylglycerol-Lipase hydrolysierbaren Substrat in Kontakt gebracht wird, und

iii) die Hydrolyseaktivität bestimmt wird.
Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Hydrolyseaktivität durch die Abnahme des hydrolysierbaren Substrats oder die Zunahme des Hydrolyseprodukts photometrisch bestimmt wird. Verwendung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 16 bis 21 zum Screenen mutagenisierter Proteine oder durch mutagenisierte Nukleinsäuren codierter Proteine auf Triacylglycerol-Lipase-Aktivität. Verwendung nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein wenigstens eine Mutation in der codierende Nukleotidsequenz einer Lipase B aus Candida antarctica (calB) aufweist. Verfahren oder Verwendung nach einem der Ansprüche 16 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren zum Nachweis von Triacylglycerol-Lipasen als Hochdurchsatz-Screening-Verfahren durchgeführt wird. Verfahren zur Herstellung einer Triacylglycerol-Lipase (E.C. 3.1.1.3), dadurch gekennzeichnet, dass man ein mit Hilfe eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 16 bis 24 ein exprimiertes Protein mit Aktivität einer Triacylglycerol-Lipase (E.C. 3.1.1.3) nachweist, den dieses Protein exprimierenden E.coli-Stamm unter Lipase-exprimierenden Bedingungen kultiviert und gegebenenfalls die exprimierte Lipase isoliert. Triacylglycerol-Lipase, erhältlich durch ein Verfahren gemäß Anspruch 25. Für Triacylglycerol-Lipase codierende Nukleinsäure, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine codierende Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO:1 umfasst, oder eine sich von SEQ ID NO:2 um wenigstens ein Nukleotid unterscheidende Nukleotidsequenz umfasst, oder eine dazu jeweils homologe Nukleotidsequenz umfasst. Rekombinanter Vektor, dadurch gekennzeichnet, dass er eine codierende Nukleinsäure gemäß Anspruch 27 operativ verknüpft mit wenigstens einer regulativen Nukleinsäuresequenz umfasst. Rekombinante Wirtszelle, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Nukleinsäure gemäß Anspruch 27 und/oder einen rekombinanten Vektor gemäß Anspruch 28 umfasst. Verwendung einer codierenden Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 27, eines Vektors nach Anspruch 28 oder einer Wirtszelle nach Anspruch 29 zur Durchführung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 25.






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