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Dokumentenidentifikation DE202007007706U1 25.10.2007
Titel Messvorrichtung zum quantitativen fotometrischen Nachweis von Biomolekülen im Low Density Bereich (Low-Density-Biochips)
Anmelder FILT Lungen- und Thoraxdiagnostik GmbH, 13125 Berlin, DE
Vertreter Kietzmann, Vosseberg, Röhnicke Patentanwälte Rechtsanwalt Partnerschaft, 10117 Berlin
DE-Aktenzeichen 202007007706
Date of advertisement in the Patentblatt (Patent Gazette) 25.10.2007
Registration date 20.09.2007
Application date from patent application 30.05.2007
IPC-Hauptklasse G01N 35/08(2006.01)A, F, I, 20070530, B, H, DE
IPC-Nebenklasse G01N 33/52(2006.01)A, L, I, 20070530, B, H, DE   G01N 33/483(2006.01)A, L, I, 20070530, B, H, DE   B01L 3/00(2006.01)A, L, I, 20070530, B, H, DE   

Beschreibung[de]

Die Erfindung betrifft eine Messvorrichtung mit einer Einweg-Messkassette zum automatisierten quantitativen fotometrischen Nachweis von Biomolekülen im Low Density Bereich.

Aus der Patentschrift DE 101 48 102 B4 ist ein Biochip zum fotometrischen, pixelorientierten quantitativen Nachweis von Biomolekülen bekannt, der 2–8 mm2 große Reaktionsareale (Spots) auf der Glasoberfläche eines handelsüblichen Glasobjektträgers aufweist. Die Spots sind derart funktionalisiert, dass der Biochip als Assay unter Verwendung eines Enzym-markierten Biomoleküls (Sonde) einsetzbar ist. Der Umsatz des eingesetzten Farbsubstrats wird bewertet, indem die Farbpunkte auf den Spots sowohl in optischer Dichte als auch in relativer Anzahl pro Spot erfaßt werden. Die Farbintensität der Farben Rot, Grün und Blau (RGB) aller Pixel wird mittels eines Durchlichtscanners vermessen und bewertet.

Aus der Gebrauchsmusterschrift DE 20 2005 006 854 U1 ist ein Low Density Biochip bekannt, der aus durchsichtigem Kunststoff gebildet ist und die Größe eines Objektträgers aufweist.

Nachteilig an den bekannten Biochips ist, dass diese manuell mit der Probe beladen, gespült und mit der farbreaktiven Markerlösung versetzt werden müssen. Die Handhabung unterliegt somit dem individuellen Vorgehen des Laboranten, wodurch nur Messergebnisse aus der Hand eines Laboranten als vergleichbar angesehen werden können, zudem selbst bei routiniert ausgeführter Arbeit mit nahezu identischen Handgriffen und Zeitmanagement Ungenauigkeiten durch Pipettierfehler und Raumbedingungen auftreten.

Ferner sind die Reaktionsoberflächen der bekannten Biochips ungeschützt gegenüber äußeren mechanischen und chemischen Einflüssen wie Berührungen durch Finger oder Laborgeräte sowie durch in der Luft enthaltene Verbindungen oder Partikel, die ebenfalls zu einer Verfälschung und Ungenauigkeit der Messergebnisse führen.

Die gewonnen Messergebnisse sind daher nur mit entsprechend hoher Fehlerrate vergleichbar.

Ein weiterer Nachteil der bekannten Biochips ist, dass nur ein Biomolekül pro Chip nachgewiesen werden kann.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, Nachweise von Biomolekülen mittels Low Density Biochips auf der Basis fotometrischer, pixelorientierter quantitativer Erfassung von Messergebnissen zu automatisieren und die Reproduzierbarkeit und Genauigkeit der Nachweise zu erhöhen.

Die Aufgabe wird durch eine Messvorrichtung zum automatisierten quantitativen fotometrischen Nachweis von Biomolekülen im Low Density Bereich gelöst, die eine Nachweisreaktionsführungseinheit mit einem oder mehreren Behältern für Hilfslösungen und einen Behälter zur Aufnahme von Abfalllösungen sowie Zu- und Ableitungen zu den Behältern, eine Messeinheit mit einem Mittel zur fotometrischen, pixelorientierten Erfassung einer Farbreaktion einer Reaktionslösung mit einem zu detektierenden Biomolekül, eine computergestützt arbeitende Auswerteeinheit zur Auswertung der Messergebnisse und eine Messkassette enthaltend einen Low Density Biochip mit einem mit funktionalisierten Reaktionsarealen versehenen Glas- oder Kunststoffträger aufweist. In der Reaktionsführungseinheit ist mindestens ein Aufnahmebereich zur passgenauen Aufnahme einer Messkassette eingerichtet, die über Anschlüsse für die Zu- und Ableitungen der Behälter für Hilfslösungen verfügt. An der Messkassette selbst sind zu den Anschlüssen im Aufnahmebereich korrespondierende Anschlüsse eingerichtet, wobei die zueinander korrespondierenden Anschlüsse nach dem Einlegen der Messkassette eine lösbare dichte Verbindung eingehen. Mindestens das Beladen und Spülen der Messkassette mit Reaktions- und Hilfslösungen, die Reaktionsführung sowie die Auswertung der Farbreaktion erfolgt prozessorgesteuert und vorzugsweise vollautomatisch.

Die Hilfslösungen können je nach Assay aus einem Puffer beispielsweise einer Elektrolytlösung mit einem bestimmten pH-Wert sein, welcher in einer besonderen Ausführungsform Eiweisse, Detergenzien (z.B. Tween) zugesetzt sind.

Die Nachweisreaktionsführungseinheit dient zur Steuerung und Regelung und der Durchführung der Nachweisreaktion auf dem Low Density Biochips. Hierzu wird eine Messkassette enthaltend einen Low Density Biochip in eine hierfür vorgesehenen Aufnahmebereich, der vorzugsweise als Einschubfach ausgebildet ist, eingeführt. Hierbei werden die korrespondierenden Anschlüsse an der Messkassette und an der Nachweisreaktionsführungseinheit miteinander verbunden. Vorzugsweise handelt es sich hierbei um Anschlüsse der Art „male" und „female", die passformgerecht ineinandersteckbar sind. In einer besonderen Ausführungsform weist die Messkassette in den Anschlüssen ein Septum auf. Die Anschlüsse an der Nachweisreaktionsführungseinheit sind dagegen mit einer Kanüle oder holen Anstechnadel ausgestattet, so dass beim Einlegen der Messkassette und dem gleichzeitigen Verbinden der Anschlüsse die Septen von den Kanülen oder holen Anstechnadeln durchstochen werden. Die Einrichtung von mit Septen versehenen Anschlüssen an der Messkassette hat den Vorteil, die Messkassette vor der Verwendung staub- und feuchtigkeitsdicht lagern zu können. Weiter garantieren sie den erneuten Verschluss bzw. eine Abdichtung bei Entnahme der Kassette aus der Nachweisreaktionsführungseinheit.

Die Messkassette ist mit einer Pumpe, vorzugsweise einer oszillierenden Membran- oder Ballon-Pumpe ausgestattet, die durch einen Antrieb, der in der Nachweisreaktionsführungseinheit eingerichtet ist, angetrieben wird. Diese Pumpe dient sowohl der Homogenisierung und gleichmäßigen Verteilung der Probe, der Hilfslösungen als auch der Farbreagenz in der Messkammer der Messkassette. Der Antrieb, beispielsweise ein Elektromotor, der Membranpumpe ist derart in der Nachweisreaktionsführungseinheit eingerichtet, dass beim Einlegen der Messkassette der Antrieb mit der Pumpeinrichtung in der Kassette gekoppelt wird, vorzugsweise mit einem Stößel oder einer Pleuelstange in einen in der Messkassette eingerichteten Führungskanal zur Führung des Stößels oder der Pleuelstange eingreift, wobei der Stößel oder die Pleuelstange an der Membran der Pumpe endet. Bei Antrieb wird die Membran durch den Stößel oder die Pleuelstange oszillierend auf und niederbewegt und bewirkt so eine Durchmischung in der an die Pumpe anschließenden Messkammer. Die Nachweisreaktionsführungseinheit selbst ist mit Pumpen zur Förderung von Hilfslösungen aus den Vorratsbehältern in die Messkassette und zum Absaugen von Probe, Hilfslösungen oder Farbreagenz aus der Messkassette in einen entsprechenden Auffangbehälter ausgestattet.

In der Nachweisreaktionsführungseinheit sind vorzugsweise mehrere Aufnahmebereiche zur Aufnahme von Messkassetten vorgesehen. Jede Nachweisreaktion kann separat und unabhängig von parallel laufenden Nachweisreaktionen in weiteren Messkassetten durch die Auswerteeinheit gesteuert werden. Vorteilhaft hieran ist, dass mehrere Nachweisreaktionen gleichzeitig durchgeführt werden können.

In einer besonderen Ausführungsform ist die Nachweisreaktionsführungseinheit temperier- und klimatisierbar, so dass die Nachweisreaktion unter optimalen Reaktionsbedingungen ablaufen kann. Die Reaktionsbedingungen sind im Nachweisprogramm gespeichert oder separat manuell einstellbar. Vorzugsweise ist jeder Aufnahmebereich für eine Messkassette separat temperier- und klimatisierbar.

Die Messeinheit dient der fotometrischen, pixelorientierten Erfassung einer Farbreaktion einer Reaktionslösung mit einem zu detektierenden Biomolekül. Der Low Density Biochip der Messkassette ist ein Biochip mit vorzugsweise 2–8 mm2 große Reaktionsareale (Spots), die auf der Glasoberfläche eines handelsüblichen Glas- oder Kunststoffobjektträgers aufgebracht sind. Die Spots sind derart funktionalisiert, dass der Biochip als Assay unter Verwendung eines markierten Biomoleküls (Sonde) einsetzbar ist. Der Umsatz des eingesetzten Farbsubstrats wird bewertet, indem die Farbpunkte auf den Spots sowohl in optischer Dichte als auch in relativer Anzahl pro Spot erfaßt werden. Zur Detektion der Farbintensität der Farben Rot, Grün und Blau (RGB) aller Pixel ist die Messeinheit vorzugsweise mit einer CCD-Kamera, einer Kamera mit CMOS-Technologie oder einem Scanner mit Streulicht zur Erzeugung von Daten in Dateiformaten für Rastergrafiken ausgestattet. Die Aufzählung ist nicht abschließend zu betrachten. Grundsätzlich ist jede Kameratechnologie einsetzbar, mit welcher Farbintensitäten auswertbar aufgezeichnet werden kann. Nach Ende der Nachweisreaktion wird die Messkassette der Nachweisreaktionsführungseinheit entnommen und in die Messeinheit eingeführt, wobei diese über eine entsprechende Halterung zur Aufnahme der Messkassette verfügt. In einer besonderen Ausführungsform kann die Messeinheit auch in die Nachweisreaktionsführungseinheit integriert sein, so dass die Messung der Spots direkt nach Beendigung der Nachweisreaktion erfolgen kann, ohne dass die Messkassette der Messeinheit separat zugeführt werden muss. Die Erfassung der Farbintensitäten der einzelnen Spots erfolgt mittels Beleuchtung der Messkammer von unten und Aufnahme eines Bildes mit dem Scanner oder der CCD-Kamera von oben. Das Bildformat ist ein Dateiformat für Rastergrafiken, vorzugsweise ein Tif-Format oder bmp-Format.

Die CCD-Kamera ist vorzugsweise eine 12 Bit CCD-Kamera. Hiermit können 1024 Farbwerte pro Farbe erzeugt werden. Mit handelsüblichen 8 Bit CCD-Kameras sind hingegen nur 256 Farbwerte pro Farbe darstellbar. Durch die hohe Anzahl an Farbwerten bei einer 12 Bit CCD-Kamera wird eine wesentlich höhere Empfindlichkeit gegenüber Scannern oder 8 Bit CCD-Kameras erreicht. Bei der Auswertung der Farbintensitäten der Spots, die von der Anzahl gebundener Biomoleküle pro Spot abhängt, führt die Verwendung einer 12 Bit CCD-Kamera zu einer höheren Genauigkeit der Messergebnisse bei gleichzeitigem Absenken der Nachweisgrenze. Bei einer Farbintensität eines Spots von 0 % sind keine Biomoleküle an den Bindungsstellen gebunden, hingegen sind bei einer Farbintensität von 100 % alle Bindungsstellen belegt. Die 12 Bit CCD-Kamera ermöglicht nun eine 4-fach höhere Stufenzahl (eine Stufen ist die kleinste Einheit, der eine Konzentration der in der Probe enthaltenen Biomoleküle zugeordnet werden kann) als gegenüber einer 8 Bit CCD-Kamera. Die Stufen hier liegen bei ca. 0,5 % auf der Farbintensitätswerteskala. Die 8 Bit CCD-Kamera kann maximal Stufenabstände von 3 % der Farbintensitätswerte darstellen. Dies macht den Vorteil und die höhere Messgenauigkeit einer 12 Bit CCD-Kamera deutlich. Hieraus resultiert, dass Proben kleinster Volumina auswertbar werden. Entsprechend sinkt die Nachweisgrenze nach unten, so dass auch geringe Konzentrationen des Biomoleküls in der Probe nachgewiesen werden können. Auch kann die Größe der Spots verringert und so eine deutlich höhere Anzahl an Spots auf dem Biochip platziert werden, als der Stand der Technik angibt.

Gleichzeitig werden mit der Kamera softwaregesteuert Nullpunktswerte aufgenommen. Hierzu werden um jeden Spot vorzugsweise bis zu vier Farbwerte ermittelt, die im Mittelwert einer Farbintensität von 0 % entsprechen, eine sogenannte „Shading-Korrektur". Diese Bereiche liegen außerhalb des zu messenden Spots. Diese vier Nullpunktswerte werden für jeden Spot einzeln bestimmt und bei der Berechnung der Farbintensität des zugehörigen Spots zu Grunde gelegt. Hierdurch können Fehler oder Abweichungen in der Beleuchtung der Messkassette herausgerechnet werden. Darüber hinaus können Spots, die nur teilweise belegt sind, sei es durch lückenhafte Belegung des Spots mit Bindungsstellen oder durch unzulängliche Benetzung mit der Farbreagenz, mit in die Auswertung einbezogen werden, da Farbbereiche mit 0 % Farbintensität herausgerechnet und nicht in die Mittelwertsberechnung der Farbwerteberechnung des Spots einbezogen werden.

Die Erfassung der Farbintensitätswerte erfolgt auf Basis von Bayerfilter-Werten, mit welchem unverfälschte Farbwerte ermittelt werden können.

Das von der CCD-Kamera aufgenommene digitale Bild wird anschließend an die Auswerteinheit übermittelt, wo dieses auf einem Bildschirm darstellbar ist. Die Auswertung der Farbintensitäten sowie die Zuordnung zu bestimmten Konzentrationen des Biomoleküls erfolgt softwaregestützt. In der Auswerteeinheit sind vorzugsweise Farbreferenzwerte als Kalibrier- oder Eichungswerte gespeichert. Auch können Kalibrier- und Eichungswerte mittels einer zweiten Messkassette, die eine entsprechende Konditionierung der Spots aufweist, eingelesen und die Werte zur Grundlage nachfolgender Nachweisreaktionen herangezogen werden. In einer bevorzugten Ausführungsform können manuell Spots aus der Berechnung, beispielsweise aufgrund fehlerhafter Belegung, Kratzer oder Defekte in der Messkassette herausgenommen werden. Hierzu werden diese Spots über die Auswertesoftware markiert. Zusätzlich ist vorgesehen, bestimmte Spots eines Biochips als Referenzfarbwerte zu definieren.

Die Messvorrichtung besteht somit aus vier Einzelkomponenten, die in einem Gehäuse integriert sein können oder auch als separate Komponenten, sogenannte Stand-Alone-Komponenten, verbunden über Datenübertragungsleitungen gefertigt sein können.

Die computergestützte Auswerteeinheit verfügt über Steuer- und Regeleinheiten zur Steuerung und Regelung sowohl der Nachweisreaktionsführungseinheit als auch der Messeinheit, wobei es sich insbesondere um einen PC oder MAC handelt. In der computergestützte Auswerteeinheit ist eine Speichereinheit eingerichtet, in der Farbreferenzwerte und/oder Nullwerte zur Auswertung der Messergebnisse gespeichert und abrufbar sind. Darüber hinaus sind in der Speichereinheit der computergestützten Auswerteeinheit Programme zur Steuerung der Nachweisreaktionsführungseinheit für definierte Nachweisreaktionen verschiedenartig konditionierter Low Density Biochips zum Nachweis unterschiedlicher Biomoleküle gespeichert und abrufbar. Zusätzlich kann ein Bedienpaneel zur Eingabe und/oder Starten von Programmen zur Steuerung definierter Nachweisreaktionen und eine Ausgabe- und/oder Anzeigeeinheit für Messergebnisse eingerichtet sein.

Die Nachweisreaktionsführungseinheit kann im Aufnahmebereich zur passgenauen Aufnahme einer Messkassette mit einer Lese- und/oder Entschlüsselungseinheit von auf der Messkassette gespeicherten codierten Informationen ausgestattet sein.

Ebenso kann die Messkassette mit einer Speichereinheit und Ausleseeinheit enthaltend codierte Information, vorzugsweise eine oder mehrere Informationen ausgewählt aus der Gruppe „Art und Konditionierung des Biochips, Nachweisreaktion, Chargennummer, Programm zur Steuerung der Nachweisreaktion, gebrauchte Messkassette, neue Messkassette, Sicherheitscode", ausgestattet sein.

Die Lese- und/oder Entschlüsselungseinheit der Nachweisreaktionsführungseinheit und die Speichereinheit und Ausleseeinheit der Messkassette sind jeweils derart auf oder in den Komponenten angeordnet, dass beim Einlegen der Messkassette in die Nachweisreaktionsführungseinheit diese Daten ausgetauscht werden können. Vorzugsweise sind auf der Speichereinheit und Ausleseeinheit der Messkassette Daten gespeichert, die die Art und Konditionierung des Biochips, beispielsweise zum Nachweis von Mykotoxinen oder Eicosanoiden, und welche Nachweisreaktion zu laden und starten ist, gespeichert und abrufbar. Zusätzlich können die Chargennummer, das für die Nachweisreaktion notwendige Programm zur Steuerung der Nachweisreaktion hinterlegt sein. Auch können Informationen über den Zustand der Messkassette gespeichert sein, insbesondere ob es eine bereits gebrauchte Messkassette oder eine neue Messkassette ist. Vorzugsweise wird hier nach erstmaligen Gebrauch einer Messkassette in der Nachweisreaktionsführungseinheit von der Lese- und/oder Entschlüsselungseinheit eine Information auf die Speichereinheit und Ausleseeinheit übertragen, welche bei einer zweiten Verwendung der Messkassette ein Signal auslöst, welches darauf hinweist oder verhindert, dass die Messkassette ein weiteres Mal verwendet wird. Auch kann ein Sicherheitscode gespeichert sein, der durch die Nachweisreaktionsführungseinheit verifiziert wird. Erst nach Gültigkeit des Sicherheitscodes wird die Messkassette zur Analyse von Biomolekülen in der Nachweisreaktionsführungseinheit freigegeben und das Nachweisprogramm gestartet. Darüber hinaus sind die Speicherung weiterer Informationen sowohl in der Speichereinheit und Ausleseeinheit als auch in der Lese- und/oder Entschlüsselungseinheit möglich.

Zur Lösung des der Erfindung zugrunde liegenden Problems schlägt die Erfindung auch eine Messkassette vor.

Die Messkassette ist zur einmaligen Verwendung in der erfinderischen Messvorrichtung hergerichtet. Sie besteht aus einem lichtdurchlässigen Kassettengehäuse, in dem eine Messkammer, in der ein Low Density Biochip mit einem mit funktionalisierten Reaktionsarealen versehenen Glas- oder Kunststoffträger einsetzbar ist, eine Überlaufkammer, eine Probenzufuhr, ggf. mit Probenfilter, und einer Probenleitung zur Messkammer, einer Kammer, in die ein Vorratsbehälter mit einer Reaktionslösung eines farbreaktiven Markers einführbar ist, sowie einem Aktivierungsstempel oder Aktivierungsvorrichtung zur Öffnung des Vorratsbehälters eingerichtet ist. Zusätzlich ist eine Zuleitung für die Reaktionslösung des farbreaktiven Markers aus dem Vorratsbehälter zur Messkammer, mindestens einem Zuleitungsanschluss und einer Zuleitung für eine erste Hilfslösung, mindestens einer Ableitung und einem Ableitungsanschluss für Abfalllösungen vorhanden. Die Messkassette ist mit einer Mischeinrichtung zum Homogenisieren der Probe und der genannten Lösungen in der Messkammer und eine gasdurchlässige Dichtung und/oder ein Ventil und/oder eine Membran zum Druckausgleich im Kassettengehäuse ausgestattet.

Vorzugsweise ist das Messkassettengehäuse aus einem Kunststoff gefertigt.

Die Mischeinrichtung kann eine Ballon-Pumpe oder eine oszillierende Membranpumpe sein. In diesem Fall ist an der Unterseite der Messkassette ein Führungskanal zur Führung des Stößels oder der Pleuelstange zum Antrieb der Pumpe eingerichtet, wobei der Führungskanal derart ausgestaltet ist, dass der Stößel oder die Pleuelstange an der Membran der Pumpe endet.

Der in die Kammer der Messkassette einführbare Vorratsbehälter enthält die Reaktionslösung eines farbreaktiven Markers, vorzugsweise eine Tetramethylbenzidin-Lösung (TMB-Lösung). Vorzugsweise ist die Kammer zylinderförmig ausgestaltet, an deren messkammerseitigen Ende ein hohler dornartige Spitzkegel zentrisch eingerichtet ist. In diese Kammer wir der geschlossene Vorratsbehälter eingeführt und mittels eines zylinderförmigen Stempels, der anschließend in die Kammer eingeführt wird und der mit der Innenwand der Kammer gleitend dicht abschließt, gegen den hohlen dornartigen Spitzkegel gedrückt. Hierdurch wird der Vorratsbehälter geöffnet und die Reaktionslösung freigesetzt. Durch weiteres Drücken des Stempels in Richtung des dornartigen Spitzkegels wird die Reaktionslösung in die Messkammer gedrückt. Dies kann manuell oder automatisch erfolgen.

Die Messkassette kann eine Einweg-Kassette sein, wobei nach Konditionierung und Einlegen des Low-Density Biochips in die Messkammer der Messkassette, die Messkassette versiegelt wurde. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Messkammer mit dem Low Density Biochip verschlossen. Hierzu wird der Low Density Biochip mit den funktionalisierten Reaktionsarealen auf Messkammer wie ein Deckel aufgelegt und der Biochip anschließend fest und luft- und feuchtigkeitsundurchlässig mit dem Messkassettengehäuse verbunden. Vorteilhaft ist hieran, dass die Messkassette nur aus einem Formteil und einem Biochip besteht, und nicht aus zwei Formteilen, die den Biochip umhüllen. Dies senkt Kosten in der Herstellung der Formteile und vereinfacht den Zusammenbau der Messkassette.

Der Low Density Biochip kann für den Nachweis oder Bestimmung von Biomolekülen ausgewählt aus der Gruppe „Mykotoxine, Eicosanoide, Lungenmarker, Anti-IgE-IgE" hergerichtet sein. Das Prinzip der Messkassette ist jedoch auf alle Nachweise von Biomolekülen in einem Assay übertragbar und soll hier nicht auf die genannten Nachweise begrenzt sein.

Der Low Density Biochip kann für den gleichzeitigen Nachweis von verschiedenen Biomolekülen hergerichtet sein, wobei die Reaktionsareale eines Low Density Biochips unterschiedlich funktionalisiert sind. Somit ist es möglich mehrere Biomoleküle einer Probe mit einem Biochip nachzuweisen, beispielsweise diverse Mycotoxine enthaltend in einer Getreideprobe.

Durch unterschiedliche Konzentrationen der Nachweismoleküle auf den Spots kann zusätzlich erreicht werden, dass der Biochip einen extrem weiten Messbereich abdecken kann. Das ist insbesondere dafür sinnvoll, bei unbekannten Proben mit sehr niedriger bzw. sehr hoher Konzentration des Analyten eine Analyse durchführen zu können, ohne eine neue Kalibrierkurve aufnehmen zu müssen.

Vorzugsweise ist die Messkassette mit einer Speichereinheit und/oder Ausleseeinheit enthaltend codierte Information, vorzugsweise eine oder mehrere Informationen ausgewählt aus der Gruppe „Art und Konditionierung des Biochips, Nachweisreaktion, Chargennummer, Programm zur Steuerung der Nachweisreaktion, gebrauchte Messkassette, neue Messkassette, Sicherheitscode", ausgestattet. Die Speicher- und/oder Ausleseeinheit kann dabei ein Barcode oder ein Speicherchip sein. Darüber hinaus sind alle weiteren Systeme zur Abfrage und Überprüfung von gespeicherten codierten Informationen einsetzbar.

Vorteilhaft an der erfinderischen Messkassette ist, dass der eingesetzte Low Density Biochip geschützt vor Umwelteinflüssen oder mechanischen wie chemischen Einflüssen in der Messkassette eingeschlossen ist. Dies erleichtert die Handhabung der empfindlichen Biochips in der Anwendung erheblich. Durch die abgeschlossene Atmosphäre in der Messkassette kann diese auch über längere Zeit gelagert werden, ohne dass der Biochip an Funktionalität verliert. Somit können Messkassetten auf Vorrat hergestellt werden. Ebenso können die Reaktionslösung und Messkassette nach Maßgabe ihrer notwendigen Lagerbedingungen getrennt voneinander aufbewahrt werden und müssen erst kurz vor Gebrauch zusammengesetzt werden. Die Messkassette ist unter geringen Herstellungskosten einfach herzustellen.

Ein Austrocknen des Low Density Biochip vor der Erfassung der Messdaten, wie es bei den bekannten offenen Biochips auftreten kann, führt zwangsläufig zu einer Verfälschung der Messergebnisse. Dies kann bei der erfinderischen Messkassette nicht auftreten, da sich der Biochip in der Messkassette während und nach der Nachweisreaktion in seiner eigenen abgeschlossenen und optimierten Atmosphäre befindet und aufgrund der Versiegelung der Messkassette nicht austrocknen kann.

Nachstehend wird die Erfindung anhand eines Ausführungsbeispiels näher erläutert:

1: schematische Darstellung der Messvorrichtung

2: Messkassette

3: softwaregestützte Auswertung des Biochips

Die 1 zeigt eine Ausführungsvariante der erfinderischen Messvorrichtung zum automatisierten quantitativen fotometrischen Nachweis von Biomolekülen im Low Density Bereich. Sie besteht aus einer Auswerteeinheit 13, einer Nachweisreaktionsführungseinheit 1 mit einem Behälter 2 für eine Hilfslösung und einem Behälter 3 zur Aufnahme von Abfalllösungen sowie Zu- 4 und Ableitungen 5 zu den Behältern und einer Messeinheit 6 mit einem Mittel 7 zur fotometrischen, pixelorientierten Erfassung einer Farbreaktion einer Reaktionslösung mit einem zu detektierenden Biomolekül. Die Messeinheit 6 ist mit einem Einschub 8 zum Einführen und Aufnehmen der Messkassette 9 und einer bodenseitig eingerichteten Beleuchtung 10 zur Durchlichtbeleuchtung der Messkassette nach dem Einführen in die Messeinheit 6 ausgestattet. Sowohl die Nachweisreaktionsführungseinheit 1 als auch die Messeinheit 6 sind über Datenübertragungskabel 11, 12 mit einer computergestützten Auswerteeinheit 13 zur Auswertung der Messergebnisse verbunden. Die 1. zeigt eine Ausführungsvariante mit Stand-Alone-Vorrichtungen. Es können jedoch auch alle Komponenten in einem Gehäuse eingerichtet sein.

Die Messkassette 9 enthält einen Low Density Biochip 14 mit einem mit funktionalisierten Reaktionsarealen versehenen Glas- oder Kunststoffträger, wobei die Messkassette über eine Einführöffnung 15 für die zu analysierende Probe 16 verfügt.

Die Nachweisreaktionsführungseinheit 1 hat mehrere Aufnahmebereiche 17a, 17b, 17c zur passgenauen Aufnahme einer Messkassette 9 (1 zeigt nur eine Messkassette). In diese werden die funktionalisierten Messkassetten eingeschoben. Anschließend wird durch die Probenöffnung 15 die Probe 16 in die Messkassette 9 injiziert. Dieser Vorgang kann aber auch vor dem Einlegen der Messkassette 9 in die Nachweisreaktionsführungseinheit 1 vorgenommen werden. Die Messkassette 9 verfügt über Anschlüsse 18 für die Zu- und Ableitungen der Behälter für Hilfslösungen, die nach dem Einlegen der Messkassette mit den im Aufnahmebereich eingerichteten korrespondierenden Anschlüssen dicht abschließen. Nach dem Einlegen der Messkassette 9 in die Nachweisreaktionsführungseinheit 1 wird von der Auswerteeinheit 13 ein Nachweisreaktionsprogramm gestartet, welches programmgesteuert die Nachweisreaktion in der Nachweisreaktionsführungseinheit 1 durchführt, wobei das Beladen und Spülen der Messkassette mit Reaktions- und Hilfslösungen prozessorgesteuert und vollautomatisch erfolgt.

Nach Beendigung der Nachweisreaktion wird die Messkassette 9 in die Messeinheit 6 eingelegt. Die Messkassette wird während der fotographischen Aufnahme von unten im Durchlichtverfahren beleuchtet. Hierzu ist in der Messeinheit bodenseitig eine Lampe eingerichtet. Mittels der CCD-Kamera 7 wird die Farbintensität der einzelnen Reaktionsareale des Biochips 14 in der Draufsicht fotografiert. Gleichzeitig werden Nullpunktswerte jedes einzelnen Reaktionsareals aufgenommen, die zur Grundlage der Berechnung jedes Farbwertes jedes einzelnen Reaktionsareals zu Grunde gelegt werden. Die Steuerung und das Auslösen der CCD-Kamera erfolgt über die Auswerteeinheit 13.

Das von der CCD-Kamera erstellte digitale Bild sowie die ermittelten Nullpunktswerte der einzelnen Reaktionsareale werden über das Datenverbindungskabel 12 an die Auswerteeinheit 13, hier ein PC, übermittelt, in welcher softwaregestützt die Auswertung der Nachweisreaktion erfolgt. In einer besonderen Ausführungsform können Reaktionsareale mittels der Auswertesoftware oder manuell ausgewählt bestimmten Farbintensitätswerten zugeordnet werden. Die berechneten Messergebnisse werden am Bildschirm der Auswerteeinheit 13 angezeigt.

Die 2 zeigt eine erfinderische Messkassette zur einmaligen Verwendung in der erfinderischen Messvorrichtung. Diese weist ein lichtdurchlässiges Kassettengehäuse 19 und eine Messkammer 20, in der ein Low Density Biochip 14 mit einem mit funktionalisierten Reaktionsarealen versehenen Glas- oder Kunststoffträger eingesetzt ist, auf.

Hinter der Messkammer 20 ist eine Überlaufkammer 21 eingerichtet zur Aufnahme von überschüssiger Proben-, Reaktions- oder Hilfslösungen. In die Messkammer 20 ist die Probe 16 über eine Probenzufuhr 22 mit Probenfilter 23 und einer Probenleitung 24 zur Messkammer 20 einführbar. Die Probeneingabe kann manuell oder prozessgesteuert, beispielsweise über einen Probensampler, erfolgen. In die Kammer 25 ist ein Vorratsbehälter 26 mit einer Reaktionslösung eines farbreaktiven Markers eingesetzt. Der Vorratsbehälter 26 mit einer Reaktionslösung eines farbreaktiven Markers wird mit einem Aktivierungsstempel 27 in die Kammer hineingedrückt und durch Pressen auf beispielsweise einen hohlen spitzen Dorn, der am der Öffnung der Kammer 25 gegenüberliegenden Ende der Kammer 25 eingerichtet ist, geöffnet. Durch weiteres Herunterdrücken des Aktivierungsstempels 27 wird die Reaktionslösung des farbreaktiven Markers aus dem Vorratsbehälter 26 in die Messkammer 20 gedrückt. Dies kann manuell oder automatisch erfolgen. Die Messkassette 9 weist einen Zuleitungsanschluss 28 und eine Zuleitung für eine erste Hilfslösung sowie eine Ableitung und einem Ableitungsanschluss 29 für Abfalllösungen auf. Vor der Messkammer 20 ist eine Mischeinrichtung 30 zum Homogenisieren der Probe und der genannten Lösungen in der Messkammer eingerichtet. Zum Druckausgleich in der Messkassette verfügt diese über eine gasdurchlässige Dichtung 31.

Die 3 zeigt das digitale Bild 32 des Low Density Biochips, welches durch die CCD-Kamera 7 aufgenommen wurde. Das Bild wird auf dem Bildschirm der Auswerteeinheit 13 angezeigt. Darunter sind die über die Auswertesoftware berechnete Farbwerte mit entsprechender Zuordnung 33 einer Konzentration eines detektierten Biomolekül angezeigt. Mittelwerte der ermittelten Nullpunktswerte sind in die Ausgabewerte eingerechnet.

1
Nachweisreaktionsführungseinheit
2
Behälter für Hilfslösung
3
Behälter zur Aufnahme von Abfalllösungen
4
Zuleitung
5
Ableitung
6
Messeinheit
7
CCD-Kamera
8
Einschub/Aufnahmebereich für Messkassette
9
Messkassette
10
Beleuchtung
11
Datenübertragungskabel
12
Datenübertragungskabel
13
Auswerteeinheit
14
Low Density Biochip
15
Einführungsöffnung für die Probe
16
Probe
17
abc Aufnahmebereiche für Messkassetten
18
Anschlüsse
19
lichtdurchlässiges Messkassettengehäuse
20
Messkammer
21
Überlaufkammer
22
Probenzufuhr
23
Probenfilter
24
Probenleitung
25
Kammer für Vorratsbehälter
26
Vorratsbehälter
27
Aktivierungsstempel
28
Zuleitungsanschluss
29
Ableitungsanschluss
30
Mischeinrichtung
31
gasdurchlässige Dichtung
32
digitales Bild des Low Density Biochips
33
Messergebnisse


Anspruch[de]
Messvorrichtung zum automatisierten quantitativen fotometrischen Nachweis von Biomolekülen im Low Density Bereich, aufweisend

eine Nachweisreaktionsführungseinheit (1) mit einem oder mehreren Behältern (2) für Hilfslösungen und einem Behälter (3) zur Aufnahme von Abfalllösungen sowie Zu- (4) und Ableitungen (5) zu den Behältern (2, 3),

eine Messeinheit (6) mit einem Mittel (7) zur fotometrischen, pixelorientierten Erfassung einer Farbreaktion mindestens einer Reaktionslösung mit mindestens einem zu detektierenden Biomolekül,

eine computergestützt arbeitende Auswerteeinheit (13) zur Auswertung der Messergebnisse,

eine Messkassette (9) enthaltend einen Low Density Biochip (14) mit einem mit funktionalisierten Reaktionsarealen versehenen Glas- oder Kunststoffträger, wobei die Messkassette (9) über mindestens eine Einführöffnung (15) für die zu analysierende Probe (16) oder Proben verfügt,

wobei die Nachweisreaktionsführungseinheit (1) mindestens einen Aufnahmebereich (8) zur passgenauen Aufnahme einer Messkassette aufweist und dieser über Anschlüsse für die Zu- und Ableitungen der Behälter (2, 3) für Hilfslösungen und Abfalllösungen verfügt, wobei an der Messkassette (9) zu den Anschlüssen im Aufnahmebereich korrespondierende Anschlüsse (18) eingerichtet sind, wobei die zueinander korrespondierenden Anschlüsse nach dem Einlegen der Messkassette (9) eine lösbare dichte Verbindung eingehen,

wobei das Beladen und Spülen der Messkassette (9) mit Reaktions- und Hilfslösungen, die Reaktionsführung sowie die Auswertung der Farbreaktion prozessorgesteuert erfolgt.
Messvorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die computergestützte Auswerteeinheit (13) über Steuer- und Regeleinheiten zur Steuerung und Regelung sowohl der Nachweisreaktionsführungseinheit (1) als auch der Messeinheit (6) verfügt. Messvorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Nachweisreaktionsführungseinheit (1), die Messeinheit (6) und die computergestützte Auswerteeinheit (13) Stand-alone-Vorrichtungen sind, wobei die Nachweisreaktionsführungseinheit (1) und die Messeinheit (6) mit der Auswerteeinheit (13) über Datenübertragungskabel (11, 12) verbunden sind. Messvorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die computergesteuerte Auswerteeinheit (13) ein PC oder MAC ist. Messvorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Mittel (7) zur fotometrischen, pixelorientierten Erfassung einer Farbreaktion eine CCD-Kamera oder ein Scanner mit Streulicht zur Erzeugung von Daten in Dateiformaten für Rastergrafiken ist. Messvorrichtung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die CCD-Kamera eine 12-Bit CCD-Kamera ist. Messvorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass in der computergestützten Auswerteeinheit (13) die Auswertung der Messergebnisse softwaregestützt auf Basis der durch das Mittel (7) zur fotometrischen, pixelorientierten Erfassung einer Farbreaktion erfassten Daten in Dateiformaten für Rastergrafiken erfolgt. Messvorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die computergestützte Auswerteeinheit (13) über eine Speichereinheit verfügt, in der Farbreferenzwerte und/oder Nullpunktswerte zur Auswertung der Messergebnisse speicherbar oder gespeichert und abrufbar sind. Messvorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass in der Speichereinheit der computergestützten Auswerteeinheit (13) Programme zur Steuerung der Nachweisreaktionsführungseinheit (1) für definierte Nachweisreaktionen verschiedenartig konditionierter Low Density Biochips (14) zum Nachweis unterschiedlicher Biomoleküle gespeichert und abrufbar sind. Messvorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass ein Bedienpaneel zur Eingabe und/oder Starten von Programmen zur Steuerung definierter Nachweisreaktionen und eine Ausgabe- und/oder Anzeigeeinheit für Messergebnisse eingerichtet ist. Messvorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass der Aufnahmebereich (8) zur passgenauen Aufnahme einer Messkassette mit einer Lese- und/oder Entschlüsselungseinheit von auf der Messkassette gespeicherten Informationen ausgestattet ist. Messvorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Messkassette (9) mit einer Speichereinheit und Ausleseeinheit enthaltend codierte Informationen, vorzugsweise eine oder mehrere Informationen ausgewählt aus der Gruppe „Art und Konditionierung des Biochips, Nachweisreaktion, Chargennummer, Programm zur Steuerung der Nachweisreaktion, gebrauchte Messkassette, neue Messkassette, Sicherheitscode", ausgestattet ist. Messkassette zur einmaligen Verwendung in der Messvorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 12,

bestehend aus einem lichtdurchlässigen Kassettengehäuse (19),

einer Messkammer (20), in der ein Low Density Biochip (14) mit einem mit funktionalisierten Reaktionsarealen versehenen Glas- oder Kunststoffträger einsetzbar ist, einer Überlaufkammer (21),

einer Probenzufuhr (22) mit Probenfilter (23) und einer Probenleitung (24) zur Messkammer (20),

einer Kammer (25), in die ein Vorratsbehälter (26) mit einer Reaktionslösung eines farbreaktiven Markers einführbar ist, und einem Aktivierungsstempel (27) zur Öffnung des Vorratsbehälters,

einer Zuleitung für die Reaktionslösung des farbreaktiven Markers aus dem Vorratsbehälter zur Messkammer, mindestens einem Zuleitungsanschluss (28) und einer Zuleitung für eine erste Hilfslösung,

mindestens einer Ableitung und einem Ableitungsanschluss (29) für Abfalllösungen,

einer Mischeinrichtung (30) zum Homogenisieren der Probe (16) und der genannten Lösungen in der Messkammer (20) und

eine gasdurchlässige Dichtung (31) und/oder ein Ventil und/oder eine Membran zum Druckausgleich im Kassettengehäuse (19).
Messkassette nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Messkassettengehäuse (19) aus lichtdurchlässigem Kunststoff besteht. Messkassette nach Anspruch 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Mischeinrichtung (30) eine Ballon-Pumpe oder eine oszillierende Membranpumpe ist. Messkassette nach einem der Ansprüche 13 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktionslösung eines farbreaktiven Markers eine Tetramethylbenzidin-Lösung (TMB-Lösung) ist. Messkassette nach einem der Ansprüche 13 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Messkassette (9) eine Einweg-Kassette ist, wobei vorzugsweise die Messkassette aus einem einzelnen Formteil, und einem Low-Density Biochips (14) besteht, wobei zwischen dem Low Density Biochip und dem Messkassettengehäuse (19) die Messkammer (20) ausgebildet ist, wobei der Low Density Biochip (14) das die Messkassette (9) verschließende Bauteil ist. Messkassette nach einem der Ansprüche 13 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass der Low Density Biochip (14) für den Nachweis oder Bestimmung von Biomolekülen ausgewählt aus der Gruppe „Mykotoxine, Eicosanoide, Lungenmarker, Anti-IgE-IgE" hergerichtet ist. Messkassette nach einem der Ansprüche 13 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass der Low Density Biochip (14) für den gleichzeitigen Nachweis von verschiedenen Biomolekülen hergerichtet ist, wobei die Reaktionsareale eines Low Density Biochips (14) unterschiedlich funktionalisiert sind. Messkassette nach einem der Ansprüche 13 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Messkassette (9) mit einer Speichereinheit und/oder Ausleseeinheit enthaltend codierte Informationen, vorzugsweise eine oder mehrere Informationen ausgewählt aus der Gruppe „Art und Konditionierung des Biochips, Nachweisreaktion, Chargennummer, Programm zur Steuerung der Nachweisreaktion, gebrauchte Messkassette, neue Messkassette, Sicherheitscode", ausgestattet ist. Messkassette nach einem der Ansprüche 13 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Speicher- und/oder Ausleseeinheit ein Barcode oder Speicherchip ist.






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