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Dokumentenidentifikation DE69934366T2 25.10.2007
EP-Veröffentlichungsnummer 0000981600
Titel TRANSFORMIERTE MIKROORGANISMEN MIT VERBESSERTEN EIGENSCHAFTEN
Anmelder Valtion Teknillinen Tutkimuskeskus, Espoo, FI
Erfinder ARISTIDOU, Aristos, Maple Grove, MN 55311, US;
LONDESBOROUGH, John, FI-00150 Helsinki, FI;
PENTTILÄ, Merja, FI-00210 Helsinki, FI;
RICHARD, Peter, FI-00930 Helsinki, FI;
RUOHONEN, Laura, FI-00200 Helsinki, FI;
SÖDERLUND, Hans, FI-02940 Espoo, FI;
TELEMAN, Anita, SE-182 64 Djursholmen, SE;
TOIVARI, Mervi, FI-02280 Espoo, FI
Vertreter Vossius & Partner, 81675 München
DE-Aktenzeichen 69934366
Vertragsstaaten AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 11.03.1999
EP-Aktenzeichen 999076417
WO-Anmeldetag 11.03.1999
PCT-Aktenzeichen PCT/FI99/00185
WO-Veröffentlichungsnummer 1999046363
WO-Veröffentlichungsdatum 16.09.1999
EP-Offenlegungsdatum 01.03.2000
EP date of grant 13.12.2006
Veröffentlichungstag im Patentblatt 25.10.2007
IPC-Hauptklasse C12N 1/19(2006.01)A, F, I, 20051017, B, H, EP
IPC-Nebenklasse C12N 1/21(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   C12P 7/10(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   C12P 7/42(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   C12P 13/08(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   

Beschreibung[de]
Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft die gentechnische Veränderung von in der Biotechnologie eingesetzten Produktions-Mikroorganismen, um deren Eigenschaften zu verbessern, so dass sie nützliche Produkte effizienter herstellen können. Die Erfindung betrifft speziell die Erhöhung der Produktivität von biotechnologischen Prozessen und der Ausbeute der damit hergestellten Produkte wie z.B. Ethanol oder Aminosäuren aus Kohlenstoff- und Stickstoffquellen wie z.B. aus Biomasse, welche Hexosen, Pentosen oder deren Polymere umfasst.

Hintergrund der Erfindung

Die Effizienz vieler biotechnologischer Prozesse ist dadurch beschränkt, dass die Produktionsorganismen ihre metabolischen Redoxreaktionen im Gleichgewicht halten müssen. Insbesondere muss für jedes der Pyridinnucleotidpaare (NAD/NADH und NADP/NADPH) die Gesamtoxidationsrate gleich der Gesamtreduktionsrate sein: sonst wird das Paar vollständig in eine Form umgewandelt werden (z.B. vollständig in die NAD-Form oder vollständig in die NADH-Form) und die Reaktionen, welche die andere Form benötigen, werden unendlich langsam ablaufen, was dazu führt, dass das metabolische Netzwerk der Reaktionen auf eine unerwünschte Art und Weise verzerrt wird (d.h. das gewünschte Produkt nicht mehr liefert).

So sind die Hefen Saccharomyces cerevisae und Schizosaccharomyces pombe, obwohl sie eine hohe Effizienz bei der Umwandlung von Hexosen in Ethanol haben und viele Vorteile für diesen Prozess aufweisen (wie z.B. Toleranz gegenüber hohen Ethanolkonzentrationen und anderen Belastungen), nicht in der Lage, Xylose zu Ethanol zu fermentieren. Xylose ist ein Hauptbestandteil von Pflanzen, und das Unvermögen, diese in Ethanol umzuwandeln, verringert die Effizienz, mit der erneuerbare Biomasse wie z.B. landwirtschaftliche Abfälle verwendet werden kann. Diese Hefen können jedoch Xylulose nutzen. Einige Hefen (z.B. Pichia stipitis) können Xylose, wenn auch nicht sehr effizient, in Ethanol umwandeln und enthalten die Enzyme Xylosereduktase (XR) und Xylitdehydrogenase (XDH). Diese Enzyme katalysieren die sequenzielle Reduktion von Xylose zu Xylit und Oxidation von Xylit zu Xylulose. Man hat transformierte S. cerevisiae – Stämme konstruiert, die heterologe XR und XDH enthalten, welche auf diese Weise einen Reaktionspfad besitzen, Xylose in die fermentierbare Xylulose umzuwandeln (Kötter und Ciriacy, 1993; Tantirungkij et al., 1994; Walfridsson et al., 1995). Obwohl diese Stämme Xylose zum Wachstum und für die Bildung von Xylit nutzen konnten, erzeugten sie nicht viel Ethanol. Alle bekannten XDH-Enzyme sind spezifisch für NAD, wohingegen alle bekannten XR-Enzyme entweder für NADPH spezifisch sind oder eine Präferenz für NADPH aufweisen. Man glaubt (Bruinenberg et al., 1983; Bruinenberg, 1986), dass die Umwandlung von Xylose zu Xylulose über diesen Reaktionsweg deshalb dazu führt, dass der zelluläre Vorrat von NADPH in NADP umgewandelt wird und der von NAD in NADH umgewandelt wird, wonach ein weiterer Metabolismus der Xylose stark behindert wird. Das NADH kann unter aeroben Bedingungen reoxidiert werden, aber dies erfordert eine sorgfältige Steuerung der Sauerstoffkonzentrationen, um den fermentativen Metabolismus und die Ethanolproduktion aufrecht zu erhalten. Im Gegensatz dazu enthalten Bakterien, die Xylose effizient zu Ethanol fermentieren, Xyloseisomerase und wandeln Xylose direkt ohne Oxidations-Reduktions-Reaktionen in Xylulose um. Versuche, eine Hefe zu erzeugen, die Xylose effizient in Ethanol umwandeln kann, haben sich darauf konzentriert, XR- oder XDH-Enzyme mit veränderter Coenzym-Spezifität zu finden oder herzustellen (Metzger und Hollenberg, 1995) oder das Xyloseisomerase-Gen in Hefe zu exprimieren. Jedoch sind alle Versuche, gute Xylose-fermentierende Stämme mittels Expression von bakteriellen Xyloseisomerase-Genen in Hefen zu konstruieren, über die berichtet wurde (siehe z.B. Amore et al., 1989; Ho et al., 1983; Sarthy et al., 1987; Walfridsson et al., 1996), fehlgeschlagen.

Um ein zweites Beispiel zu geben, besteht ein wichtiger biotechnologischer Prozess in der Fermentation von Hexosezuckern zu Ethanol durch Hefe. Der glycolytische Reaktionsweg von Glucose zu Ethanol ist redox-neutral, d.h. die Menge an NAD, die während der Bildung einer bestimmten Menge von Pyruvat aus Glucose gebildet wird, ist genau gleich groß wie die Menge von NADH, die bei der Bildung von Ethanol aus derselben Menge Pyruvat oxidiert wird, und NADP(H) ist an dem Prozess nicht direkt beteiligt. Allerdings ist das Wachstum der Hefe kein redoxneutraler Prozess; eine Begleiterscheinung der Bildung von 100 g Hefe-Trockenmasse aus Glucose und Ammoniak ist die Nettoproduktion von 1,3 Mol NADH und 0,9 Mol NADP (Oura, 1972). Dieses überschüssige NADH wird hauptsächlich durch den Energie erzeugenden Katabolismus erzeugt, wohingegen das überschüssige NADP hauptsächlich von biosynthetischen Reaktionswegen erzeugt wird (siehe Oura, 1972). Wie andere Organismen hat Hefe unterschiedliche Pyridinnucleotidsysteme (NAD(H) und NADP(H)), die sich entwickelt haben, um diese beiden Aspekte des Metabolismus zu ermöglichen. Das überschüssige NADH, welches durch die Fermentierung der Hefe erzeugt wird, wird hauptsächlich durch Glycerin-3-phosphat-Dehydrogenase zu NAD reoxidiert, was zur Produktion von Glycerin führt. Bei der Fermentation in Brennereien stellt dies eine Abzweigung von 3-5% der Kohlenstoffquelle dar, die vergeudet ist (Oura, 1977). Versuche, das Verhältnis von Glycerin zu dem während der Fermentation produzierten Ethanol verringern, waren von geringem oder gar keinem Erfolg gekrönt. Zum Beispiel deletierten Björkgvist et al. (1997) jedes einzelne und beide der Gene, die Glycerin-3-phosphat-Dehydrogenase codieren. Jedoch waren die Hefen, denen dieses Enzym fehlte, nicht nur unfähig, unter anaeroben Bedingungen zu wachsen, sondern sie stellten auch die Produktion von Ethanol ein.

Ein drittes Beispiel ist die biotechnologische Produktion von Aminosäuren. Aminosäuren haben weitreichende Anwendungen in den Lebensmittel-, den Tierfutter-, den Medizin- und den chemischen Industrien. Es sind Fermentationsprozesse entwickelt worden, um die meisten in Proteinen vorkommenden Aminosäuren zu produzieren. Die metabolischen Pfade zu Aminosäuren wandeln zunächst eine Kohlenstoffquelle wie z.B. Glucose in Zwischenprodukte wie z.B. 3-Phosphoglycerat, Pyruvat, Oxalacetat oder 2-Oxoglutarat um, die einen höheren Oxidationszustand aufweisen als Glucose. Deren Bildung erzeugt NADH. Die meisten Aminosäuren weisen einen stärkeren Reduktionszustand auf als die Zwischenprodukte, aber die Reaktionen, die von den Zwischenprodukten zu diesen führen, erzeugen unweigerlich NADP. Mit Ausnahme des Histidin-Reaktionswegs, welcher ein Nettoproduzent von NADPH ist, und den Reaktionswegen zu Glutamin, Glutamat, Tyrosin und Phenylalanin, die weder NADPH verbrauchen noch erzeugen, produzieren die Biosynthesen von allen der anderen 15 Aminosäuren aus Glucose zwischen 1 und 8 Mol NADP pro Mol Aminosäure und erzeugen gleichzeitig NADH (Neidhardt et al., 1990). Andere Reaktionen werden dann benötigt, um das NADH zu oxidieren und das NADP zu reduzieren, um das metabolische Gleichgewicht zu erreichen. Dies wird zu einer Haupteinflussgröße bei Produktionsorganismen wie z.B. Corynebakterien, die man modifiziert und/oder über Selektionsprozesse gewonnen hat, um riesige Mengen von Aminosäuren im kommerziellen Maßstab zu produzieren. Um überschüssiges NADH zu beseitigen, lässt man Aminosäurefermentationen unter aeroben Bedingungen ablaufen und Sauerstoff wird in großen Mengen verbraucht. Um eine maximale Bildung von Produkt zu gewährleisten, ist es unabdingbar, laufend ausreichende Mengen Sauerstoff zuzuführen, üblicherweise in Form von mit Sauerstoff angereicherter Luft (Hirose, 1986). Sauerstoffmangel, z.B. in Fermentationen mit hoher Zelldichte oder in Fällen, in denen eine Versorgung mit Sauerstoff unrentabel ist, führt in der Regel zu geringeren Produktausbeuten und zu einer geringeren Produktivität, da ein Teil der Kohlenstoffquelle in Verbindungen wie z.B. Succinat, Lactat oder beide umgewandelt wird, um das überschüssige NADH loszuwerden.

Andere Beispiele umfassen die verstärkte Biosynthese von Nucleotiden, Lipiden und sekundären Metaboliten durch modifizierte Mikroorganismen, die durch Selektionsverfahren gewonnen oder verändert worden sind, um diese Verbindungen in einem industriellen Maßstab zu erzeugen. Während dieser Prozesse produzieren die Mikroorganismen in der Regel NADH und ein zentrales metabolisches Zwischenprodukt (wie z.B. Pyruvat), das einen höheren Oxidationszustand aufweist als die Kohlenstoffquelle und reduzieren dieses Zwischenprodukt zu dem gewünschten Produkt, wobei NADPH verwendet wird. Wiederum müssen die Mikroorganismen das überschüssige NADH oxidieren und das überschüssige NADP reduzieren, und die Ausbeuten aus der Kohlenstoffquelle werden durch die zusätzlichen metabolischen Umwandlungen der Kohlenstoffquelle vermindert, die notwendig sind, um das Redoxgleichgewicht zu erreichen.

In allen diesen Beispielen wird das überschüssige NADH entweder durch Atmung reoxidiert, was eine effiziente Belüftung erfordert, oder durch die Bildung von unerwünschten Nebenprodukten wie z.B. Glycerin. Eine Belüftung in großen industriellen Maßstäben ist teuer und schwierig, genau zu steuern. Bei manchen Prozessen wie z.B. der Fermentation von Xylose zu Ethanol verursacht die Reduktion des überschüssigen NADP auch Probleme. Wichtige biochemische Reaktionen, die NADPH regenerieren, sind der oxidative Zweig des Pentosephosphat-Reaktionswegs (PPP), d.h. die nacheinander ablaufenden Reaktionen von Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase und 6-Phosphogluconat-Dehydrogenase und der NADP-verbundenen Isocitratdehydrogenase. Bei beiden Reaktionen entsteht CO2. Bei Arbeitsabläufen im industriellen Maßstab stellt dies sowohl einen direkten Verlust an Kohlenstoffquelle als auch eine Verschmutzung der Umwelt dar. Darüber hinaus macht CO2 auch die Kulturmedien sauer, was den Einsatz von größeren Mengen von Neutralisierungsmitteln notwendig macht, um den pH-Wert der Fermentation zu steuern, und hat eine erhebliche Auswirkung auf die Zellphysiologie im Allgemeinen und im Besonderen auf die Produktion von Aminosäuren. Zum Beispiel inhibiert CO2 Enzyme in der Biosynthese von Methionin und Purinen, und es ist berichtet worden, dass es die Bildung von Produkt in mehreren Fermentationsprozessen inhibiert, wozu die Produktion von Isoleucin, Inosin, Fumarat, Penicillin und anderen Antibiotika und von Hefebiomasse gehört (Hirose, 1986).

Eine allgemeine Methode, um diese Probleme zu vermindern ohne eine Belüftung zu verwenden, die teuer und schwierig optimal zu steuern ist, wäre sehr nützlich. Zu möglichen Vorteilen gehören erhöhte Ausbeuten aus der Kohlenstoffquelle, ein verringerter Energieverbrauch, erhebliche Abnahmen in der Erzeugung von CO2 und eine erhöhte spezifische Produktivität, welche besonders wichtig bei Prozessen ist, die immobilisierte Mikroorganismen verwenden.

Bei den Hauptreaktionswegen des Kohlenstoff- und des Stickstoffmetabolismus ist es eine allgemeine Regel, dass die meisten katabolischen Reaktionswege das NAD/NADH-Coenzympaar in den Oxidation-Reduktion-Schritten verwenden, wohingegen anabolische synthetische Reaktionen häufiger das NADP/NADPH-Paar verwenden. Obwohl die Redoxpotenziale (E°') dieser zwei Paare beide nahe bei -0,32 liegen (Kaplan, 1960), werden die Verhältnisse der reduzierten und oxidierten Formen der zwei Paare in lebenden Zellen auf sehr unterschiedlichen Werten gehalten. In anaerober S. cerevisiae ist zum Beispiel NADH/NAD = 0,9 und NADPH/NADP = 3,2 (Sáez und Lagunas, 1976).

Die meisten Pyridinnucleotid-Dehydrogenasen haben eine ausgeprägte, häufig fast absolute Spezifität für das eine oder das andere Pyridinnucleotid. Manche Dehydrogenasen mit demselben Substrat treten sowohl als NAD- als auch als NADP-spezifische Enzyme auf. Gewöhnlich ist nur eines der Enzyme unter bestimmten Bedingungen vorhanden oder die Enzyme werden in unterschiedlichen Zellkompartimenten exprimiert. Gute Beispiele sind Glutamatdehydrogenasen, welche komplizierten Kontrollmechanismen unterworfen sind, was gewöhnlich dazu führt, dass nur eines der Enzyme unter jeder Wachstumsbedingung dominant ist (z.B. Courchesne und Magasanik, 1988; Coschigano et al., 1991; Miller und Magasanik, 1991; ter Schure et al., 1995; Dang et al., 1996; Avendano et al., 1997). S. cerevisiae enthält NAD- und NADP-verbundene Isocitratdehydrogenasen: das Cytosol (welches als ein einzelnes Kompartiment betrachtet wird) enthält nur das NADP-verbundene Enzym, und es gibt ein anderes NADP-verbundenes Enzym in den Peroxisomen, wohingegen die Mitochondrien (wo die Matrix, die Cristae und der Intermembranraum drei Subkompartimente bilden) sowohl NAD- als auch NADP-verbundene Enzyme enthalten (Minard et al., 1998). Die Zellen sind daher in der Lage, NADH/NAD-Verhältnisse aufrechtzuerhalten, die viel niedriger sind als die NADPH/NADP-Verhältnisse, weil Reaktionen, die Reduktionsäquivalente zwischen den zwei Systemen übertragen (und auf diese Weise dazu neigen würden, diese ins Gleichgewicht zu bringen) beschränkt sind. Einige Bakterien- und Tierzellen enthalten NAD(P)-Transhydrogenasen (EC 1.6.1.1 und 1.6.1.2). Bei Transhydrogenasen handelt es sich häufig um Membran-gebundene Enzyme mit mehreren Untereinheiten, welche mit der Energieproduktion verbunden sind statt mit der Gleichgewichtsherstellung der Pyridinnucleotidsysteme. Für die Zwecke dieser Patentanmeldung umfasst der Begriff „Dehydrogenasen" nicht die Transhydrogenasen EC 1.6.1.1 und 1.6.1.2. Viele Produktionsorganismen, die in der Biotechnologie eingesetzt werden, wie z.B. S. cerevisiae und Corynebacterien, enthalten keine NAD(P)-Transhydrogenasen und scheinen somit nicht in der Lage zu sein, NADH plus NADP direkt in NAD plus NADPH und umgekehrt umzuwandeln.

Die Existenz von zwei Pyridinnucleotidsystemen und die Abwesenheit von unregulierten Prozessen, welche diese ins Gleichgewicht bringen würden, deuten darauf hin, dass für das effiziente Wachstum und für die Reproduktion von heutigen entwickelten lebenden Organismen zwei unterschiedliche Systeme erforderlich sind. Der Grund hierfür kann darin liegen, dass ein hohes NADPH/NADP-Verhältnis erforderlich ist um biosynthetische Reaktionen anzutreiben, während ein niedrigeres NADH/NAD-Verhältnis besser für die Energieerzeugung über Reaktionswege wie z.B. die Glycolyse und den Tricarboxylsäure-Zyklus geeignet ist (Metzler, 1977).

Boles et al. (1993) untersuchten eine S. cerevisiae-Mutante, welcher die Phosphoglucoisomerase fehlte, das Enzym, das Glucose-6-phosphat (Glc6P) und Fructose-6-phosphat (Fru6P) ineinander umwandelt. Dieser Stamm (eine pgi1-Deletionsmutante) ist nicht in der Lage, auf irgendeiner Hexose oder Pentose zu wachsen, obwohl er auf bestimmten Gemischen von Fructose und Glucose (z.B. 2% Fructose plus 0,1% Glucose) wachsen kann. Die Autoren haben festgestellt, dass eine Transformation der Mutante mit einer genomischen Bank, welche aus der Mutante selbst hergestellt worden war, zu bestimmten Transformanten führte, die in der Lage waren, auf Glucose alleine zu wachsen, wenn auch drei- bis viermal langsamer als der Wildtyp, und die Plasmide enthielten, die das GDH2-Gen umfassten. Dieses Gen codiert eine NAD-verbundene Glutamatdehydrogenase. Die Autoren argumentierten, dass die gleichzeitige Anwesenheit von erheblichen Aktivitäten von sowohl NADP- als auch NAD-verbundenen Glutamatdehydrogenasen die pgi1-Deletionsmutante in die Lage versetzte, auf Glucose zu wachsen, indem sie diese über den PPP (Abk. für Pentose-Phosphat-Weg) metabolisierte und das daraus entstehende NADPH in NADH umwandelte, welches dann durch funktionelle Mitochondrien reoxidiert werden könnte. So schlug man vor, dass diese Mutanten NAD plus NADPH in NADH plus NADP umwandeln, was die entgegengesetzte Transformation zu derjenigen ist, welche für industrielle Produktionsorganismen benötigt wird (siehe vorstehend). Des Weiteren hing deren Fähigkeit, auf Glucose zu überleben, gänzlich von dem Vorhandensein von funktionellen Mitochondnen und Sauerstoff ab, und sie waren nicht in der Lage, Zucker in Ethanol zu fermentieren (Boles et al., 1993).

Zusammenfassung der Erfindung

Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Mikroorganismus wie z.B. ein Pilz oder ein Bakterium mit mindestens einem rekombinanten DNA-Molekül transformiert, welches mindestens ein Enzym codiert oder auf andere Weise dessen Expression bewirkt, das die funktionelle Kopplung der Oxidation und Reduktion von Substraten durch zwei Pyridinnucleotid-verbundene Dehydrogenasereaktionen mit unterschiedlichen Spezifitäten für die NAD/NADH- und NADP/NADPH-Coenzympaare bewirkt und auf diese Weise den Transfer von Elektronen zwischen den zwei Coenzympaaren über diese Substrate ermöglicht. Bei dem Enzym oder den Enzymen kann es sich demnach um eines oder mehrere Mitglieder eines Paars von Pyridinnucleotidverbundenen Dehydrogenasen handeln, die mindestens ein gemeinsames Substrat, aber verschiedene Pyridinnucleotid-Spezifitäten haben. Biotechnologische Prozesse, in denen eine Nettooxidation von einem Pyridinnucleotid-Coenzympaar zusammen mit einer Nettoreduktion des anderen auftritt, werden durch den erfindungsgemäßen transformierten Mikroorganismus effizienter ausgeführt als durch den entsprechenden nicht transformierten Mikroorganismus, und die Belüftung von solchen Prozessen kann verringert und flexiber gestaltet werden. Zu diesen Prozessen gehören die Fermentation von Kohlenhydraten zu Ethanol durch wachsende Mikroorganismen, die Fermentation von Xylose zu nützlichen Produkten und die kommerzielle Herstellung von Aminosäuren, Nucleotiden, Lipiden und sekundären Metaboliten durch Mikroorganismen.

Bevorzugte Mikroorganismen für die Zwecke dieser Erfindung sind Hefen, Fadenpilze und Bakterien. Bevorzugte Hefen gehören zu der Gattung Saccharomyces und sind insbesondere Stämme von Saccharomyces cerevisae; die Gattung Schizosaccharomyces und besonders Stämme der Spezies Schizosaccharomyces pombe und die Gattung Pichia und besonders Stämme der Spezies Pichia stipitis ebenso wie Candida spp. oder Pachysolen spp. Nützliche Fadenpilze schließen z.B. Trichoderma, Aspergillus, Neurospora, Fusarium, Paecilomyces und Penicillium ein. Zu besonders geeigneten Bakteriengattungen gehören Corynebakterien, besonders die Stämme Corynebacterium glutamicum ebenso wie Brevibakterien wie z.B. Brevibacterium flavum und B. lactofermentum.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

1. Die Genkarte von pAOS66, in welcher die relevanten Gene, Expressionskassetten und Restriktionsstellen angegeben sind.

2. Ausrichtung der Aminosäuresequenz, welche von einer partiellen Sequenz des Gens abgeleitet worden ist, das das "malic enzyme" (Malat-Enzym) von Aspergillus nidulans codiert, mit einigen bekannten "malic enzymes". Die Datenbanknummern (SwissProt) für die bekannten "malic enzymes" sind: P23368 (menschliches "malic enzyme"), P40375 ("malic enzyme" von S. pombe), P36013 ("malic enzyme" von S. cerevisiae). Eine partielle Sequenz des Gens, welches das "malic enzyme" von Trichoderma reesei codiert, wurde bei VTT, Biotechnology and Food Research erhalten. Aminosäuren, die in mindestens drei der Sequenzen identisch sind, sind grau schattiert.

3. Xylose-Fermentationen mit dem rekombinanten Saccharomyces cerevisiae-Stamm, der GDH2 exprimiert (H1803, gefüllte Symbole), und einem Kontrollstamm (H1805, offene Symbole): Vergleich des Wachstums- und der Xylose-Verwertungsraten.

4. Xylose-Fermentationen mit dem rekombinanten Saccharomyces cerevisiae-Stamm, der GDH2 exprimiert (H1803, gefüllte Symbole), und einem Kontrollstamm (H1805, offene Symbole): Vergleich Produktionsraten von Ethanol und Xylit.

5. Xylose-Fermentationen mit dem rekombinanten Saccharomyces cerevisiae-Stamm, der GDH2 exprimiert (H1803, durchgezogene Linie), und einem Kontrollstamm (H1805, gepunktete Linie): Vergleich der Kohlenstoffdioxid-Entstehungsraten.

6. Spezifische Enzymaktivitäten von NADP-Glutamatdehydrogenase (NADP-GDH) und NAD-Glutamatdehydrogenase (NAD-GDH) für die Stämme H1805 (Kontrolle) und H1803 zu den Zeitpunkten 26 und 96 Stunden.

7. Glucose-Fermentationen mit dem rekombinanten Saccharomyces cerevisiae-Stamm, der GDH2 exprimiert (H1791, durchgezogene Linie), und einem Kontrollstamm (H1793, gepunktete Linie): Vergleich der Kohlenstoffdioxid-Entstehungsraten.

8. Biomassenprofile für Xylose-Batchfermentationen des rekombinanten Saccharomyces cerevisae-Stamms, der MAE1 exprimiert (H2195) und eines Kontrollstamms (H2191).

9. Spezifische gesamtmetabolische Raten (C - mMol/g Zellen/h) von Batchfermentationen des rekombinanten Saccharomyces cerevisae-Stamms, der MAE1 exprimiert (H2195), und eines Kontrollstamms (H2191).

10. Zeitprofile für die Produktion von Ethanol aus Xylose in Batchfermentationen des rekombinanten Saccharomyces cerevisae-Stamms, der MAE1 exprimiert (H2222), und eines Kontrollstamms (H2221). Die Ethanol-Konzentrationen sind mit den entsprechenden Biomasse-Mengen normalisiert.

11. Spezifische gesamtmetabolische Raten (C - mMol/g Zellen/h) von Batchfermentationen des rekombinanten Saccharomyces cerevisae-Stamms, der MAE1 exprimiert (H2222), und eines Kontrollstamms (H2221).

12. Biomasse-Zeit-Profile für Xylose-Batchfermentationen des rekombinanten Saccharomyces cerevisae-Stamms, der MAE1 exprimiert (H2222), und eines Kontrollstamms (H2221).

13. Biomasse-Profile für Xylose-Batchfermentationen des rekombinanten Schizosaccharomyces pombe-Stamms H2369, der "malic enzyme" exprimiert, und des Kontrollstamms H2370.

14. Zeitprofile für volumetrische Ethanol-Produktion aus Xylose in dem rekombinanten Schizosaccharomyces pombe-Stamm H2369, der "malic enzyme" exprimiert, und in dem Kontrollstamm H2370.

15. Auftrennung von BamHI-Verdauungsprodukten der Vektoren aus den in Beispiel 21 beschriebenen Corynebacterium-Transformanten. Spur 1: Verdauung des Vektors aus der Transformante ATCC 21253, Spur 2: für dieses Experiment nicht relevant, Spur 3: Verdauung des Vektors aus der Transformante ATCC 21799 (VTT E-992103).

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Die Hauptlehre der vorliegenden Erfindung besteht in einem Verfahren, biotechnologische Prozesse zu verbessern, indem Produktions-Mikroorganismen mit Genen für Enzyme transformiert werden, die dazu neigen, die zwei Pyridinnucleotid-Systeme ins Gleichgewicht zu bringen, die in lebenden Zellen gemeinsam vorkommen. Obwohl Zellen zwei unterschiedliche Pyridinnucleotid-Systeme entwickelt haben, die auf verschiedenen Redoxpotenzialen gehalten werden, und obwohl solche Gleichgewicht herstellenden Reaktionen in natürlich entwickelten Zellen anscheinend verboten sind, wird es nun erstaunlicherweise offenbart, dass diese Reaktionen die metabolischen Reaktionswege fördern, die für die Bildung von Produkt durch die veränderten oder durch Selektionsverfahren gewonnenen Mikroorganismen erwünscht sind, die in vielen biotechnologischen Prozessen eingesetzt werden, und sich dadurch positiv auf diese Prozesse auswirken.

In ihrer ersten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung einen Mikroorganismus bereit, transformiert mit mindestens einem rekombinanten DNA-Molekül, codierend oder anderweitig die Expression bewirkend von zumindest einer von einem Paar von Dehydrogenasen mit entgegengesetzten Coenzym-Spezifitäten für NAD/NADH und NADP/NADPH, aber mindestens einem gemeinsamen Substrat (S in den Gleichungen (1) und (2)) auf eine solche Weise, dass beide Mitglieder des Paars gemeinsam in demselben subzellulären Kompartiment exprimiert werden, vorzugsweise dem Cytosol. Dies führt zu einer funktionellen Kopplung der durch die Dehydrogenasen, die die Reaktionen (1) und (2) katalysiert. Es ist kein notwendiger Teil der Erfindung, aber es ist auch nicht ausgeschlossen, dass sich die zwei Dehydrogenasen innerhalb der transformierten Zelle physisch miteinander verbinden. Die funktionelle Kopplung ermöglicht es, dass die folgenden Reaktionen ablaufen, welche dazu neigen, ein Gleichgewicht zwischen den NAD/NADH und den NADP/NADPH-Coenzympaaren herzustellen: NADP + SH2 <= => S + NADPH(1) S + NADH <= => SH2 + NAD(2)

Man würde erwarten, dass ein gleichzeitiger Ablauf der Reaktionen (1) und (2) weiter geht, bis die NAD/NADH- und NADP/NADPH-Verhältnisse fast identisch sind, weil die Redoxpotenziale der zwei Paare sehr ähnlich sind. Die Erfinder zeigen hier jedoch, dass die Effizienz, mit der Rohmaterial in nützliche Produkte umgewandelt wird und die Ausbeuten der Produkte aus der Biomasse wesentlich erhöht werden, wenn Produktionsmikroorganismen auf diese Weise transformiert werden.

Es sollte beachtet werden, dass die Tendenz, ein Gleichgewicht zwischen den zwei Pyridinnucleotid-Paaren herzustellen, welche durch die Reaktionen (1) und (2) (und auch durch die Reaktionen (3) bis (5), (6) bis (8) und (11) bis (12), nachstehend) bewirkt wird, durch den Transfer von Elektronen durch die Substrate von Pyridinnucleotid-verbundenen Dehydrogenasen (SH2 in den Reaktionen (1) und (2) und in den Reaktionen (3) bis (5), Malat in den Reaktionen (6) bis (8) und Glutamat in den Reaktionen (11) und (12) verursacht wird. Dies unterscheidet die vorliegende Erfindung von Systemen, in denen Elektronen durch sogenannte Transhydrogenasen (z.B. EC 1.6.1.1 und 1.6.1.2) von NAD(P)H auf NAD(P) übertragen werden. Kojima et al. (1996: EP 0 733 712 A1) haben ein System beschrieben, in welchem eine Transhydrogenase in bestimmten Bakterien als ein Mittel zur Umwandlung von über den TCA-Zyklus hergestelltem NADH in NADPH verwendet werden kann.

Es sind mehrere Paare von Dehydrogenasen bekannt, die gemeinsame Substrate teilen, aber verschiedene Pyridinnucleotid-Spezifitäten aufweisen. Zum Beispiel gibt es sowohl NAD- als auch NADP-verbundene Formen von Glutamatdehydrogenase (EC 1.4.1.2 und 1.4.1.4), Isocitratdehydrogenase (EC 1.1.1.41 und 1.1.1.42), Aldehyddehydrogenase (EC 1.2.1.3 und 1.2.1.4), Alkoholdehydrogenase (EC 1.1.1.1 und 1.1.1.2), Malatdehydrogenase (EC 1.1.1.37 und 1.1.1.82), Glycerin-3-phosphat-Dehydrogenase (EC 1.1.1.8 und 1.1.1.94), Xylose-1-Dehydrogenase (EC 1.1.1.175 und 1.1.1.179), Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (EC 1.2.1.12 und 1.2.1.13), Orotatreduktase (EC 1.3.1.14 und 1.3.1.15), und Ferredoxinreduktase (EC 1.18.1.2 und 1.18.1.3), aber es kann jedes zweckdienliche Paar von Dehydrogenasen eingesetzt werden. Es sind viele Dehydrogenasen bekannt (siehe z.B. Enzyme Nomenclature 1992, Academic Press Inc.) und deren Eigenschaften können in der Literatur gefunden oder durch einfache spektrometrische Tests bestimmt werden (siehe z.B. Bergmeyer, 1974). Neben natürlich vorkommenden Enzymen mit den erwünschten Pyridinnucleotid-Spezifitäten umfasst die Erfindung auch die Verwendung von genetisch veränderten Enzymen mit geänderten Pyridinnucleotid-Spezifitäten. Als ein Beispiel für Veränderungen der Cofaktor-Spezifität siehe z.B. Chen et al., 1994 und Chen et al., 1997.

Die für die Reaktionen (1) und (2) verantwortlichen katalytischen Aktivitäten können in demselben polymeren Protein oder sogar in einer einzelnen Polypeptidkette auftreten oder können in einem solchen polymeren Protein oder einer solchen einzelnen Polypeptidkette kombiniert werden, zum Beispiel durch gentechnische Veränderung. Die Erfindung kann auch durch Überexprimieren einer Dehydrogenase realisiert werden, die effektiv mit beiden Pyridinnucleotid-Systemen arbeitet. Dehydrogenasen, welche beide Pyridinnucleotide akzeptieren, sind bekannt und schließen Isozyme von Glutamatdehydrogenase (EC 1.4.1.3), Aldehyddehydrogenase (EC 1.2.1.5) und Alkoholdehydrogenase (EC 1.1.1.71) ein. Es ist wenig darüber bekannt, wie deren Aktivitäten in vivo reguliert sind, so dass sie nicht die Konzentrationen von Pyridinnucleotiden durcheinander bringen.

In ihrer zweiten Ausführungsform stellt die Erfindung einen Mikroorganismus bereit, transformiert mit mindestens einem rekombinanten DNA-Molekül, codierend oder anderweitig die Expression bewirkend von zumindest einem Enzym, das mindestens einen Schritt einer zyklischen Serie von Reaktionen katalysiert, in denen NADP zu NADPH reduziert und NADH zu NAD oxidiert wird oder umgekehrt. Die Reaktionen (3) bis (5) zeigen einen solchen Zyklus: NADP + SH2 <= => S + NADPH(3) S + X <= => Z + Y(4) NADH + Z <= => SH2 + NAD(5)

In der dargestellten Richtung wandeln die Reaktionen (3) bis (5) NADP plus NADH in NADPH plus NAD um, und in der umgekehrten Richtung führen sie die umgekehrte Transformation aus. Die Enzyme, welche die Reaktionen (3) und (5) katalysieren, sind wieder ein Paar von Dehydrogenasen mit einem gemeinsamen Substrat (SH2), aber entgegengesetzten Coenzym-Spezifitäten wie in der ersten Ausführungsform der Erfindung, aber jetzt sind die Reaktionsprodukte (S und Z) verschieden. Für die Zwecke dieser Erfindung kann es sich bei der Reaktion (4) um eine Serie von Schritten anstatt um einen einzelnen Schritt handeln, nur vorausgesetzt, dass S in Z ohne eine Nettoveränderung von NAD oder NADP umgewandelt wird. Somit neigt diese Serie von Reaktionen auch dazu, auf dieselbe Weise wie die Reaktionen (1) und (2) ein Gleichgewicht zwischen den NAD/NADH- und NADP/NADPH-Paaren herzustellen, außer dass dies nun mit der Transformation von X ⇔ Y gekoppelt ist. Somit ist es im Gleichgewicht nicht unbedingt der Fall, dass die NAD/NADH- und die NADP/NADPH-Verhältnisse fast gleich sind: stattdessen werden sie auch von dem Gleichgewicht zwischen X und Y abhängen. Ein Beispiel für diese Ausführungsform der Erfindung wird durch „malic enzyme", Pyruvytcarboxylase und Malatdehydrogenase geliefert, welche die folgenden Reaktionen katalysieren: „malic enzyme": Malat + NADP <= => Pyruvat + CO2 + NADPH(6) Pyruvatcarboxylase: Pyruvat + CO2 + ATP => Oxalacetat + ADP + Pi (7) Malatdehydrogenase: Oxalacetat + NADH <= => Malat + NAD(8)

In den Reaktionen (6) bis (8) entsprechen Pyruvat + CO2 dem S in den Reaktionen (3) bis (5), Oxalacetat entspricht Z, und ATP und ADP + Pi entsprechen X bzw. Y.

In den Reaktionen (3) bis (5) ist das reduzierte Substrat, SH2, den zwei Dehydrogenasen gemeinsam. Die Erfindung kann auch ausgeführt werden, indem ein Mikroorganismus mit einem oder mit mehreren Enzymen transformiert wird, um eine zyklische Serie von Reaktionen (3') bis (5') zu erzeugen, in denen die oxidierte Form des Substrats den zwei Dehydrogenasen gemeinsam ist: NADH + S <= => SH2 + NAD(3') SH2 + X' <= => ZH2 + Y'(4') NADP + ZH2 <= => S + NADPH(5')

Wiederum kann es sich für die Zwecke dieser Erfindung bei der Reaktion (4') anstatt um einen einzelnen Schritt um eine Serie von Schritten handeln, vorausgesetzt nur, dass SH2 ohne eine Nettoveränderung von NAD oder NADP in ZH2 umgewandelt wird.

Des Weiteren ist es nun eine auf der Hand liegende Erweiterung der Erfindung, die zyklischen Schemata (3) bis (5) und (3') bis (5') so zu kombinieren, dass weder die oxidierten noch die reduzierten Formen der Substrate den zwei Dehydrogenasen gemeinsam sind, aber dass die oxidierten Formen der Substrate der Dehydrogenasen durch Reaktionen ohne Netto-Redoxveränderung ineinander umgewandelt werden können, wie das auch für die reduzierten Formen der Fall ist: NADP + SH2 <= => S + NADPH(3'') ZH2 + Y' <= => X' + SH2 S + X <= => Y + Z(4'') NADH + Z <= => ZH2 + NAD(5'')

Somit besteht die Erfindung in ihrer allgemeinsten Form darin, einen Mikroorganismus mit einem Gen zu transformieren, welches die Expression von mindestens einem Enzym bewirkt, welches eine der Reaktionen (3'') bis (5'') katalysiert, so dass alle diese Reaktionen in demselben Zellkompartiment ablaufen können. Wenn die Reaktionen, wie vorstehend beschrieben, von links nach rechts ablaufen, werden die Reduktionsäquivalente von NADH über ZH2 und SH2 auf NADP übertragen, wodurch es zu NADPH reduziert wird. Wenn die Reaktionen von rechts nach links ablaufen, wird NADH zu Lasten von NADPH gebildet.

Es ist in dieser Ausführungsform der Erfindung auch vorgesehen, dass ein gentechnisch verändertes Enzym mit veränderten Coenzym-Spezifitäten verwendet werden kann.

In dem ersten spezifischen Aspekt der Erfindung trägt der Wirtsmikroorganismus ein XR-Enzym, welches vorzugsweise NADPH verwendet, und ein XDH-Enzym, welches vorzugsweise NAD verwendet. Der Wirtsmikroorganismus kann durch diese Enzyme Xylose in Xylulose umwandeln, jedoch ist dieser Prozess, wie vorstehend beschrieben, ineffizient und die Ausbeuten von Ethanol aus Xylose sind niedrig bis nicht vorhanden. Ein Beispiel dieses Aspekts der Erfindung wird in Beispiel 8 bereitgestellt. Ein technisch veränderter Stamm von S. cerevisiae, welcher die Gene für XR und XDH und Xylulokinase (XK) trägt, wird mit einem Plasmid mit mehrfacher Kopienzahl transformiert, welches das Gen GDH2, das die NAD-abhängige Glutamatdehydrogenase von S. cerevisiae codiert, und ein Markergen trägt. Transformanten werden mit Hilfe des Markergens selektiert. Die Transformanten fermentieren Xylose effizienter zu Ethanol als die nicht-transformierte Wirtshefe, insbesondere mit einer höheren Ausbeute von Ethanol aus Xylose oder mit einer geringeren CO2-Produktion oder mit beidem. Je nach den gewählten Prozessbedingungen kann die verbesserte Effizienz auch auf andere Arten realisiert werden, wie z.B. in Form einer erhöhten Volumenproduktivität oder einer verbesserten spezifischen Rate. Eine verbesserte spezifische Rate ist besonders wichtig in Prozessen, welche immobilisierte Mikroorganismen verwenden, wobei es eine Obergrenze hinsichtlich der Menge der Biomasse gibt, welche von dem Trägermaterial festgehalten werden kann. Die erhöhte Effizienz kann durch die folgende Reaktionssequenz erklärt werden: Xylose + NADPH => Xylit + NADP(9) Xylit + NAD => Xylulose + NADH(10) NADH + 2-Oxoglutarat + NH3 => Glutamat + NAD(11) NADP + Glutamat => 2-Oxoglutarat + NH 3 + NADPH(12) Summe: Xylose => Xylulose

Somit wird das Redoxungleichgewicht vermieden und es kann eine reibungslose Umwandlung von Xylose in Xylulose stattfinden. Der Fluss durch Decarboxylierungsreaktionen wie z.B. G6PDH und Isocitratdehydrogenase um NADPH zu regenerieren, wird vermindert, wobei eine verringerte CO2-Produktion stattfindet und die Fermentation läuft effizient und ohne Belüftung ab. Was ziemlich erstaunlich ist, die Xylit-Produktion war in dem gemäß der Erfindung mit GHD2 transformierten Stamm im Vergleich zu dem Kontrollstamm ebenfalls um etwa 25% erhöht. Dieser Anstieg von Xylit wird nachstehend diskutiert.

In diesem Beispiel war der Wirtsmikroorganismus bereits mit Genen transformiert, welche XR, XDH und XK codierten. Es ist kein Erfordernis der Erfindung, dass der Wirtsstamm selbst eine Transformante ist. Es ist bemerkenswert, dass die Erfindung einen erheblichen Anstieg bei den Ethanolausbeuten mit dem Wirtsmikroorganismus von Beispiel 8 bewirkt, weil die XR in diesem Wirt das Enzym von P. stipitis ist, das in der Lage ist, mit NAD(H) zu arbeiten, obschon es eine Präferenz für NADP(H) aufweist (Verduyn et al., 1985). Somit wird dieser Aspekt der Erfindung sogar mit einer XR realisiert, die NADH verwenden kann. Eine beträchtlichere Wirkung kann eintreten, wenn der Wirtsorganismus eine XR mit einer höheren Spezifität für NADP(H) enthält, wie wenn z.B. der eine XR-Aktivität codierende offene Leserahmen XHR 104w von S. cerevisiae hoch exprimiert wird. Des Weiteren ist es behauptet worden, dass eine Transformation von Hefen mit einem Gen, das XK codiert, die Effizienz verbessert, mit der diese Xylose zu Ethanol fermentieren (Ho und Tsao, WO 95/13362). Es ist beachtenswert, dass die vorliegende Erfindung eine verbesserte Fermentation von Xylose zu Ethanol bewirkt, auch wenn der Wirtsorganismus erhöhte Spiegel an XK enthält. Die Erfindung liefert jedoch eine verbesserte Fermentation von Xylose zu Ethanol auch in Wirtsorganismen, welche nicht mit einem Gen transformiert worden sind, das XK codiert. Es ist heute bekannt, dass Hefen wie z.B. S. cerevisiae und Schiz. pombe homologe Gene enthalten, welche XDH, XK und (S. cerevisiae) XR codieren. Die Fähigkeit einer Wirtshefe, welche kein heterologes Gen für XR, XDH oder XK enthält, Xylose zu Ethanol zu fermentieren, kann ebenfalls durch eine Transformation gemäß der vorliegenden Erfindung nützlich verbessert werden.

Es sind verschiedene Enzyme, einschließlich Isomerasen und Epimerasen, bekannt, welche die verschiedenen Pentosezucker und verschiedenen Pentosephosphate ineinander umwandeln. Es ist einem Fachmann ersichtlich, dass die vorliegende Erfindung eine allgemeine Methode bereitstellt, um die Effizienz der Ethanolproduktion zu verbessern, nicht nur aus Xylose, sondern auch aus anderen Pentosen.

Es ist einem Fachmann ersichtlich, dass ähnliche, nützliche Wirkungen erhalten werden können, indem man andere Paare von Dehydrogenasen gemäß der ersten Ausführungsform der vorstehend beschriebenen Erfindung verwendet. Zum Beispiel kann man, anstatt S. cerevisiae mit GDH2 zu transformieren, so dass sowohl NAD-als auch NADP-verbundene Glutamatdehydrogenasen ausreichend im Cytosol exprimiert werden, dieselbe Wirkung erreichen, indem man die Hefe mit einem oder beiden Mitgliedern eines anderen Paars von Dehydrogenasen transformiert, welche dieselben Substrate teilen, aber verschiedene Pyridinnucleotide verwenden, vorausgesetzt, dass beide Enzyme reversibel sind oder dass sie zumindest die Reaktionen in die Richtungen katalysieren, die in den Gleichungen (11) und (12) gezeigt sind. Zum Beispiel sind die meisten NAD-verbundenen Isocitratdehydrogenasen allosterische Enzyme, die die reduktive Carboxylierung von 2-Oxoglutarat (entsprechend der Reaktion (11)) nicht katalysieren können, sondern nur die oxidative Decarboxylierung von Isocitrat, und wären deswegen für diesen Aspekt der vorliegenden Erfindung ungeeignet. Es können jedoch mehrere andere Paare von Dehydrogenasen verwendet werden, wozu Alkohol- und Aldehyddehydrogenasen gehören. Zweckdienliche Information lässt sich aus der Literatur erhalten oder kann leicht durch Austesten mit einfachen spektrophotometrischen Tests bestimmt werden. Die Aktivitäten von Dehydrogenasen können leicht in beiden Richtungen gemessen werden, vorausgesetzt, sie sind reversibel, indem man das Auftreten oder das Verschwinden von NAD(P)H in Gegenwart der geeigneten Substrate verfolgt, um zu bestimmen, ob Enzymkandidaten die Reaktionen katalysieren, die erforderlich sind, um das Coenzym-Ungleichgewicht abzubauen.

Gemäß der zweiten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können ähnliche, nützliche Wirkungen erhalten werden, indem man S. cerevisiae mit einem rekombinanten DNA-Molekül transformiert, das eine NAD(P)-verbundenes „malic enzyme" codiert. S. cerevisiae enthält bereits Pyruvatcarboxylase und Malatdehydrogenase.

Die Hefe kann nun die Reaktionen (6) bis (8), wie vorstehend beschrieben katalysieren, was zu einer Umwandlung von NADP plus NADH in NADPH plus NAD führt. Das Beispiel 14 veranschaulicht die nützlichen Wirkungen dieser Transformation. Verglichen mit dem Kontrollstamm zeigte der Stamm, welcher das Gen für „malic enzyme" überexprimierte, eine 55% höhere spezifische Rate der Xyloseverwertung und 20% und 25% höhere spezifische Raten der Bildung von Ethanol und Xylit.

Die in den Beispielen 8 und 14 beobachteten erhöhten Raten der Xylitbildung durch Stämme, die gemäß der ersten und zweiten Ausführungsform der Erfindung konstruiert worden waren, waren unerwartet, weil diese besonderen Stämme auch heterologe XDH und XK enthielten. Es ist bekannt, dass XDH und XK die Umwandlung von Xylose in Ethanol unterstützen, daher waren diese Stämme ein guter Test, um zu zeigen, dass die vorliegende Erfindung die Fermentation von Xylose zu Ethanol unter realistischen Bedingungen weiter verbessern kann. Es ist zu erwarten, dass XDH und XK die Umwandlung von aus Xylose abgeleitetem Xylit in Xylulose-5-phosphat ermöglichen, daher ist es bedeutsam, dass sogar in Gegenwart dieser zwei Enzyme eine Transformation gemäß der vorliegenden Erfindung die Xylose-Aufnahme um einen größeren Faktor erhöhte als die Ethanol-Produktion, wobei der Unterschied sich in einer Erhöhung der Xylitproduktion bemerkbar macht. Xylit ist ein attraktives Produkt, entweder allein oder zusammen mit Ethanol. Es ist zu erwarten, dass eine erfindungsgemäße Transformation von Stämmen, die keine heterologe XDH und XK enthalten, mindestens so gute Verbesserungen in der Xylitproduktion liefert wie jene, die in den Beispiel 8 und 14 erzielt worden sind.

Hefen und andere Mikroorganismen stellen andere Pentit her, insbesondere Arabit und Ribit, ebenso wie Xylit. Diese können aus anderen natürlichen Pentosen (z.B. Arabinose) hergestellt werden, welche in Rohmaterialien vorkommen, oder durch metabolische Umwandlungen von Pentiten, welche häufig über Dehydrogenasereaktionen mit unterschiedlicher Coenzymspezifität ablaufen (siehe z.B. Chiang & Knight, 1960). In jedem Fall treten ähnliche Redox-Gleichgewichtsprobleme auf wie jene, die vorstehend beschrieben wurden, und es lassen sich durch die Ausführung der vorliegenden Erfindung verbesserte Produktivitäten und Ausbeuten erzielen.

Es wird einem Fachmann ersichtlich sein, dass die vorliegende Erfindung, da sie grundlegende biochemische Prinzipien ausnutzt, eine breite Anwendbarkeit aufweist und in anderen Mikroorganismen wie auch in S. cerevisiae ausgeführt werden kann. Das Beispiel 18 zeigt, dass eine Transformation von Schiz. pombe mit dem Gen, das „malic enzyme" codiert, gemäß der Erfindung die Effizienz der Fermentation von Xylose zu Ethanol verbessert. Volumetrische und spezifische Produktivitäten wurden auch mit diesem Mikroorganismus erheblich erhöht und, was wichtig ist, dieser war in der Lage, seine Biomasse und seine metabolische Kapazität unter den Prozessbedingungen aufrecht zu erhalten, wohingegen die Biomasse des Kontrollstamms relativ schnell abnahm.

In einem anderen spezifischen Aspekt der Erfindung fermentiert der Wirtsmikroorganismus Hexosezucker zu Ethanol. Da der Mikroorganismus während der Fermentation wächst, erzeugt er Überschüsse sowohl von NADH als auch NADP (Oura, 1972). Bei dem nicht-transfizierten Mikroorganismus wird die Ethanolproduktion von einer Glycerinproduktion, welche notwendig ist, um das überschüssige NADH zu reoxidieren, und von der Produktion von mehr als einem Mol CO2 pro Mol Ethanol begleitet, welches benötigt wird, um das überschüssige NADP zu reduzieren. Diese Reaktionen vermindern die Ausbeute von Ethanol aus fermentierbarem Kohlenhydrat. Bei dem transformierten Mikroorganismus ist die Ausbeute von Ethanol aus fermentierbarem Kohlenhydrat verglichen mit der des nicht-transformierten Mikroorganismus erhöht. Veranschaulichungen dieses Aspekts der Erfindung sind in den Beispielen 9 und 13 bereitgestellt.

In Beispiel 9 ist die Hefe S. cerevisiae mit einem Plasmid mit mehrfacher Kopienzahl transformiert, welches das Gen GDH2, das die NAD-abhängige Glutamatdehydrogenase aus S. cerevisiae codiert, sowie ein Markergen enthält. Die Transformanten werden mit Hilfe des Markergens selektiert. Die Transformanten fermentieren Glucose mit einer verbesserten Effizienz zu Ethanol, insbesondere einer verbesserten Ausbeute an Ethanol auf fermentierbaren Kohlenhydraten und mit einer verringerten Produktion einiger unerwünschter Nebenprodukte, einschließlich CO2. Je nach den gewählten Prozessbedingungen kann die verbesserte Effizienz auch auf andere Weisen realisiert werden, wie z.B. eine erhöhte Volumenproduktivität oder eine erhöhte spezifische Rate. Dies kann durch die folgende Reaktionssequenz erklärt werden, die wesentliche Teile des überschüssigen NADH und NADP ohne unerwünschten Verbrauch von fermentierbaren Zuckern in NAD und NADPH umwandelt: NADH + 2-Oxoglutarat + NH3 => Glutamat + NAD NADP + Glutamat => 2-Oxoglutarat + NH3 + NADPH

In Beispiel 13 ist S. cerevisiae mit einem Gen transformiert, das „malic enzyme" codiert, gemäß der zweiten Ausführungsform der Erfindung. Damit werden erhebliche Vorteile erzielt, wozu wieder eine verminderte Produktion von (unerwünschter) Biomasse und eine erhöhte spezifische Rate der Ethanol-Produktion gehören.

Es wird einem Fachmann ersichtlich sein, dass ähnliche nützliche Wirkungen bei der Fermentation von Hexose zu Ethanol erzielt werden können, indem andere Paare von Dehydrogenasen gemäß der vorstehend offenbarten ersten Ausführungsform der Erfindung verwendet werden oder indem andere zweckdienliche Enzyme gemäß der zweiten Ausführungsform der Erfindung verwendet werden, und dass die Erfindung mit anderen Mikroorganismen wie auch mit S. cerevisiae ausgeführt werden kann.

Es ist ein bedeutender Teil der Erfindung, dass dieselbe Transformation, die die Effizienz der Fermentation von Xylose zu Ethanol erhöht (Beispiele 8, 14 und 18), auch die Effizienz der Fermentation von Hexose zu Ethanol erhöht (Beispiele 9 und 13). Somit stellt die Erfindung gleichzeitig eine verbesserte Verwertung von sowohl Glucose als auch Xylose bereit, welche wichtige Zucker darstellen, die aus vielen erneuerbaren Biomassen abgeleitet werden, wie z.B. aus landwirtschaftlichen und forstwirtschaftlichen Materialien und aus städtischen Abfällen.

Für eine industrielle Produktion von Ethanol wird die vorliegende Erfindung bevorzugt ausgeführt, indem ein industrieller Stamm, z.B. eine Brennerei- oder eine Brauerei-Hefe, verwendet wird oder eine Weinhefe oder ein Stamm von Schiz. pombe, der für die Rumproduktion eingesetzt wird. Methoden zur Transformation von industriellen Hefen, die häufig polyploid sind und denen auxotrophe Marker fehlen, sind wohlbekannt. Eine frühe Übersicht solcher Methoden wurde von Knowles und Tubb (1987) angefertigt. Der industrielle Stamm, der gemäß der Erfindung transformiert worden ist, wird dann zum Beispiel in demselben industriellen Fermentationsprozess eingesetzt wie der nicht-transformierte Stamm und stellt die vorstehend offenbarten Vorteile, wie z.B. erhöhte Ausbeute, erhöhte Produktivität und verminderte unerwünschte Nebenprodukte bereit. Verglichen mit dem nicht-transformierten Stamm kann der transformierte Stamm vorteilhafterweise auch für die ökonomische Fermentation eines breiteren Bereichs von Rohmaterialien eingesetzt werden, wie z.B. Rohmaterialien mit hohem Gehalt an Pentosen, Pentosepolymeren oder beiden.

In einem dritten spezifischen Aspekt der Erfindung wird ein Mikroorganismus, der eine Aminosäure wie z.B. Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Serin, Threonin, Lysin, Arginin, Tryptophan, Cystein, Methionin oder Prolin überproduziert, mit mindestens einem rekombinanten DNA-Molekül, das mindestens eine von einem Paar von Dehydrogenasen mit entgegengesetzten Pyridinnucleotid-Spezifitäten codiert (d.h. gemäß der ersten Ausführungsform der Erfindung) oder mit mindestens einem rekombinanten DNA-Molekül transformiert, welches mindestens ein Enzym codiert, welches mindestens einen Schritt einer zyklischen Serie von Reaktionen katalysiert, in denen NADP gemäß den Reaktionen (3) bis (5), (3') bis (5') oder (3'') bis (5'') zu NADPH reduziert wird und NADH zu NAD oxidiert wird (d.h. gemäß der zweiten Ausführungsform der Erfindung). Der transformierte Mikroorganismus kann die gewünschte Aminosäure mit verbesserter Effizienz herstellen, insbesondere mit einer erhöhten Ausbeute auf einer Kohlenstoffquelle, mit einer erhöhten Produktivität, mit einem verminderten Bedarf einer Belüftung, mit einer verminderten Produktion von Kohlendioxid oder mit mehreren dieser Vorteile.

Lysin wird zum Beispiel derzeit durch mikrobielle Fermentationsprozesse hergestellt, die hauptsächlich auf verschiedenen Corynebakterien basieren, wie z.B. Corynebacterium glutamicum und Brevibacterium flavum. Gentechnologische Verfahren für diese Bakterien sind gut entwickelt (siehe z.B. Follettie et al., 1991; Follettie und Sinskey, 1986; Jetten et al., 1994; Jetten & Sinskey, 1995) und DNA-Vektoren stehen für die Transformation dieser Produktionsorganismen entweder durch Plasmide mit mehrfacher Kopienzahl oder durch chromosomale Integration effizient zur Verfügung. Zu verfügbaren Vektoren gehören beispielsweise pAJ655, pAJ1844 und pCD11 für den Einsatz bei C. glutamicum, Brevibacterium spp. und Escherichia coli oder der Plasmidvektor pAJ440 für den Einsatz in Bacillus subtilis, Brevibacterium spp. und C. glutamicum oder der Plasmidvektor pMS2 für den Einsatz in Rhodococcus spp., Corynebacterium spp. und E. coli. Die Auswirkungen der Transformation von Lysin-produzierenden Stämmen gemäß der vorliegenden Erfindung kann in Stämmen wie z.B. ATCC 31269, ATCC 21253, ATCC 21800, ATCC 21801 oder ATCC 21086 oder in anderen Stämmen realisiert werden, die Lysin oder andere Aminosäuren überproduzieren und die industriell genutzt werden.

Dieser Aspekt der Erfindung ist in den Beispielen 19 bis 23 gezeigt. Corynebacterium glutamicum wurde mit einem Gen aus Peptostreptococcus asaccharolyticus transformiert, das eine NAD-abhängige Glutamatdehydrogenase codiert. Das transformierte Corynebacterium glutamicum zeigt eine NAD-verbundene Glutamatdehydrogenase-Aktivität und dieser Organismus besitzt natürlicherweise eine NADP-verbundene Glutamatdehydrogenase-Aktivität. Der transformierte Organismus besitzt daher gemäß der ersten Ausführungsform der Erfindung ein Dehydrogenasepaar, welches NADP plus NADH in NAD plus NADPH umwandeln kann. Im Gegensatz zu manchen Bakterien enthält Corynebacterium glutamicum keine NADP/NADPH-Transhydrogenase, somit stellt die sequenzielle Reaktion der zwei Glutamatdehydrogenasen dem Bakterium ein neues Mittel zur Verfügung, ein Gleichgewicht zwischen den NAD/NADH und NADP/NADPH-Coenzympaaren herzustellen. Es ist wohlbekannt, dass die Synthese von Lysin (und den meisten anderen Aminosäuren) NADP produziert und dass, wenn Lysin in hohen Mengen überproduziert wird, die Notwendigkeit der Reduktion von NADP zu NADPH die Aminosäureproduktion limitieren kann. Es ist auch bekannt, dass unter den in Beispiel 23 verwendeten Züchtungsbedingungen die Produktion von Lysin nicht beginnt, solange noch Threonin in dem Medium vorhanden ist, und dass die Ausbeuten relativ niedrig sind, bis die Bakterien zu wachsen aufhören (Vallino, J.J., 1991; siehe besonders Seiten 207 bis 213). Erstaunlicherweise produzierte das gemäß der Erfindung transformierte Corynebacterium glutamicum bereits große Mengen Lysin, während Threonin noch vorhanden war und bevor das Bakterium gerade einmal 25% der erwarteten Ausbeute an Biomasse erreicht hatte. Diese Beispiele offenbaren, dass die vorliegende Erfindung mit Vorteil auch in Bakterien ebenso wie in Pilzen ausgeführt werden kann, sowie zur Verbesserung der Produktion von Aminosäuren ebenso wie von nicht-stickstoffhaltigen Verbindungen wie z.B. Ethanol und Xylit.

Für die industrielle Produktion von Aminosäuren wird ein bakterieller Stamm, der eine oder mehrere Aminosäuren überproduziert, gemäß der Erfindung transformiert. Der transformierte Stamm kann in demselben industriellen Prozess eingesetzt werden wie der parentale nicht-transformierte Stamm. Zum Beispiel können Rohmaterialien verwendet werden, die einen beliebigen Stoff aus einer Vielfalt von Zuckern oder organischen Säuren umfassen, wie z.B. Citronen-, Bernstein- oder Fumarsäure als Kohlenstoffquelle und Ammoniak, Ammoniumsalze oder kostengünstige Proteinhydrolysate als Stickstoffquelle. Organische (z.B. Thiamin) und anorganische (z.B. Eisen- und Mangansalze) Spurenelemente können auf dieselbe Weise hinzugefügt werden wie für den Originalprozess mit dem parentalen nicht-transformierten Stamm. Im Vergleich zu dem nicht-transformierten Stamm stellt der gemäß der vorliegenden Erfindung transformierte Stamm die vorstehend offenbarten Vorteile bereit, wie z.B. eine erhöhte Ausbeute, eine erhöhte Produktivität, verringerten Sauerstoffbedarf.

Man kann auch eine NAD-verbundene Glutamatdehydrogenase in Corynebacterium glutamicum (und andere Corynebacteria spp.) mit Hilfe einer beliebigen, auf dem Fachgebiet wohlbekannten Methode einführen. Zum Beispiel ist das Gen von Peptostreptococcus asaccharolyticus unter der Kontrolle eines Tac-Promotors durch Marx et al. (1999) in C. glutamicum übertragen worden. Bezeichnenderweise verwendeten die Leute dieser Arbeitsgruppe einen Stamm von Corynebacterium glutamicum, von dem zuerst das Gen deletiert wurde, das eine NADP-verbundene Glutamatdehydrogenase codiert, wohingegen die vorliegende Erfindung das gleichzeitige Vorhandensein von NADP-verbundenen und NAD-verbundenen Glutamatdehydrogenasen lehrt. Die Erfindung kann auch dadurch ausgeführt werden, dass bakterielle Stämme, die andere Aminosäuren als Lysin überproduzieren, mit diesem oder einem anderen Gen transformiert werden, das NAD-verbundene Glutamatdehydrogenase codiert, oder mit einem Gen für irgendein anderes Enzym transformiert werden, das die funktionelle Kopplung der zwei Dehydrogenasen mit unterschiedlichen Spezifitäten für die Pyridinnucleotidpaare bewirkt.

Polyhydroxyalkanoate (PHAs) werden kommerziell hergestellt, um biologisch abbaubare Plastikstoffe herzustellen, aber die Preise sind für einen weit verbreiteten Einsatz zu hoch, außer in Ländern, in denen dies durch die Gesetzgebung durchgesetzt wird (z.B. in Deutschland). Es ist daher wünschenswert, die Effizienz der mikrobiellen Prozesse zur Herstellung von PHAs zu verbessern. Bei der Biosynthese von PHAs wird Glucose zu Acetyl-CoA metabolisiert, wodurch 2 Moleküle NADH/Molekül Acetyl-CoA erzeugt werden, und das Acetyl-CoA wird dann zu Acetoacyl-CoA kondensiert, welches durch NADPH zu 3-Hydroxybutyryl-CoA reduziert wird. Die Synthese von jedem Molekül 3-Hydroxybutyryl-CoA erzeugt daher 4 Moleküle NADH und benötigt ein Molekül NADPH. Das 3-Hydroxybutyryl-CoA wird dann zu Polyhydroxybuttersäure (PHB) polymerisiert oder wird mit anderen Acetyl-CoAs wie z.B. Propionyl-CoA co-polymerisiert, um gemischte PHAs zu bilden. Der Bedarf von einem Molekül NADPH und die Erzeugung von 4 Molekülen NADH pro Monomereinheit bedeutet, dass die Mikroorganismen, die PHAs synthetisieren, einen Teil ihres Kohlenstoffflusses über Reaktionen wie z.B. Glucose-6-phosphatdehydrogenase oder Isocitratdehydrogenase umleiten müssen, um NADPH zu erzeugen, mit einer sich daraus ergebenden überschüssigen Produktion von CO2 und einer Verschwendung von Kohlenstoffquelle, wie vorstehend erklärt. Gleichzeitig muss NADH reoxidiert werden, was entweder weitere Kohlenstoff-Verluste oder einen erhöhten Sauerstoffbedarf oder beides bewirkt. Diese Verschwendung kann verringert werden, indem man den Produktionsmikroorganismus gemäß der vorliegenden Erfindung transformiert, um ihn auf diese Weise mit einem neuen Mechanismus auszustatten, der einen Teil des hergestellten überschüssigen NADH in das benötigte NADPH umwandelt (für Übersichtsartikel siehe z.B. Anderson und Dawes, 1990; Poirier et al., 1995).

In diesem Aspekt der Erfindung wird ein Mikroorganismus, der eine oder mehrere PHAs produziert, gemäß der ersten oder der zweiten Ausführungsform der Erfindung transformiert, und der transformierte Mikroorganismus wird dazu eingesetzt, Glucose in Anwesenheit oder Abwesenheit von organischen Säuren wie z.B. Propion- oder Valeriansäure zu fermentieren. Im Vergleich zu dem nicht-transformierten parentalen Organismus bietet der gemäß der Erfindung transformierte Organismus die vorstehend offenbarten Vorteile wie z.B. die Erzeugung von erhöhten Ausbeuten von PHA auf Glucose, erhöhte Produktivitäten und verminderte Bildung von unerwünschten Nebenprodukten wie z.B. CO2. Das Beispiel 24 veranschaulicht, wie das gemacht werden kann. In diesem Beispiel handelt es sich bei dem Produktionsmikroorganismus um einen rekombinanten Stamm von Saccharomyces cerevisae, der mit den PHB-Synthase und -Reduktase-Genen von Alcaligenes eutrophus transformiert worden ist. Es ist jedoch nicht notwendig, dass eine rekombinante Hefe verwendet wird. Man kann jeden beliebigen Mikroorganismus, der PHAs produziert, z.B. Alcaligenes eutrophus oder Pseudomonas oleovarans, oder technisch veränderte bakterielle Stämme verwenden, die PHAs überproduzieren. Der gemäß der vorliegenden Erfindung transformierte Mikroorganismus wird dann dazu eingesetzt, Glucose mit oder ohne organische Säuren unter den im Wesentlichen selben Prozessbedingungen zu fermentieren wie denjenigen, die für den nicht-transformierten parentalen Organismus verwendet werden.

In einem anderen Aspekt der Erfindung wird ein Produktionsmikroorganismus gemäß der Erfindung transformiert, und der transformierte Mikroorganismus hält unter den Bedingungen eines biotechnologischen Prozesses einen höheren Wert der für diesen Prozess benötigten metabolischen Kapazität aufrecht, als es der entsprechende nicht-transformierte Mikroorganismus tut. Das Beispiel 14 veranschaulicht diesen Aspekt. S. cerevisiae, die gemäß der Erfindung mit einem Gen transformiert worden ist, das „malic enzyme" exprimiert, wird dazu verwendet, Xylose unter anaeroben Bedingungen zu Ethanol zu fermentieren, was vorteilhaft ist, weil diese eine durch oxidative Prozesse verursachte Abnahme der Ausbeute an Ethanol verhindern. Unter diesen Prozessbedingungen nimmt die Biomasse des Kontrollstamms während der Prozessführung mit der Zeit ab, mit einem entsprechenden Verlust seiner metabolischen Kapazität, Substrat (Xylose) in Produkt (Ethanol) umzuwandeln. In der Praxis würde dies zu lästigen und teuren Prozesserfordernissen führen, wie z.B. der wiederholten Zugabe von mehr Produktionsorganismus. Der gemäß der Erfindung transformierte Organismus ist jedoch in der Lage, seine Biomasse und die von dem Prozess benötigte metabolische Kapazität aufrecht zu erhalten (8). Das liegt vermutlich daran, dass der transformierte Organismus in der Lage ist, genügend Energie aus der Biotransformation des Prozesses zu beziehen (im Fall von Beispiel 14 aus der Umwandlung von Xylose in Ethanol), um seine eigene Integrität und metabolische Kapazität aufrecht zu erhalten, wohingegen der nicht-transformierte Stamm dies nicht kann. Unter den Bedingungen von Beispiel 14 war es mit einem einzelligen Produktionsmikroorganismus und einem homogenen flüssigen Medium leicht zu zeigen, dass die Biomasse des Kontroll-Mikroorganismus abnimmt und dass die Biomasse des gemäß der Erfindung transformierten Organismus aufrecht erhalten wird.

Es ist jedoch einer mit dem Fachgebiet vertrauten Person erstens klar, dass es in vielen Prozessen, z.B. in denen, in denen inhomogene Medien oder Fadenpilze oder beides eingesetzt werden, sehr schwierig sein kann, die Aufrechterhaltung der Biomasse zu zeigen, und zweitens, dass der wesentliche Parameter nicht die Biomasse selbst ist, sondern seine metabolische Kapazität, das Substrat des Prozesses in das Produkt umzuwandeln. In diesem Zusammenhang bedeutet metabolische Kapazität die Gesamtfähigkeit des in einem Prozess vorhandenen Produktionsorganismus (z.B. pro Einheitsvolumen eines Fermenters), eine bestimmte Serie von Biotransformationen durchzuführen, nämlich diejenigen, die von dem jeweiligen biotechnologischen Prozess benötigt werden, und sie kann gemessen werden, indem man die Rate der Umwandlung von Prozesssubstrat in Prozessprodukt unter Standardbedingungen misst.

Andere Aspekte der Erfindung umfassen die Transformation von Produktionsmikroorganismen, die entwickelt worden sind, um Nucleotide, Lipide oder sekundäre Metaboliten verschiedener Art in einem industriellen Maßstab zu überproduzieren. Nach einer Transformation gemäß den vorstehend beschriebenen Ausführungsformen dieser Erfindung werden diese Mikroorganismen erhöhte Ausbeuten der erwünschten kommerziellen Produkte, oder erhöhte spezifische Produktionsraten, verminderte Bildung von unerwünschten Nebenprodukten (wie z.B. CO2 oder überschüssige Biomasse) oder mehrere dieser Vorteile gleichzeitig liefern.

Diese Beispiele offenbaren, wie die Effizienz von biotechnologischen Prozessen verbessert werden kann, indem Produktionsmikroorganismen mit mindestens einem rekombinanten DNA-Molekül transformiert werden, welches Enzyme codiert, die Oxidation-Reduktion-Reaktionen zwischen den NAD(H)- und NADP(H)-Coenzymsystemen ermöglichen. Die Erfindung kann dadurch realisiert werden, indem man den Wirt mit einem einzelnen Gen (z.B. GDH2 in Beispiel 3; MAE1 in Beispiel 12) transformiert und Enzyme verwendet, die in dem Wirt unter den spezifischen Produktionsbedingungen natürlich exprimiert werden, um die Reaktionsschemata (z.B. die Reaktionen (1) + (2) oder (3) + (4) + (5) vorstehend) zu vervollständigen. Die Erfindung kann jedoch auch dadurch realisiert werden, indem man den Wirt mit mehr als einem DNA-Molekül transformiert, so dass beide Reaktionen (1) und (2) oder zwei oder mehr der Reaktionen (3), (4) und (5) (oder (3'), (4') und (5') oder (3''), (4'') und (5'') durch Enzyme ausgeführt werden, die von den transformierten Genen exprimiert werden.

Neben GDH2 und einem Gen, das „malic enzyme" codiert, können Gene vorteilhaft sein, die andere Enzyme codieren. Geeignete Enzyme (Beispiele sind vorstehend angegeben) sind bekannt und deren Gene sind cloniert worden und können in Datenbanken gefunden werden und mittels auf dem Fachgebiet wohlbekannten PCR-Methoden erhalten werden (Beispiele 6 und 7 und 10 bestätigen, wie leicht dies bei Genen sowohl von Hefen als auch Fadenpilzen gemacht werden kann). Ein Fachmann auf dem Gebiet der mikrobiellen Physiologie und des Metabolismus kann ein metabolisches Schema planen, welches den Reaktionen (1) und (2) oder (3) bis (5), (3') bis (5') oder (3'') bis (5'') entspricht. Viele solcher Schemata erfordern wohlbekannte Enzyme. Man kann auch Datenbanken (z.B. Swissprot) durchsuchen, um das erforderliche Enzym oder die erforderlichen Enzyme zu finden. So stellen zum Beispiel die folgenden Hinterlegungsnummern Aminosäure- oder Nucleotidsequenzen bereit, welche NADP-verbundenen Dehydrogenasen entsprechen: P00369, P31026, P00370, P50216, P08200, P14941, P75214, P27800, Q58820, P15719, P46919, P28861, L05667, U26463, YPL061w, P18819, M88600, X75327 und P55804. Diese Sequenzen können verwendet werden, um die entsprechenden Gene zu clonieren, z.B. mittels PCR mit Sequenz-spezifischen Primern.

Andere geeignete Enzymaktivitäten lassen sich finden, indem man zweckdienliche Enzymtests (siehe z.B. Bergmeyer, 1974, aber andere geeignete Testssysteme können von einem Fachmann leicht konstruiert werden) mit Extrakten durchführt, die aus geeigneten Organismen präpariert worden sind, wozu Bakterien, Pilze und höhere Pflanzen und Tiere gehören. Das zuständige Protein kann dann mit Hilfe von Standardmethoden aufgereinigt werden, und Antikörper können dagegen hergestellt oder Aminosäuresequenzdaten davon erhalten werden. Das Gen, welches das Protein codiert, kann dann mit Hilfe von Standardmethoden cloniert werden, wie z.B. dem Verwenden von Antikörpern, um Expressionsbanken zu durchmustern, oder Oligonucleotiden, welche von den Aminosäuresequenzen konstruiert werden, um als Primer bei der PCR-Clonierung oder als Hybridisierungssonden zu fungieren um Genbanken zu durchmustern.

Geeignete neue Enzymaktivitäten und deren Gene lassen sich auch finden, indem man Datenbankinformation auf andere Weisen ausnutzt, welche Fachleuten vertraut und für diese Routine sind. Zum Beispiel fördert eine Ausrichtung von mehreren „malic enzyme" codierenden Sequenzen eine sogenannte kennzeichnete Struktur „malic enzyme"-Signatur zu Tage, welche die Herstellung von Oligonucleotid-Gemischen erlaubt, die zum Beispiel für die PCR-Clonierung von Genen eingesetzt werden können, die „malic enzyme" in anderen Organismen codieren, wie es in Beispiel 7 für das „malic enzyme" von Aspergillus nidulans beschrieben ist.

Es ist einem Fachmann wohlbekannt, dass während der Clonierung von Genen mittels PCR Punktmutationen auftreten und durch die Amplifizierungstechnik weitergeführt werden können. Kleine Sequenzunterschiede zwischen den gleichen Genen in verschiedenen Stämmen desselben Organismus können auch natürlich auftreten. Viele dieser Veränderungen haben keine wesentlichen Auswirkungen auf die Funktion des codierten Proteins und werden daher neutrale Mutationen genannt. Zum Beispiel wurden in Beispiel 10 zwei Punktmutationen in dem Gen beobachtet, das „malic enzyme" codiert, die aber die Aktivität der codierten „malic enzyme" nicht wesentlich beeinträchtigten. Solche neutralen Mutationen können auch absichtlich eingeführt werden. Unsere Erfindung umspannt die Verwendung solcher neutraler Genvarianten ebenso wie die natürlichen Gene.

Gemäß der vorliegenden Erfindung wird der Wirtsorganismus auf eine solche Weise transformiert, dass die Reaktionen (1) und (2) in der ersten Ausführungsform der Erfindung oder die Reaktionen (3) bis (5) (oder (3') bis (5') oder (3'') bis (5'')) in der zweiten Ausführungsform gleichzeitig auftreten, bevorzugt in demselben subzellulären Kompartiment, bevorzugt dem Cytosol. Die Beschränkung, dass die Reaktionen im selben Kompartiment auftreten, ist nicht absolut, da Reaktionen (4'') Transport- oder Shuttle-Reaktionen einschließen können, die metabolische Intermediate zwischen subzellulären Kompartimenten bewegen. Die Erfindung lehrt, dass das transformierende Gen gegebenenfalls modifiziert sein kann, um eine Expression in dem zweckdienlichen Kompartiment zu bewirken und unter physiologischen Bedingungen, die während des gewünschten Produktionsprozesses vorherrschen. Es sind sogenannte „Signal"- oder „Targeting"-Sequenzen bekannt, die üblicherweise relativ kurze N-terminale oder C-terminale Aminosäuresequenzen codieren, welche Proteine in spezifische Kompartimente lotsen, wie z.B. in Mitochondrien, Peroxisomen oder in den periplasmatischen Raum (McAlister-Henn et al., 1995). Diese Sequenzen können mit Hilfe von Standardmethoden der Genmanipulation leicht entfernt oder zu Genen hinzugefügt werden, um zu bewirken, dass die gewünschten Enzyme in dem gewünschten Kompartiment exprimiert werden. „Malic enzyme", welches von dem vollständigen MAE1-Gen (wie in den Beispielen 13, 14 und 18) exprimiert wird, stellt ein Beispiel eines Enzyms mit einer mitochondrialen Targeting-Sequenz dar (Boles et al., 1998), so dass man erwartet, dass zumindest ein Teil seiner Aktivität innerhalb von Mitochondrien lokalisiert ist. Wenn das Gen, wie in den Beispielen 13 und 14, stark exprimiert wird, ist es wahrscheinlich, dass ein Teil des Enzyms im Cytosol bleibt, wo auch die Hefe-Malatdehydrogenase und -Pyruvatcarboxylase zu finden sind. Falls es gewünscht ist, das „malic enzyme" (oder irgendein anderes Enzym mit einer mitochondrialen Targeting-Sequenz) nur im Cytosol zu exprimieren, kann die Targeting-Sequenz entfernt werden, indem man das Gen zweckdienlich verkürzt. Darüber hinaus können Enzyme, die einer Katabolit-Inaktivierung unterworfen sind, modifiziert werden, um diesen Regulationskreis zu verlangsamen oder zu verhindern, (Minard and Mc Alister-Henn [1992]).

Die vorliegende Erfindung kann auch ausgeführt werden, indem man einen Mikroorganismus mit einem rekombinanten DNA-Molekül transformiert, so dass der natürliche Promotor eines Wirtsgens, welches ein geeignetes Enzym codiert, das eine der Reaktionen (3'') bis (4'') katalysiert, durch einen anderen Promotor ersetzt wird, der eine stärkere Expression oder eine Expression unter unterschiedlichen physiologischen Bedingungen als der natürliche Promotor bewirken kann. Es ist nicht notwendig, dass das transformierende DNA-Molekül eine Nucleotidsequenz enthält, die ein vollständiges funktionelles Enzym codiert. Die nützliche Wirkung kann zum Beispiel dadurch erreicht werden, dass man den Wirt S. cerevisiae mit einem DNA-Molekül transformiert, das durch in vivo-Rekombination nur den natürlichen Promotor des GDH2 des Wirts mit einem Promotor wie z.B. PGK oder ADH ersetzt, so dass die NAD-abhängige Glutamatdehydrogenase des Wirts konstitutiv exprimiert wird. Wenn der Wirt durch einen Gen von einem anderen Organismus transformiert wird, ist es wünschenswert, einen Promotor zu verwenden, der von dem Wirt abgeleitet ist.

Für viele Produktionspilze und -bakterien sind geeignete Promotoren bekannt. Beispiele umfassen die Promotoren der PGK-, ACT-, ENO1-, GAPDH-, MET-Gene von S. cerevisiae, wie z.B. MET25- und ADH-Promotoren und modifizierte Versionen davon (z.B. Ruohonen et al., 1995; Beier und Young, 1982). Es ist in der Erfindung vorgesehen, dass zum Beispiel im Fall von S. cerevisiae die Verwendung dieser Promotoren selbst dann vorteilhaft sein kann, wenn das transformierte Gen oder die transformierten Gene von Hefe erhalten wurden. Diese können besonders vorteilhaft sein, wenn die Gene in das Genom des Wirts integriert werden sollen, weil diese Promotoren dafür bekannt sind, dass sie eine ausreichende Expression über einen Bereich von physiologischen Bedingungen hinweg bewirken. Zum Beispiel bewirkt der sogenannte „ADH-Promotor" mittlerer Länge eine effiziente Expression in S. cerevisiae sowohl unter fermentativen als auch gluconeogenen Wachstumsbedingungen. Eine ausreichende Expression des transformierten Gens oder der transformierten Gene kann jedoch auch mit den natürlichen Promotoren der Gene erreicht werden, beispielsweise durch eine Transformation mit einem Plasmid mit mehrfacher Kopienzahl, wie es in den Beispielen 3 bis 5 offenbart ist. Eine effiziente Expression unter gewünschten physiologischen Bedingungen kann auch durch Modifikationen des in Frage stehenden Promotors oder durch Modifikationen der trans agierenden regulatorischen Mechanismen (negative oder positive) erreicht werden, die an der Expression des jeweiligen Gens beteiligt sind.

Wenn fremde Gene in einen Organismus transformiert werden, ist es wünschenswert, mit einer DNA-Sequenz ohne Introns zu transformieren, die zum Beispiel aus einer cDNA oder aus einer künstlichen Synthese erhalten worden ist.

Jede beliebige auf dem Fachgebiet bekannte Methode zum Einführen oder Transformieren von Genen in den Wirt ist für diese Erfindung geeignet, und verschiedene Arten von Vektoren können verwendet werden, einschließlich autonom replizierende Plasmidvektoren oder künstliche Chromosomen. Auf dem Fachgebiet beschriebene Verfahren, um eine einzelne oder mehrere Kopien von transformierenden Genen in Chromosomen in einer funktionellen, exprimierbaren Form zu integrieren, sind ebenfalls für diese Erfindung geeignet. Beispiele für solche Verfahren für Hefe, Fadenpilze und Corynebakterien und andere Mikroorganismen sind beschrieben worden. Ein zweckdienliches Markergen kann in den transformierenden Vektor eingeschlossen werden, so dass Transformanten leicht selektiert werden können. Eine Co-Transformation mit einem zweiten Vektor, welcher ein selektierbares Markergen enthält, kann ebenfalls verwendet werden. Es ist ein weiter Bereich von Markergenen bekannt. Transformanten können auch durch Expression eines gewünschten Phänotyps selektiert werden, wie z.B. einer verstärkten Fähigkeit, auf Xylose unter anaeroben Bedingungen zu wachsen (siehe Beispiel 8).

Es ist in der Erfindung vorgesehen, dass es in manchen Fällen vorteilhaft sein kann, die Expression des transformierten Gens nur unter spezifischen Kulturbedingungen zu bewirken. Zum Beispiel kann es nützlich sein, den Organismus zuerst bis zu einer bestimmten Zelldichte wachsen zu lassen und dann die Expression des transformierenden Gens zu bewirken. Es sind Promotoren bekannt, die durch Veränderungen in der Temperatur oder im pH-Wert, spezielle Kohlenstoff- oder Stickstoffquellen oder durch das Vorhandensein oder das Fehlen von bestimmten organischen oder anorganischen Stoffen im Medium wie z.B. Phosphat oder Kupfer induziert werden können. Beispiele für Hefe-Promotoren, welche für eine solche induzierbare Expression eingesetzt worden sind, umfassen GAL1, GAL10, CUP1 und PHO5.

Die vorliegende Erfindung wird weiter durch die folgenden Beispiele veranschaulicht, welche die Konstruktion der Produktionsstämme der Erfindung beschreiben, ebenso wie deren Verwendung in den vorstehend angegebenen spezifischen Aspekten der Erfindung. Sofern nicht anderweitig angegeben, wurden alle biotechnologischen Prozeduren mit Hilfe von auf dem Fachgebiet gebräuchlichen Methoden durchgeführt.

Beispiel 1. Konstruktion des eine Integration enthaltenden („integrant") Stamms mit den XYL1- und XYL2-Genen von Pichia stipitis, welche Xylosereduktase und Xylitdehydrogenase codieren

Der auf pMA91 (Mellor et al., 1983) basierende Hefe-Expressionsvektor pAOS66 (1), welcher das XYL1 under der Kontrolle des PGK1-Promotors und das XYL2 unter der Kontrolle des modifizierten ADH1-Promotors (Ruohonen et al., 1995) enthält, wurde mit HindIII, um die 2,8 kb große Expressionskassette zu isolieren, die das XYL1-Gen zwischen dem Promotor und dem Terminator von PGK1 trägt, und mit BamHI verdaut, um die 2,2 kb große Expressionskassette zu isolieren, die das XYL2-Gen zwischen dem modifizierten ADH1-Promotor und dem ADH1-Terminator trägt. Das Plamid B955 (Toikkanen et al., 1998) wurde verwendet, um die Integrationskassette zu konstruieren. Bei B955 handelt es sich um den bakteriellen Clonierungsvektor Bluescript SK (Stratagene), welcher zwei Fragmente des URA3-Gens trägt (welches Orotidin-5'-P-Decarboxylase codiert, Rose et al., 1984); die Basenpaare 71-450 und 781-1135 von der codierenden Region des Gens an den SacI-Xba I-Stellen bzw. den XhoI-Asp718-Stellen der Polylinker-Region. Die verbleibenden Polylinker-Stellen HindIII und BamHI in dem Clonierungsvektor wurden dazu benutzt, die XYL1- und XYL2-Expressionskassetten durch Ligierung der klebrigen Enden zwischen die zwei URA3-Fragmente einzuführen. Die so erhaltene Konstruktion (5'URA3 71-450 bp - XYL2-Expressionskassette 3'-5' - XYL1-Expressionskassette 5'-3' - URA3 781-1135 3') wurde durch SacI-NsiI Verdauung aus Bluescript SK freigesetzt und aus einem Agarosegel isoliert. Ein &mgr;g des Fragments wurde eingesetzt, um den Hefestamm CEN.PK2 (VW-1B) (MAT &agr; leu2-3,112 ura 3-52 trp 1-289 his 3-&Dgr;1 MAL2-8c SUC2) (Boles et al., 1996) mit Hilfe der LiAc-Transformationsmethode (Hill et al., 1991, Gietz et al., 1992) zu transformieren. Der Stamm CEN.PK2 (VW-1B) wird von uns „Stamm H1346" genannt und er hat die VTT-Stammsammlungsnummer VTT C-98304.

Die Integrationsstrategie beruht auf der Toxizität von 5-FOA (5-Fluororotsäure) auf die Hefezellen (Boeke et al., 1984). Wildtypzellen wandeln 5-FOA in 5-FUMP (5-Fluoruridinmonophosphat) um, einem starken Hemmer der Thymidylatsynthetase. Daher können nur ura3-(und ura5-)Mutanten in Gegenwart von 5-FOA wachsen, solange wie dem mutierten Stamm Uracil zur Verfügung gestellt wird. Eine Integration des vorstehend beschriebenen Fragments in den URA3-Lokus zerstört das Wildtypgen und der Stamm wird für Uracil auxotroph, was es ihm ermöglicht, auf 5-FOA-Platten zu wachsen.

Die korrekte funktionelle Integration wurde durch das Southern-Blott-Verfahren, durch Messen der XR- und XDH-Aktivitäten in Zellextrakten überprüft und dadurch, dass man zeigte, dass der eine Integration enthaltende Stamm im Gegensatz zu dem nicht-transformierten CEN.PK2 (VW-1B)-Stamm in Züchtungen in Schüttelkolben nur auf Xylose wuchs. Der eine Integration enthaltende Stamm wurde H1469 genannt.

Beispiel 2. Clonierung des Saccharomyces cerevisae-Xylulokinase-Gens (SGD Nr. YGR 194C)

Das Xylulokinase-Gen (XK) wurde aus Gesamt-DNA von einem Wildtyphefestamm mittels PCR amplifiziert, wobei der Vorwärts-Primer 5' CCA GTG ATA TCG AGG ATG AGA TTA GTA C 3' und der Rückwärts-Primer 5' CCA GTG ATA TGT GTA CTT GTC AGG GCA T 3' eingesetzt wurden. Beide Primer enthalten eine EcoRV-Restriktionsstelle am 5'-Ende. Die PCR-Reaktionsbedingungen waren: 94°C 3' Heißstart, 94°C 1', 55°C 1', 72°C 2', 30 Zyklen, 72°C 10' finale Verlängerung. Das PCR-Produkt wurde mit EcoRV verdaut und von einem Agarosegel aufgereinigt. Das XK-Fragment wurde in den Vektor B609 (Bluescribe M13, Stratagene, mit dem modifizierten ADH1-Promotor und ADH1-Terminator) ligiert, der mit dem Klenow-Enzym behandelt worden war, um glatte Enden herzustellen. Die Orientierung des Fragments wurde mit den Enzymen BglII und EcoRI überprüft. Ein Clon mit der richtigen Orientierung wurde mit BamHI verdaut und das Fragment wurde aus einem Agarosegel aufgereinigt. Das BamHI-Fragment wurde in die BamHI-Stelle des Hefe-Expressionsvektors YEplac195 cloniert (Gietz und Sugino, 1988).

Beispiel 3. Co-Transformation des eine Integration enthaltenden Stamms H1469 mit den Genen, die Xylulokinase (XK) und NAD-abhängige Glutamatdehydrogenase (NAD-GDH) auf zwei getrennten Expressionsvektoren mit mehrfacher Kopienzahl codieren

Zwei Hefe-Expressionsvektoren, der vorstehend beschriebene YEplac195, welcher das die Xylulokinase codierende Gen trägt, und YEplac181, welcher das die NAD-abhängige Glutamatdehydrogenase codierende Gen GDH2 trägt (Boles et al., 1993), wurden in den eine Integration enthaltenden Stamm H1469 cotransformiert. Auf den Vektor YEplac195 wurde selektioniert, indem Uracil weggelassen wurde, und auf YEplac181, indem Leucin aus dem Wachstumsmedium weggelassen wurde. Eine Zurückgewinnung des Plasmids aus den Hefe-Transformanten bestätigte die Integrität der zwei Expressionsplasmide. Der Stamm, der sowohl das XK- als auch das NAD-GDH-codierende Gen trägt, wurde H1803 genannt (VTT C-98302). Ein Kontrollstamm, der das XK-codierende Gen und das Kontrollplasmid YEplac181 ohne GDH2 trug, wurde H1805 genannt (VTT C-98303).

Beispiel 4. Transformation des eine Integration enthaltenden Stamms H1469 mit dem die NAD-abhängige Glutamatdehydrogenase codierenden Gen auf einem Expressionsvektor mit mehrfacher Kopienzahl

Das vorstehend beschriebene Plasmid YEplac181, welches das Gen GDH2 trägt, das die NAD-abhängige Glutamatdehydrogenase codiert, wurde in den eine Integration enthaltenden Stamm H1469 transformiert. Die Selektion der Transformanten war wie vorstehend beschrieben. Eine Zurückgewinnung des Plasmids aus den Hefe-Transformanten bestätigte die Intergrität des Expressionsplasmids. Der Stamm, der das NAD-GDH codierende Gen trug, wurde H1795 genannt (VTT C-98300). Ein Kontrollstamm, der das Kontrollplasmid YEplac181 trug, wurde H1797 genannt (VTT C-98301).

Beispiel 5. Transformation des Hefestamms H1346 (CEN.PK2 (VW-1B)) mit dem NAD-abhängige Glutamatdehydrogenase codierenden Gen auf einem Expressionsvektor mit hoher Kopienzahl

Das vorstehend beschriebene Plasmid YEplac181, welches das GDH2-Gen trägt, welches die NAD-abhängige Glutamatdehydrogenase codiert, wurde in den Stamm CEN.PK2 (VW-1B) (= H1346) transformiert. Die Selektion der Transformanten war, wie vorstehend beschrieben. Eine Zurückgewinnung des Plasmids aus den Hefe-Transformanten bestätigte die Intergrität des Expressionsplasmids. Der Stamm, der das NAD-GDH codierende Gen trägt, wurde H1791 genannt (VTT C-98298). Ein Kontrollstamm, der das Kontrollplasmid YEplac181 trägt, wurde H1793 genannt (VTT C-98299).

Beispiel 6. Clonierung des offenen Leserahmens YKL029C, welcher das „malic enzym"-Homolog aus Saccharomyces cerevisae codiert

Das „malic enzyme" von S. cerevisiae ist charakterisiert worden (Fuck et al., 1973). Eine Analyse des Hefegenoms offenbarte einen offenen Leserahmen (ORF YKL029C) mit Homologie zu dem „malic enzyme" codierenden Gen aus Schizosaccharomyces pombe (Viljoen et al., 1994). Der S. cerevisiae-ORF YKL029C wurde mittels PCR aus chromosomaler Hefe-DNA amplifiziert, wobei der Vorwärts-Primer 5' CAT GCT AAG CTT CTA GAA TGC TTA GAA CCA GAC TA 3' und der Rückwärts-Primer 5' GAT GCT AAG CTT CTA GAT GGT TAT GCT TCG TCT AC 3' verwendet wurden. Beide Primer enthalten HindIII- und BglII-Restriktionsstellen am 5'-Ende. Die PCR-Reaktionsbedingungen waren: 94°C 3' Heißstart; 94°C 1', 40°C 1', 72°C 2', 30 Zyklen, 72°C 10' finale Verlängerung. Das erhaltene DNA-Fragment besaß die erwartete Größe. Das PCR-Fragment wurde mit dem zweckdienlichen Restriktionsenzym (BglII) verdaut, um dessen Clonierung zwischen den Promotor und den Terminator von PGK1 in dem Hefe-Expressionsvektor pMA9 zu ermöglichen.

Beispiel 7. Clonierung des „malic enzyme" codierenden Gens aus dem Fadenpilz Aspergillus nidulans

Bisher enthalten alle die aus verschiedenen Organismen clonierten Gene, die „malic enzyme" codieren, eine DNA-Sequenz, welche die kennzeichnende Struktur des „malic enzyme" codiert. Dabei handelt es sich um eine hoch konservierte, einzigartige Aminosäuresequenz (FNDDIQGTGAVVMASLI) dieses speziellen Proteins (Prosite: PDOC00294). Die kennzeichnende Stuktur ermöglicht es, spezifische degenerierte Primer für die Clonierung von jedem einzelnen Gen zu planen, das ein „malic enzyme" codiert.

Es wurden degenerierte Primer konstruiert, wobei die kennzeichnende Stuktur des „malic enzyme" (Region D) für den Primer am 3'-Ende und eine zweite homologe Region des Proteins, die Region C, für den Primer am 5'-Ende verwendet wurde (Viljoen et al., 1994). Der Vorwärts-Primer war 5' GA(T/C) GTI GGI ACI AA(T/C) AA 3' und der Rückwärts-Primer war 5' GTI CC(T/C) TG(A/G/T) AT(A/G) TC(A/G) TC(A/G) TT(A/G) AA 3'. Die PCR-Reaktionsbedingungen waren: 94°C 3' Heißstart; 94°C 1', 37°C 1', 72°C 2', 7 Zyklen, 94°C 1', 40°C 1', 72°C 2', 25 Zyklen, 72°C 10' finale Verlängerung. Chromosomale DNA von Aspergillus nidulans wurde als Matrize in der PCR-Reaktion eingesetzt. Es wurde ein Fragment mit der erwarteten Größe erhalten (0,24 kb), und 2 zeigt die Ausrichtung des PCR-Produkts mit einigen bekannten „malic enzymes". Eine partielle Aminosäuresequenz des „malic enzyme" von Aspergillus nidulans ist in SEQ ID NO: 1 dargestellt. Die erhaltene partielle Sequenz erlaubt die Konstruktion von weiteren Primern und kann selbst als Sonde für eine Southern-Hybridisierung verwendet werden, um das vollständige „malic enzyme" aus einer beliebigen DNA-Bank (z.B. cDNA, chromosomal, Lambda) zu clonieren. Das Gen, welches „malic enzyme" aus Trichoderma reesei, einem anderen Fadenpilz, codiert, kann ebenfalls cloniert werden. Eine partielle Aminosäuresequenz davon ist in der 2 eingefügt und auch in SEQ ID NO: 2 dargestellt.

Beispiel 8. Produktion von Ethanol aus Xylose Teil 1. Züchtungen in Schüttelkolben

Die Stämme H1803 und H1805 (siehe Beispiel 3) wurden in dem Wachstumsmedium gezüchtet, bei dem es sich um modifiziertes SC-URA-LEU (synthetisches Komplettmedium, bei dem Uracil und Leucin weggelassen wurden, Sherman et al., 1983) und Hefe-Stickstoffbase ohne Aminosäuren (Difco) und die Kohlenstoffquellen D-Glucose (20 g/l) oder D-Xylose (20 g/l) handelt. Man ließ die Zellen in Schüttelkolben in einem Medium vorwachsen, das Glucose als eine Kohlenstoffquelle enthielt. Die Zellen wurden mittels Zentrifugation aufgefangen und in einem Volumen von 100 ml eines Mediums resuspendiert, das Xylose als eine Kohlenstoffquelle enthielt. Die Zellen wurden bei 30°C in 100 ml-Erlenmayerkolben gehalten, worin sie mit einem Magnetstab sanft gerührt wurden. Anaerobiose wurde mit Hilfe einer Gaschleuse erreicht. Nach zwei Tagen Inkubation mit Xylose hatte der Stamm mit den erhöhten NAD-GDH-Spiegeln 2,35 g Ethanol/g Trockengewicht produziert und der Kontrollstamm produzierte 1,47 g Ethanol/g Trockengewicht. Die Menge an Ethanol wurde enzymatisch mit Hilfe eines automatisierten Analysegeräts gemessen (Cobas-Mira).

Die Glutamatdehydrogenase-Aktivität wurde in einem Rohextrakt von Hefezellen gemessen, welcher dadurch erhalten wurde, dass man 500 mg frische Zellen in 500 &mgr;l 100 mM Na-phosphat, pH 7,0 und 1 g Glaskügelchen (Durchmesser: 0,4 mm) für 15 Minuten auf einem Vortexgerät verwirbelt. Das Gemisch wurde dann in einer Tischzentrifuge zentrifugiert und der Überstand getestet. 200 &mgr;l eines Puffers, der 200 &mgr;M NAD(P)H und 100 mM Na-Phosphat, pH 7,4 enthielt, wurden mit 10 &mgr;l des 20-fach verdünnten Hefe-Rohextrakts gemischt. Um die Reaktion zu starten, wurden &agr;-Ketoglutarat (Endkonzentration 10 mM) und Ammoniumchlorid (Endkonzentration 20 mM) hinzugefügt. Die Rate der abnehmenden Extinktion bei 340 nm wurde gemessen und die Aktivität wurde daraus berechnet. Diese wird auf den Proteingehalt des Hefeextrakts bezogen, der mit einem BIORAD-Protein-test gemessen wird. Die NADP-GDH-Aktivität wurde gemessen, indem NADPH als ein Substrat eingesetzt wurde und die NAD-GDH-Aktivität wurde mit NADH als Substrat gemessen. Die NAD-GDH-Aktivität wurde in dem Überexpressionsstamm auf 4-5 nkat/mg geschätzt und in der Kontrolle ohne überexprimierte GDH2 auf 0,04 nkat/mg. Die NADP-GDH-Aktivität lag bei etwa 2 nkat/mg. Alle Tests wurden in einem automatisierten Cobas-Mira-Analysegerät durchgeführt.

Teil 2. Fermenterzüchtungen

Eine anaerobe Fermentation von Xylose zu Ethanol wurde in einem 1,8 Liter-Chemap CMF-Fermenter (Schweiz) mit gentechnologisch veränderten Stämmen von Saccharomyces cerevisae durchgeführt, welche als H1803 und H1805 bezeichnet werden. Beide Stämme sind von S. cerevisiae CEN.PK2 (VW-1B) abgeleitet (Boles et al., 1996) und exprimieren Xylosereduktase (XR) und Xylitdehydrogenase (XDH) über eine chromosomale Integration der entsprechenden Gene von Pichia stipitis. Darüber hinaus überexprimieren beide Stämme die native Xylulokinase (XK) von einem Plasmid mit mehrfacher Kopienzahl (YEplac195+XK). Der Stamm H1803 enthält ein zusätzliches Plasmid, welches die NAD-Glutamatdehydrogenase (NAD-GDH) von S. cerevisiae (YEplac181+GDH2) exprimiert, während der Stamm H1805 nur den Clonierungsvektor (YEplac181) enthält und als Kontrollstamm dient. Das Weglassen von Uracil (URA) aus dem Wachstumsmedium kann die Plasmidsegregation für den Vektor YEplac195 minimieren, und das Weglassen von Leucin (LEU) für den Vektor YEplac181.

Die Startkulturen der Stämme H1803 und H1805 wurden routinemäßig auf Platten gehalten, die alle 2-3 Wochen erneuert wurden. Das Vor-Inokulum wurde zubereitet, indem eine einzelne Kolonie in einen 250 ml Erlenmayerkolben überführt wurde, der 50 ml eines modifizierten synthetischen Komplettmediums ohne Uracil und Leucin (SC-URA-LEU) + 20 g/l Glucose enthielt (Sherman et al., 1983) enthielt. Für jeden Stamm wurden drei identische Kolben vorbereitet. Man ließ die Zellen über Nacht auf einem Rotationsschüttler bei 150 UpM und 30°C wachsen, und der Inhalt jedes Kolbens wurde dann vollständig in einen 3 l-Kolben mit Schikanen überführt, der 500 ml SC-URA-LEU plus 50 g/l Glucose enthielt, und man ließ die Zellen aerob bei 150 UpM und 30° C wachsen bis die Glucose erschöpft war (OD600: 20-25).

Die Zellen aus der vorstehenden Züchtung (sechs Kolben) wurden durch eine 10-minütige Zentrifugation bei 4500 UpM und 4° C geerntet, mit einem 0,1 M PO4 2--Puffer (pH 5,5) gewaschen und in dem gleichen Puffer jeweils in einem Endvolumen von 30 ml resuspendiert und anschließend in den Fermenter überführt. Das Fermentationsmedium enthielt SC-URA-LEU + 10% Xylose. Die Fermentertemperatur wurde bei 30° C konstant gehalten, der pH-Wert wurde durch Zugabe von 2 M NaOH bei 5,5 kontrolliert und das Rühren war konstant bei 300 UpM.

Die Züchtung wurde unter anaeroben Bedingungen durchgeführt, indem der Kopfraum des Fermenters mit einer konstanten Flussrate von 0,2 VVM mit Stickstoff geflutet wurde. Das Abgas war für eine online-Analyse über einen Mehrweghahn an ein Balzers-Quadrupol-Massenspektrometer (Schweden) angeschlossen. Flüssige Proben wurden in Zeitabständen aus dem Fermenter entnommen, um das Wachstum, den Substratverbrauch und die Bildung von extrazellulären Produkten zu messen. Für ausgewählte Proben wurden auch die Aktivitäten der NADP- und NAD-Glutamatdehydrogenasen mit Hilfe von enzymatischen Standardmethoden gemessen. Das Wachstum wurde verfolgt, indem sowohl die Extinktion bei 600 nm gemessen wurde als auch das Trockenzellgewicht (DCW) durch Filtration und anschließendes Trocknen bis zu einem konstanten Gewicht. Xylose, Ethanol, Xylit, Glycerin und Acetat, die in der Fermenterbrühe vorhanden waren, wurden auf einer HPX-87H-Säule (55°C) mit 5 mM H2SO4 als Eluent (0,6 ml/min) aufgetrennt und über die Ermittlung des Refraktionsindexes (RI) quantifiziert. Die Mengen an Ethanol, Glycerin, Xylit und Acetat wurden unabhängig durch geeignete enzymatische Tests mit Hilfe eines automatisierten Analysegeräts (Cobas-Mira) überprüft.

Das Wachstum und der Xylose-Verbrauch der Stämme H1803 und H1805 während der ersten 30 Stunden der Züchtung sind in 3 zusammengefasst. Beide Stämme können Xylose effizient mit vergleichbaren Raten verbrauchen, jedoch baut der NAD-GDH überexprimierende Stamm (H1803) etwa 6% weniger Biomasse auf (7,13 gegenüber 6,72 g/l). Der bemerkenswerteste Unterschied zwischen den zwei Stämmen besteht in der Ethanol-Produktion. Wie in 4 veranschaulicht, akkumuliert der GDH2-Stamm bis zum Ende der 30-stündigen Zeitdauer etwa 1,02 g Ethanol pro Gramm DCW, verglichen mit 0,73 bei dem Kontrollstamm. Dies stellt eine Verbesserung der spezifischen Ethanol-Produktion von ungefähr 40% für den GDH2-Stamm dar (0,58 gegenüber 0,83 mMol/g Zellen/h). Die volumetrische Produktivität ist bei dem GDH2-Stamm ebenfalls um etwa 30% höher (3,94 gegenüber 5,20 mMol/l h). Die entsprechenden Ausbeuten an Ethanol auf Xylose sind 0,21 und 0,29 (Mol/Mol) für den Kontroll- bzw. den GDH2-Stamm. Unerwarteterweise war die Xylitproduktion bei dem GDH2-Stamm ebenfalls um etwa 25% erhöht, wie wiederum in 4 gezeigt ist.

Ein noch anderer außergewöhnlicher Unterschied zwischen den zwei rekombinanten Stämmen ist in 5 dargestellt. Diese Kohlendioxid-Daten stammen von der Massenspektrometer-Messung des ausströmenden Gases. Wie in 5 gezeigt ist, schwächt die Überexpression von GDH2 die Bildung von Kohlenstoffdioxid deutlich ab. Die integrierten Werte für die CO2-Produktion von 0 bis 30 Stunden sind 100,4 und 80,7 mMol/l für den Kontroll- bzw. den GDH2-Stamm, d.h. der GDH2-Stamm verschwendet etwa 20% weniger der Kohlenstoffquelle an die Produktion von Kohlendioxid.

Enzymatische Tests für NADP-GDH und NAD-GDH wurden an ausgewählten Proben durchgeführt und die Ergebnisse von zwei solchen Sätzen sind in 6 gezeigt. Das Testgemisch enthielt 100 mM Natriumphosphatpuffer bei pH 7,0, 200 &mgr;M von entweder NADPH (NADP-GDH-Test) oder NADH (NAD-GDH-Test) und Zelllysat in einer Endkonzentration von etwa 0,5 mg/ml. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 20 mM &agr;-Ketoglutarat plus 40 mM NH4Cl gestartet, und der NAD(P)H-Verbrauch wurde spektrophotometrisch bei 340 nm verfolgt. Beide Stämme verfügen wie erwartet über beachtliche NADP-GDH-Aktivität, obgleich H1803 erstaunlicherweise eine höhere spezifische Aktivität für dieses Enzym aufzuweisen scheint (etwa 40% oder so). Andererseits liegt die NAD-GDH-Aktivität bei dem Kontrollstamm im Grunde genommen nahe an der Nachweisgrenze des Tests, wohingegen H1803 eine einigermaßen hohe spezifische Aktivität für dieses NAD-Enzym aufweist.

Diese Ergebnisse zeigen, dass der rekombinante Stamm H1803, welcher die NAD-Glutamatdehydrogenase überexprimiert, eine erheblich verbesserte Leistungsfähigkeit für die Produktion von Ethanol (und Xylit) aufweist, sowohl was die höheren spezifischen Produktivitäten angeht als auch höhere Produktausbeuten aus dem Kohlenstoffsubstrat. Der rekombinante Stamm erzeugt auch signifikant weniger (unerwünschte) Biomasse und sehr viel weniger (unerwünschtes) Kohlenstoffdioxid, wodurch nicht nur die Ausbeuten von erwünschten Produkten erhöht, sondern auch die Entsorgungs- und Verschmutzungslasten verringert werden.

Beispiel 9. Produktion von Ethanol aus Glucose

Die Fermentation von Glucose zu Ethanol wurde in einem 1,8 Liter-Chemap CMF-Fermenter (Schweiz) mit gentechnologisch veränderten Stämmen von Saccharomyces cerevisae durchgeführt, die als H1793 und H1791 bezeichnet werden, die beide von S. cerevisiae CEN.PK2 (VW-1B) abgeleitet sind (Boles et al., 1996). Der Stamm H1791 ist mit einem Plasmid transformiert, das die NAD-Glutamatdehydrogenase (NAD-GDH) von S. cerevisiae exprimiert (YEplac181+GDH2), wohingegen der Stamm H1793 nur den Clonierungsvektor (YEplac181) enthält und als ein Kontrollstamm dient. Die Plasmidsegregation kann dadurch minimiert werden, indem man Leucin (LEU) von dem Wachstumsmedium weglässt.

Das Inokulum wurde hergestellt, indem eine einzelne Kolonie in einen 250 ml-Erlenmeyerkolben überführt wurde, der 50 ml modifiziertes synthtisches Komplettmedium ohne Leucin (SC-LEU) + 20 g/l Glucose enthielt. Man ließ die Zellen über Nacht auf einem Rotationsschüttler bei 150 UpM und 30°C wachsen (OD600: 10-15). Die Zellen aus der vorstehenden Züchtung wurden durch eine 10-minütige Zentrifugation bei 4.500 UpM und 4°C geerntet, mit 0,1 M PO4 2--Puffer (pH 5,5) gewaschen und in dem gleichen Puffer jeweils in einem Endvolumen von 25 ml resuspendiert und anschließend in den Fermenter überführt. Das Fermentationsmedium enthielt (pro Liter): 3,4 g Hefe-Stickstoffbase (ohne Aminosäuren und ohne Ammoniak), 0,044 g Uracil, 0,164 g Tryptophan, 0,116 g Histidin, 5,055 g KNO3, 40 g Glucose. Die Fermentertemperatur wurde bei 30° C konstant gehalten, der pH-Wert wurde durch Zugabe von 2 M NaOH bei 5,5 kontrolliert und das Rühren war konstant bei 300 UpM. Die Züchtung wurde unter anaeroben Bedingungen durchgeführt, indem der Kopfraum des Fermenters mit einer konstanten Flussrate von 0,2 VVM mit Stickstoff geflutet wurde. Das Abgas war für eine Analyse während des Laufs über eines Mehrweg an eine Balzers Quadrupol-Massenspektrometer (Schweden) angeschlossen. Flüssige Proben wurden in Zeitabständen aus dem Fermenter entnommen, um das Wachstum, den Substratverbrauch und die Bildung von extrazellulären Produkten zu messen. Biomasse, Glucose, Ethanol, Glycerin und Acetat wurden wie in dem vorherigen Beispiel gemessen.

Tabelle 1 fasst die primären Fermentationsdaten für diese zwei Fermentationen zusammen. Der NAD-GDH-überexprimierende Stamm (H1791) baut während der 21-stündigen Zeitdauer im Durchschnitt 12% weniger Biomasse auf (0,52 gegenüber 0,46 g/l). Die spezifischen Glucoseverbrauchsraten sind für die zwei Stämme vergleichbar (innerhalb 5%). Der GDH2-Stamm weist jedoch sowohl eine höhere volumetrische (11%) als auch eine höhere spezifische (25%) Ethanol-Produktionsrate auf. Ein noch anderer außergewöhnlicher Unterschied zwischen den zwei rekombinanten Stämmen ist in 7 dargestellt. Diese Kohlendioxid-Daten stammen von der Massenspektrometer-Messung des ausströmenden Gases. Wie in 7 gezeigt ist, schwächt die Überexpression von NAD-GDH die Bildung von Kohlendioxid deutlich ab. Die integrierten Werte für die CO2-Produktion von 0 bis 21 Stunden sind 93,7 bzw. 70,6 mMol/l für den Kontroll- und den GDH2-Stamm, d.h. der GDH2-Stamm verschwendet etwa 25% weniger der Kohlenstoffquelle an die Produktion von Kohlendioxid. Die spezifische CO2-Produktionsrate für den GDH2-Stamm ist ebenfalls um etwa 15% verringert. Darüber hinaus ist die Ausbeute von Ethanol auf Glucose (Mol/Mol) für den GDH2-Stamm gegenüber dem Kontrollstamm schätzungsweise etwa 19% höher.

Diese Ergebnisse zeigen, dass der rekombinante Stamm H1791, welcher die NAD-Glutamatdehydrogenase (NAD-GDH) überexprimiert, eine erheblich verbesserte Leistungsfähigkeit für die Produktion von Ethanol aus Glucose aufweist, sowohl was die höheren spezifischen Produktivitäten angeht als auch höhere Produktausbeuten aus dem Kohlenstoffsubstrat. Der rekombinante Stamm erzeugt auch signifikant weniger (unerwünschte) Biomasse und weniger (unerwünschtes) Kohlendioxid, wodurch nicht nur die Ausbeuten von erwünschten Produkten erhöht, sondern auch die Entsorgungs- und Verschmutzunglasten verringert werden.

Tabelle 1. Glucosefermentationen mit dem rekombinanten Saccharomyces cerevisae-Stamm, der NAD-GDH überexprimiert (H1791), und dem Kontrollstamm (H1793): Vergleich des Wachstums, des Glucoseverbrauchs, der Produktion von Ethanol und die Bildungsraten von Kohlendioxid. Die letzten beiden Zeilen zeigen die berechneten durchschnittlichen Flussraten, ausgedrückt entweder in volumetrischen (Jv, mMol/h) oder spezifischen (Js, mMol/g Zellen/h) Angaben. Die Konzentrationen von Glucose und Ethanol stellen Durchschnittswerte aus vier Messungen dar: zwei mit HPLC- und zwei mit enzymatischen Tests.

Beispiel 10. Eine alternative Clonierungsstrategie des offenen Leserahmens YKL029C, welcher das „malic enzyme"-Homolog von Saccharomyces cerevisae codiert

Falls das Restriktionsenzym BgIII für die Clonierung des „malic enzyme"-Homologs zwischen den Promotor und den Terminator von PGK1 in dem Hefe-Expressionsvektor pMA91 verwendet wird, muss ein partieller Enzymverdau durchgeführt werden, da es eine interne BgIII-Stelle bei +227 bp der codierenden Region von „malic enzyme" gibt. Eine alternative Clonierungsstrategie war wie folgt: das PCR-Fragment wurde mit dem Restriktionsenzym HindIII verdaut und mit Klenow-Enzym behandelt, um glatte Enden herzustellen. Der Expressionsvektor pMA91 (Mellor et al., 1983) wurde mit dem Restriktionsenzym HindIII verdaut und das 1,8 kb große Fragment, welches den PGK1-Promotor und -Terminator enthielt, wurde von einem Agarosegel isoliert. Die Promotor-Terminator-Kassette wurde in den Vektor YEplac195 (Gietz und Sugino, 1988) ligiert, welcher in seine multiple Clonierungsstelle mit HindIII linearisiert worden war. Die Orientierung des Promotor-Terminator-Fragments in dem Expressionsvektor ist HindIII - PGK1-Promotor - PGK1-Terminator - EcoRI. Dieser Expressionsvektor wurde mit BglII verdaut und dann mit Klenow-Enzym behandelt, um glatte Enden für die Clonierung des „malic enzyme"-Homologs zwischen den Promotor und den Terminator von PGK1 zu erhalten.

Der über PCR clonierte ORF YKL029C wurde vollständig sequenziert. Es wurden zwei Punktmutationen beobachtet, die während der PCR-Amplifikation erzeugt worden waren, die zwei Aminosäuren in dem Enzym änderten; Leucin 341 zu Valin und Glutamin 620 zu Leucin. Diese Punktmutationen befanden sich weder in Regionen von konservierten Aminosäuren von „malic enzymes" (Viljoen et al., 1994) noch änderten sie die scheinbaren Km-Werte des PCR-amplifizierten Enzyms im Vergleich zu dem nativen Enzym wesentlich (die Aktivität des nativen Enzyms wurde mit dem Stamm H1346 gemessen; siehe Tabelle 2 und Fuck et al., 1973) und wurden daher als neutral angesehen. Die Erfindung kann mit dieser Genvariante oder mit einem nativen Gen, welches „malic enzyme" codiert, oder mit einer beliebigen anderen neutralen Variante ausgeführt werden.

Tabelle 2. Die scheinbaren Km-Werte für Malat, NAD+ und NADP+ des nativen und des PCR-amplifizierten „malic enzyme" von S. cerevisiae

Der Kontrollvektor YEplac195 und der gleiche Vektor mit dem „malic enzyme"-Homolog von S. cerevisiae unter der Kontrolle des PGK1-Promotors und -Terminators wurden in den Hefestamm CEN.PK2 (VW-1B) transformiert, um die Stämme H2189 (VTT C-99316) bzw. H2193 (VTT C-99317) zu erhalten.

Beispiel 11. Integration des Xylulokinase-Gens (YGR194C) in den eine Integration enthaltenden Stamm H1469

Eine Kassette für die Integration des Xylulokinase-Gens wurde mit den flankierenden Regionen von HIS3 und dem Kanamycin-Resistenzgen KMX2 für die Selektion konstruiert.

Der Hefe-Shuttlevektor pRS423 (Christianson et al., 1992) wurde mit DrdI verdaut, um ein 1,5 kb großes Fragment zu erhalten, welches das HIS3-Gen enthält, das Imidazolglycerin-P-hydratase codiert (Fink, 1964). Das Fragment wurde von einem Agarosegel isoliert, mit T4-Polymerase mit glatten Enden versehen und in die EcoRV-Stelle des bakteriellen Clonierungsvektors Bluescript SK (Stratagene) ligiert.

Das Plasmid pFA6-kann MX2 (Wach et al., 1994) wurde mit PvuII und SpeI verdaut, um das 1,4 kb große Kanamycin-Resistenzmodul zu isolieren. Das KMX2-Fragment wurde aus einem Agarosegel isoliert und mit Klenow-Enzym mit glatten Enden versehen. Der Bluescript SK, welcher das DrdI-Fragment von HIS3 trug, wurde mit NheI und BclI innerhalb des HIS3-Gens verdaut (was 50 bp von dessen codierender Region entfernt), mittels Klenow-Enzym mit glatten Enden versehen und vor der Ligierung mit dem isolierten KMX2-Fragment mit alkalischer Phosphatase aus Garnelen behandelt.

Das Xylulokinase-Gen unter der Kontrolle des modifizierten ADH1-Promotors und ADH1-Terminators in YEplac195 (siehe Beispiel 2) wurde nach einem BamHI-Verdau aus einem Agarosegel isoliert. Der Bluescript SK, welcher das DrdI-Fragment von HIS3 mit dem KMX2-Modul trug, wurde innerhalb des HIS3-Gens mit BglII verdaut (zwei nebeneinander liegende BglII-Stellen, die 60 bp aus dessen codierender Region entfernen) und wurde vor der Ligierung mit dem isolierten Xylulokinase-Fragment mit dem ADH1-Promotor und -Terminator mit alkalischer Shrimp-Phosphatase behandelt.

Die so konstruierte endgültige Integrationskassette enthielt 900 bp HIS3-Sequenz, das Xylulokinase-Gen (ADH1-Terminator, das XK-Gen, den modifizierten ADH1-Promotor), 50 bp HIS3 codierende Region, die KMX2-Kassette (Promotor, das Gen, Terminator) und 550 bp HIS3-Sequenz. Diese Konstruktion wurde von Bluescript SK durch einen Verdau mit BstBI und BssHI abgetrennt, was etwa 400 bp der HIS3-Sequenz auf jeder Seite für die zielgerichtete Integration übrig ließ.

Ein &mgr;g der von einem Agarosegel isolierten Integrationskassette wurde eingesetzt, um den Stamm H1469 zu transformieren, um den Stamm H2217 (VTT C-99318) zu erhalten. Die Durchmusterung auf eine Integration enthaltende Transformanten fand auf YPD-Platten mit 200 &mgr;g/ml G418 statt. Die korrekte Integration der XK-Kassette in den HIS3-Lokus wurde durch Southern-Hybridisierung, durch PCR und durch verstärktes Wachstum auf Xylulose im Vergleich zum Wildtyp überprüft.

Beispiel 12. Transformation der eine Integration enthaltenden Stämme H1469 und H2217 mit dem „malic enzyme" codierenden Gen auf einem Expressionsvektor mit mehrfacher Kopienzahl.

Das vorstehend beschriebene Plasmid YEplac195, welches das Gen MAE1 trägt, das „malic enzyme" unter der Kontrolle des Promotors und Treminators von PGK1 codiert (siehe Beispiel 6 oder 10), und das Kontrollplasmid YEplac195 wurden in die eine Integration enthaltenden Stämme H1469 und H2217 transformiert. Man selektierte auf die Plasmide durch Weglassen von Uracil aus dem Wachstumsmedium. Eine Zurückgewinnung der Plasmide aus den Hefe-Transformanten bestätigte die Integrität des Kontroll- und des Expressionsplasmids. Die erhaltenen Stämme wurden wie folgt bezeichnet: H1469 mit dem Kontrollplasmid als H2191 (VTT C-99319), H1469 mit dem „malic enzyme"-Plasmid als H2195 (VTT C-99320), H2217 mit dem Kontrollplasmid als H2221 (VTT C-99321) und H2217 mit dem „malic enzyme"-Plasmid als H2222 (VTT C-99322).

Beispiel 13. Wirkung des „malic enzyme": Produktion von Ethanol aus Glucose

Die Fermentation von Glucose zu Ethanol wurde in einem 1,8 Liter-Chemap CMF-Fermenter (Schweiz) mit gentechnologisch veränderten Saccharomyces cerevisae durchgeführt, die von S. cerevisiae CEN.PK2 (VW-1B) (Boles et al., 1996) abgeleitet waren, nachstehend als H1346 bezeichnet. Spezieller handelt es sich bei den zwei in diesem Beispiel eingesetzten Stämmen um die folgenden: H2193: (i) H1346, der mit einem Plasmid transformiert ist, welches das „malic enzyme" von S. cerevisiae exprimiert (MAE1, ORF YKL029c) oder (ii) H2189: H1346, der mit dem Clonierungsvektor (YEplac195) transformiert ist und als Kontrollstamm dient. Das Weglassen von Uracil (URA) aus dem Wachstumsmedium minimiert die Plasmidsegregation.

Das Inokulum wurde hergestellt, indem eine einzelne Kolonie in einen 250 ml-Erlenmeyerkolben überführt wurde, der 50 ml modifiziertes synthtisches Komplettmedium ohne Uracil (SC-URA) + 20 g/l Glucose enthielt. Man ließ die Zellen über Nacht auf einem Rotationsschüttler bei 150 UpM und 30°C wachsen (OD600: 10-15). Die Zellen aus der vorstehenden Züchtung wurden durch eine 10-minütige Zentrifugation bei 4.500 UpM und 4°C geerntet, mit 0,1 M Phosphat-Puffer (pH 5,5) gewaschen und in dem gleichen Puffer jeweils in einem Endvolumen von 25 ml resuspendiert und anschließend in den Fermenter überfährt. Das Fermentationsmedium enthielt (pro Liter): Hefe-Stickstoffbase (ohne Aminosäuren), Aminosäureergänzungen, 30 g Glucose. Die Fermentertemperatur wurde bei 30°C konstant gehalten, der pH-Wert wurde durch Zugabe von 2 M NaOH bei 5,5 kontrolliert und das Rühren war konstant bei 300 UpM. Die Züchtung wurde unter anaeroben Bedingungen durchgeführt, indem Stickstoff mit einer konstanten Flussrate von 0,1 vvm in die Brühe eingeblasen wurde. Flüssige Proben wurden in Zeitabständen aus dem Fermenter entnommen, um das Wachstum, den Substratverbrauch und die Bildung von extrazellulären Produkten zu messen. Biomasse, Glucose, Ethanol, Glycerin und Acetat wurden wie in dem vorherigen Beispiel gemessen.

Tabelle 3 fasst die Fermentationsergebnisse für diese zwei Fermentationen zusammen. Der MAE1 überexprimierende Stamm (H2193) verwendet ungefähr 20% weniger Kohlenstoff für die Synthese von Biomasse (3,27 gegenüber 2,60 C-Mol/g Zellen/h), was zu Biomasse-Enddichten führt, die im Vergleich zu der Kontrolle signifikant niedriger sind (1,33 gegenüber 2,20 g/l). Die spezifische Glucoseverbrauchsrate ist für den MAE1-Stamm ca. 20% höher. Wichtiger ist, dass der MAE1 eine etwa 25% höhere spezifische Ethanolproduktionsrate aufweist (18,85 gegenüber 23,64 C-mMol/g Zellen/h). Höhere spezifische Ethanol-Produktionsraten sind vorteilhaft in Prozessen, welche physikalisch durch die Menge an Biokatalysator beschränkt ist, der eingesetzt werden kann, z.B. Fermentationssysteme, in denen die Zellen immobilisiert sind. Darüber hinaus ist die Ausbeute an Ethanol auf Glucose für den MAE1 überexprimierenden Stamm etwa 4% höher im Vergleich zu der Kontrolle (0,478 gegenüber 0,499 C-Mol/C-Mol).

Die Ergebnisse offenbaren, dass der rekombinante S. cerevisiae-Stamm H2193, der das endogene „malic enzyme" (MAE1) überexprimiert, eine signifikant erhöhte Leistungsfähigkeit für die Produktion von Ethanol aus Glucose als der Kohlenstoffquelle aufweist. Der rekombinante Stamm produziert auch wesentlich weniger (unerwünschte) Zellmasse, wodurch nicht nur die Ausbeuten der erwünschten Produkte erhöht, sondern auch die Entsorgungslasten gesenkt werden.

Tabelle 3. Glucosefermentationen mit dem rekombinanten Saccharomyces cerevisae-Stamm, der MAE1 exprimiert (H2193), und dem Kontrollstamm (H2189): durchschnittliche Flussraten, ausgedrückt entweder in volumetrischen (Jv, mMol/h) oder spezifischen (Js, mMol/g Zellen/h) Angaben (Zeitintervall. 3,3 bis 29 Stunden). Die Konzentrationen von Glucose und Ethanol stellen Durchschnittswerte aus vier Messungen dar: zwei mit HPLC- und zwei mit enzymatischen Tests.

Das zuvor beschriebene Experiment wurde mit den folgenden Modifikationen wiederholt: (1) Die Größe des Bioreaktor-Inokulums wurde von etwa 0,1 g/l auf etwa 2 g/l erhöht und (2) zusätzlich zur Verwendung eines größeren Inokulums (ca. 2 g/l) wurde im Anschluss an das Aufbrauchen der Glucose (24 Stunden) eine konzentrierte Glucoselösung zu dem Fermenter hinzugegeben, um eine Glucose-Endkonzentration von etwa 45 g/l zu ergeben, und man ließ die Fermentation für weitere 24 Stunden ablaufen (Wiederholungs-Batch). Die primären Ergebnisse für die zwei Fälle waren wie folgt: (1) Eine Überexpression des „malic enzyme" führt zu höheren spezifischen Raten der Produktion von Ethanol (+9%) und des Glucoseverbrauchs (+20%), wobei weniger Glucose zu Biomasse umgeleitet wird (-16%); (2) eine Überexpression des „malic enzyme" erhöhte die spezifischen Ethanol-Produktionsraten um 6 und 8% für die ersten bzw. zweiten Phasen, wobei die entsprechenden Glucoseaufnahmeraten in den zwei Phasen ebenfalls um 16 und 17% höher waren. Die Biomasse-Startkonzentration von 2 g/l für beide Stämme stieg während der ersten Phase auf 5,73 g/l für den Stamm, der „malic enzyme" überexprimierte, bzw. auf 6,36 g/l für den Kontrollstamm (d.h. 10% weniger für MAE1). Die entsprechenden Werte für die zweite Phase waren 7,66 gegenüber 8,15 g/l (d.h. 6% weniger für MAE1).

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese drei Experimente offenbaren, dass der rekombinante S. cerevisiae-Stamm H2193, welcher das native „malic enzyme" (MAE1) überexprimiert, signifikant verbesserte Leistungsfähigkeiten bei der Ethanolproduktion aus Glucose als der Kohlenstoffquelle aufweist (die spezifischen Raten erhöhten sich bis zu 25%, die Ausbeuten stiegen um 4%). Der rekombinante Stamm produziert auch wesentlich weniger (unerwünschte) Zellmasse, wodurch nicht nur die Ausbeuten der erwünschten Produkte erhöht, sondern auch die Entsorgungslasten gesenkt werden.

Beispiel 14. Auswirkung des „malic enzyme": Produktion von Ethanol aus Xylose

Die Fermentation von Xylose zu Ethanol wurde in einem 1,8 Liter-Chemap CMF-Fermenter (Schweiz) mit gentechnologisch veränderten Saccharomyces cerevisae durchgeführt, die von S. cerevisiae CEN.PK2 (VW-1B) (Boles et al., 1996) abgeleitet waren, nachstehend als H1346 bezeichnet. Spezieller handelt es sich bei den vier in diesem Beispiel eingesetzten Stämmen um die folgenden: (i) H2195 H1346, der chromosomale Integrationen von Genen trägt, die Xylose-Reduktase (XR) und Xylitdehydrogenase (XDH) codieren (Stamm H1469), transformiert mit einem Plasmid, welches das „malic enzyme" von S. cerevisiae exprimiert (MAE1, ORF YKL029c), (ii) H2191: H1469, der mit dem Clonierungsvektor (YEplac195) transformiert ist und als Kontrolle für den Stamm H2195 dient. (iii) H2222: H1346, der chromosomale Integrationen von Genen trägt, die Xylose-Reduktase (XR), Xylitdehydrogenase (XDH) und Xylulokinase (XK) codieren (Stamm H2217), transformiert mit einem Plasmid, welches das „malic enzyme" von S. cerevisiae exprimiert (MAE1, ORF YKL029c), (iv) H2221: H2217, der mit dem Clonierungsvektor (YEplac195) transformiert ist und als Kontrolle für den Stamm H2222 dient. Das Weglassen von Uracil (URA) aus dem Wachstumsmedium minimiert die Plasmidsegregation.

Das Inokulum wurde hergestellt, indem eine einzelne Kolonie in einen 250 ml Erlenmeyerkolben überführt wurde, der 50 ml synthetisches Komplettmedium ohne Uracil (SC-URA) + 0,1 M Phosphat + 20 g/l Glucose enthielt. Man ließ die Zellen über Nacht auf einem Rotationsschüttler bei 150 UpM und 30°C wachsen und dann wurde die gesamte Brühe in einen 2 l-Kolben überführt, der 500 ml SC-URA + 0,1 M Phosphat + 50 g/l Glucose enthielt. Man ließ die Kultur wiederum über Nacht wie vorstehend beschrieben wachsen und die Zellen wurden durch eine 10-minütige Zentrifugation bei 4.500 UpM und 4°C geerntet. Die Zellen wurden dann mit 0,1 M Phosphat-Puffer (pH 5,5) gewaschen und in dem gleichen Puffer jeweils in einem Endvolumen von 100 ml resuspendiert und anschließend in den Fermenter überführt.

Das Fermentationsmedium enthielt (pro Liter): Hefe-Stickstoffbase (ohne Aminosäuren), Aminosäureergänzungen, 50 g Xylose. Die Fermentertemperatur wurde bei 30°C konstant gehalten, der pH-Wert wurde durch Zugabe von 2 M NaOH bei 5,5 kontrolliert und das Schütteln war konstant bei 300 UpM. Die Züchtung wurde unter anaeroben Bedingungen durchgeführt, indem Stickstoff mit einer konstanten Flussrate von 0,1 VVM in die Brühe eingeblasen wurde. Flüssige Proben wurden in Zeitabständen aus dem Fermenter entnommen, um das Wachstum, den Substratverbrauch und die Bildung von extrazellulären Produkten zu messen. Biomasse, Glucose, Ethanol, Glycerin und Acetat wurden wie in dem vorherigen Beispiel gemessen.

a) Anaerobe Xylosefermentationen mit den Stämmen H2195 und H2191

8 zeigt Zeitprofile für die Biomasse und die Trübung für den MAE1 überexprimierenden Stamm (H2195) und den Kontrollstamm (H2191). Beachten Sie, dass Saccharomyces cerevisae, welche Gene exprimieren, die XR und XDH codieren, generell Xylose verwerten können, jedoch nicht in der Lage sind, auf Xylose anaerob zu wachsen. Wie durch 8 veranschaulicht wird, hat die Überexpression des nativen „malic enzyme" in der Tat eine positive Wirkung auf die Lebensfähigkeit der Zellen unter diesen Bedingungen. In der graphischen Darstellung zeigt der Stamm H2195 ein anfängliches Wachstum auf Xylose sogar unter anaeroben Bedingungen, gefolgt von einer Abnahme an Biomasse nach 32 Stunden auf einen Wert, der dem des Inokulums entspricht. Die Biomasse der Kontrolle nimmt hingegen während derselben Zeitdauer stetig von einem anfänglichen Wert von 2,11 bis auf 1,47 g/l ab, das ist ein Rückgang der Biomasse um etwa 30%.

9 fasst die spezifischen metabolischen Gesamtraten (C-mMol/g Zellen/h) für diese zwei Batch-Fermentationen zusammen. Offensichtlich hat die Überexpression des „malic enzyme" über die Verhinderung des Zellabbaus hinaus auch eine positive Wirkung auf die Verwertung von Xylose und auf die Produktion von sowohl Ethanol als auch Xylit. Die Verwertung von Xylose ist um mehr als 55% verbessert, und die Produktivitäten an Ethanol und Xylit sind um etwa 20% bzw. 25% erhöht.

Diese Ergebnisse offenbaren, dass der rekombinante S. cerevisiae-Stamm H2195, welcher das native „malic enzyme" (MAE1) überexprimiert, eine deutlich verstärkte Leistungsfähigkeit für die Verwertung von Xylose ebenso wie für die Produktion von Ethanol und Xylit aus Xylose aufweist. Der rekombinante Stamm kann auch seine Lebensfähigkeit für ausgedehnte Zeiträume aufrecht erhalten.

b) Anaerobe Xylosefermentationen mit den Stämmen H2222 und H2221

Dieses Experiment wurde, wie in Teil a) beschrieben, durchgeführt, außer dass die Stämme H2195 und H2191 durch die Stämme H2222 und H2221 ersetzt wurden, die zusätzlich zu den Genen, die XR und XDH codieren, auch eine chromosomale Integration eines Gens tragen, welches die native XK codiert. Der Stamm H2222 überexprimiert das native „malic enzyme".

Aus 10 geht klar hervor, dass die Überexpression des „malic enzyme" eine signifikant verstärkende Wirkung auf die Produktion von Ethanol aus Xylose aufweist und auch dass dies über mehrere Tage hintereinander aufrecht erhalten werden kann.

Wie in 11 angegeben, liegt die Verbesserung der spezifischen Ethanol-Produktionsrate bei fast 30% im Vergleich zu der Kontrolle, und die spezifische Xylose-Verwertung liegt um etwa 5% höher. Darüber hinaus akkumuliert der Kontrollstamm wie in 12 angegeben, eine wesentlich höhere Menge von Biomasse über diesen 144-stündigen Zeitraum hinweg (2,03 gegenüber 1,47 g/l, d.h. ca. +40%). Dieses Verhalten scheint im Vergleich zu den im vorstehenden Teil a) beschriebenen Stämmen H2195 und H2191 unterschiedlich zu sein. Ein plausibler Grund für diesen Unterschied kann an der XK liegen, welche eine wichtige Rolle bei der Verwertung von Xylose spielen kann (beachten Sie, dass H2222 und H2221 chromosomale Integrationen der nativen XK tragen). Die in Teil b) beobachtete Abnahme an Biomasse stimmt jedoch gut mit der überein, die in Beispiel 13 beobachtet wird, das sich mit der Wirkung von MAE1 auf die Umwandlung von Glucose in Ethanol befasst. Darüber hinaus war die molare Ausbeute an Ethanol auf Xylose für den Stamm, der das „malic enzyme" überexprimiert, etwa 25% höher: 0,114 gegenüber 0,091 C-Mol Ethanol pro C-Mol Xylose.

Zusammengefasst offenbaren diese Experimente, dass die rekombinanten S. cerevisiae-Stämme H2195 und H2222, welche das native „malic enzyme" (MAE1) in einem genetischen Hintergrund ohne bzw. mit XK überexprimieren, eine wesentlich verbesserte Leistungsfähigkeit für die Verwertung von Xylose und die Produktion von Ethanol aus Xylose als dem Kohlenstoffsubstrat aufweisen (bis zu 30%). Darüber hinaus produziert der Stamm H2222 weniger (unerwünschtes) Acetat (-30%). In dem Hintergrund, in dem XK fehlt, ist nur der gemäß der Erfindung transformierte Mikroorganismus (H2195) in der Lage, unter den Prozessbedingungen zu überleben. Auf der anderen Seite produziert der gemäß der Erfindung transformierte Mikroorganismus (H2222) in dem Hintergrund mit XK, bei dem der nicht-transformierte Mikroorganismus überleben kann, wesentlich weniger (unerwünschte) Zellmasse (bis zu 40%), wodurch nicht nur die Ausbeuten von erwünschten Produkten erhöht, sondern auch die Entsorgungslasten gesenkt werden.

Beispiel 15: Konstruktion eines Integrationsvektors zur Expression des „malic enzyme" von S. cerevisiae codierenden Gens in Schizosaccharomyces pombe

Der Vektor YEplac195 mit dem „malic enzyme", einschließlich des PGK Promotors und -Terminators von Beispiel 10, wurde mit HindIII verdaut und das 3,7 kb große Fragment wurde aus einem Agarosegel isoliert. Dieses Fragment wurde mit Klenow-Enzym behandelt, um glatte Enden herzustellen. Dieses Fragment wurde dann in die SmaI-Stelle des Vektors pJK210 (ATCC 86957) ligiert. Der Vektor wurde zur Integration durch homologe Rekombination in das URA4-Gen mit AvrII verdaut.

Beispiel 16: Konstruktion eines Vektors mit hoher Kopienzahl zur Expression der Xylosereduktase und Xylitdehydrogenase von P. stipitis codierenden Gene in Schizosaccharomyces pombe

Das SacI-und NsiI-Fragment aus Beispiel 1, welches das Gen für Xylosereduktase unter der Kontrolle des PGK-Promotors und -Terminators und das Gen für Xylitdehydrogenase unter der Kontrolle eines modifizierten ADH1-Promotors und -Terminators enthält, wurde aus einem Agarosegel isoliert. Es wurde dann in den Vektor pSP1 (ATCC77497) ligiert, welcher das LEU2-Gen enthält, welches durch Verdauen mit PstI und SacI linearisiert war.

Beispiel 17: Transformation von Schizosaccharomyces pombe

Der linearisierte Vektor aus Beispiel 15 wurde durch Elektroporation (http://www.bio.uva.nl/pombe/handbook) in den S. pombe-Stamm ATCC 201400 transformiert. Ein Kontrollstamm wurde auf eine ähnliche Weise hergestellt, indem der leere Vektor pJK210 integriert wurde. Die Transformanten wurden auf URA-Auxotrophie selektioniert. Der Vektor mit mehrfacher Kopienzahl aus Beispiel 16 wurde auf dieselbe Weise transformiert. Die Transformanten wurden auf zusätzliche LEU-Auxotrophie selektioniert. Der so erhaltene Stamm wird H2369 (VTT C-99324) genannt und der Kontrollstamm ohne „malic enzyme"-Aktivität H2370 (VTT C-99324).

Beispiel 18: Wirkung von „malic enzyme": Produktion von Ethanol aus Xylose mit Schizosaccharomyces pombe

Die Fermentation von Xylose zu Ethanol wurde in einem 1,8 Liter-Chemap CMF-Fermenter (Schweiz) mit gentechnologisch veränderten Stämmen von Schizosaccharomyces pombe durchgeführt, die von dem S. pombe-Stamm H2153 (ATCC 201400) abgeleitet waren. Spezieller handelt es sich bei den zwei in diesem Beispiel eingesetzten Stämmen um die folgenden: (i) H2369: H2153, der eine chromosomale Integration von dem S. cerevisiae-Gen trägt, das „malic enzyme" codiert und mit einem Plasmid mit mehrfacher Kopienzahl transformiert ist, welches die Gene exprimiert, die Xylosereduktase (XR) und Xylitdehydrogenase (XDH) von Pichia stipitis codieren. (ii) H2370: H2153, der eine chromosomale Integration des Clonierungsvektors pJK210 trägt und mit einem Plasmid mit mehrfacher Kopienzahl transformiert ist, welches die Gene exprimiert, die Xylosereduktase (XR) und Xylitdehydrogenase (XDH) von Pichia stipitis codieren. Das Weglassen von Uracil (URA) und Leucin (LEU) aus dem Wachstumsmedium minimiert die Plasmidsegregation.

Das Inokulum wurde hergestellt, indem eine einzelne Kolonie in einen 250 ml-Erlenmeyerkolben überführt wurde, der 20 ml Edinburg-Minimalmedium (http://www. bio.uva.nl/pombe/handbook/section1/section1-8.html) mit hinzugefügten 225 mg/l Adenin, Histidin und Lysinhydrochlorid (EMM2 + ADE + HIS + LYS) + 20 g/l Glucose enthielt. Man ließ die Zellen etwa 50 Stunden auf einem Rotationsschüttler bei 200 UpM und 30°C wachsen und dann wurde die gesamte Brühe in einen anderen 250 ml-Kolben überführt, der 50 ml des gleichen Mediums enthielt. Man ließ die Zellen etwa 24 Stunden auf einem Rotationsschüttler bei 200 UpM, 30°C wachsen und dann wurde die gesamte Brühe in einen 2 l-Kolben überführt, der 700 ml EMM2 + ADE + HIS + LYS + 50 g/l Glucose enthielt. Man ließ die Kultur für etwa 40 Stunden wie vorstehend wachsen und die Zellen wurden dann durch eine 10-minütige Zentrifugation bei 4.000 UpM und 4°C geerntet. Die Zellen wurden dann mit 0,1 M Phosphat-Puffer (pH 5,5) gewaschen und in dem gleichen Puffer jeweils in einem Endvolumen von 100 ml resuspendiert, die OD600 beider Stämme wurde mit Puffer auf denselben Wert eingestellt, und anschließend wurden die Zellen in den Fermenter überführt. Das Fermentationsmedium enthielt EMM2 + ADE (225 mg/l) + HIS (450 mg/l) + LYS (450 mg/l) + 50 g/l Xylose.

Die Fermentertemperatur wurde bei 30°C gehalten, der pH-Wert wurde durch Zugabe von 2 M NaOH bei 5,5 kontrolliert und das Schütteln war konstant bei 300 UpM. Die Züchtung wurde unter mikroaeroben Bedingungen durchgeführt, indem ein Gemisch aus Stickstoff und Luft (7:1) mit einer konstanten Flussrate von 0,5 SLPM in die Brühe eingeblasen wurde, wodurch der Anteil von Sauerstoff im Einaluf demnach 2,5% war. Flüssige Proben wurden in Zeitabständen aus dem Fermenter entnommen, um das Wachstum, den Substratverbrauch und die Bildung von extrazellulären Produkten zu messen. Biomasse wurde entsprechend der OD600 gemessen und indem das Trockengewicht von Proben gemssen wurde. Glucose, Ethanol, Xylit, Glycerin und Acetat wurden mittels HPLC gemessen. Ethanol wurde auch mit Hilfe eines enzymatischen Tests mit Cobas-Mira gemessen.

13 zeigt Zeitprofile für die Biomasse und die Trübung für den Stamm H2369 und den Kontrollstamm H2370. Wie in 13 dargestellt ist, hat die Expression des „malic enzyme" in der Tat eine positive Wirkung auf die Lebensfähigkeit der Zellen unter diesen Bedingungen. Die Abnahme an Biomasse ist bei H2369 von 2,6 auf 1,9 g/l und bei dem Kontrollstamm H2370 von 2,43 auf 1,2 g/l. Ausgehend von sehr ähnlichen Biomassemengen, nimmt die Kontrolle um mehr als 50% ab und der gemäß der Erfindung transformierte Stamm um weniger als 30%. Demnach ist dies ein anderes Beispiel, welches offenbart, dass gemäß der Erfindung transformierte Stämme unter Bedingungen, unter denen Kontrollstämme eine geringe Fähigkeit aufweisen, zu überleben und ihre Biomasse und metabolische Kapazität aufrecht zu erhalten, eine verbesserte Fähigkeit haben, ihre Biomasse und folglich ihre metabolische Kapazität aufrecht zu erhalten. Die logarithmischen Durchschnittswerte der Biomasse während der Fermentation sind 2,23 g/l für H2369 und 1,74 g/l für H2370.

14 zeigt die volumetrischen Ethanol-Produktionsraten bei dem Stamm H2369 und dem Kontrollstamm H2370. Wie in 14 dargestellt ist die volumetrische Ethanol-Produktion bei H2369 im Vergleich zu dem Kontrollstamm H2370 wesentlich höher (+62%). Die spezifische Ethanol-Produktionsrate ist um 26% höher (0,386 gegenüber 0,305 C-mmol/g Zellen/h). Offensichtlich hatte die Expression von „malic enzyme" über die Verhinderung des Zellabbaus hinaus auch eine positive Wirkung auf die Produktion von Ethanol. Die volumetrische Verwertung von Xylose ist um 47% verbessert (9,7 g/l gegenüber 6,6 g/l). Auch die spezifische Rate ist verbessert (um etwa 15%; 1,45 gegenüber 1,26 C-mMol/g Zellen/h, Ergebnisse hier nicht gezeigt), was zeigt, dass die metabolische Kapazität der zusätzlichen Biomasse, die von dem transformierten Stamm aufrecht erhalten wurde, sogar noch größer war als die des Kontrollstamms.

Diese Ergebnisse offenbaren, dass der rekombinante S. pombe-Stamm H2369, welcher das „malic enzyme" von S. cerevisiae exprimiert, eine signifikant verbesserte Leistungsfähigkeit für die Verwertung von Xylose ebenso wie für die Produktion von Ethanol aus Xylose aufweist. Der rekombinante Stamm kann auch seine Lebensfähigkeit für ausgedehnte Zeiträume aufrecht erhalten. Darüber hinaus produziert der Stamm H2369 weniger (unerwünschtes) Acetat (-43%). Diese Ergebnisse sind mit Fermentationen von S. cerevisiae vergleichbar, die natives „malic enzyme" überexprimieren. Bei S. cerevisiae war die Verwertung von Xylose um 55% und die Ethanol-Produktion um 20% verbessert.

Beispiel 19: Clonierung des Gens für die NAD-verbundene Glutamatdehydrogenase von Peptostreptococcus asaccharolyticus

Man ließ Peptostreptococcus asaccharolyticus (ATCC 14963) anaerob wachsen und isolierte genomische DNA. Das Gen, welches die NAD-verbundene Glutamatdehydrogenase codiert, wurde dann gemäß der von Snedcor et al. (1991) veröffentlichten Sequenz mittels PCR cloniert, wobei die folgenden Oligonucleotide verwendet wurden: 5'-GAG GAT CCA TAG GAG CGC ATG TTG GAC C-3' und 5'-CAG GAT CCT CTG TTA GGG ATT TAC TCC-3'. DyNAzyme EXT-Polymerase (Finnzymes) wurde eingesetzt und das so erhaltene 2,4 kbp große PCR-Produkt wurde in den Vektor pCR 2.1 TOPO (Invitrogen) ligiert und gemäß den Vorschriften des Herstellers in TOP10F' - E. coli - Zellen (Invitrogen) transformiert.

Beispiel 20: Konstruktion eines E. coli - Corynebacterium glutamicum Shuttle-Vektors, welcher das NAD-verbundene Glutamatdehydrogenase codierende Gen von Peptostreptococcus asaccharolyticus enthält

Das Plasmid pAJ655, ein E. coli - Corynebacterium glutamicum-Shuttle-Vektor, wurde aus dem Corynebacterium glutamicum-Stamm ATCC 39135 isoliert und mit BamHI verdaut. Der Vektor wurde auf einem Agarosegel aufgereinigt und die Enden wurden mit alkalischer Phosphatase aus Garnelen dephosphoryliert.

Der Vektor pCR 2.1 TOPO mit dem die NAD-verbundene Glutamatdehydrogenase von Peptostreptococcus asaccharolyticus codierenden Gen aus Beispiel 19 wurde mit BamHI verdaut und das 2,4 kbp große Fragment aus einem Agarosegel isoliert. Das 2,4 kbp große Fragment wurde dann in den linearisierten Shuttle-Vektor ligiert und in E. coli DHS-&agr;-Zellen transformiert.

Beispiel 21: Transformation des Shuttle-Vektors in einen Stamm von Corynebacterium glutamicum

Die Stämme ATCC 21799 (E-991193) und ATCC 21253 (E-991192) von Corynebacterium glutamicum wurden mit dem in Beispiel 20 erhaltenen Shuttle-Vektor durch Elektroporation transformiert (Follettie, 1989). Diese Stämme wurden ausgewählt, weil sie entwickelt worden sind, um Lysin zu überproduzieren.

Das Plasmid wurde aus den transformierten Stämmen gewonnen, mit BamHI verdaut und die Verdauungsprodukte auf einem Agarosegel aufgetrennt wie in 15 gezeigt. In Spur 1 ist der verdaute Vektor von einer Transformante von ATCC 21253 und in Spur 3 der verdaute Vektor von einer Transformante von ATCC 21799, welche VTT E-991203 genannt wird. Die Figur zeigt den 10 kbp großen Vektor und die 2,4 kbp große Insertion. Ein zweites Isolat aus dem transformierten ATCC 21799 wurde VTT E-991204 genannt, und das Plasmid, welches aus diesem Isolat gewonnen wurde, verhielt sich auf die gleiche Weise wie in 15 für VTT E-991203 gezeigt.

Beispiel 22: Messung der NAD-verbundenen Glutamatdehydrogenase-Aktivität in Zellextrakten von Corynebacterium glutamicum

Zellextrakte von Corynebacterium glutamicum-Zellen wurden hergestellt, indem Zellen mit einem Feuchtgewicht von 500 mg, 500 &mgr;l 100 mM Natriumphosphat-Puffer (pH 7,0) und 500 &mgr;l Glaskügelchen für 20 Minuten bei 4°C in Eppendorfröhrchen von 1,5 ml auf einem Vortexgerät verwirbelt wurden. Die Röhrchen wurden bei 4°C und 13.000 UpM in einer Tischzentrifuge abzentrifugiert und der Überstand wurde analysiert. Der Puffer für den Aktivitäts-Test enthielt 100 mM Natriumphosphat (pH 7,0), 20 mM Ammoniumchlorid und 200 &mgr;M NADH. Die Reaktion wurde gestartet, indem &agr;-Ketoglutarat in einer Endkonzentration von 2 mM hinzugefügt wurde. Die Aktivität wurde anhand der Veränderung in der NADH-Extinktion bei 340 nm berechnet. Die Enzym-Test wurden bei 30°C durchgeführt. Die Menge von extrahiertem Protein wurde mit dem BioRad-Protein-Test gemessen, wobei IgG als Standard verwendet wurde. Man fand Enzym-Aktivitäten zwischen 0,1-0,2 nkat/mg für eine Transformante des Stamms ATCC 21253 und 0,1-0,2 nkat/mg für Transformanten des Stamms ATCC 21799, welche VTT E-991203 und VTT E-991204 genannt werden.

Beispiel 23: Produktion von Lysin durch transformiertes Corynebacterium glutamicum

Fermentation in Schüttelkolben: Die Stämme VTT E-991203 und VTT E-991204 wurden in Schüttelkolben-Fermentationen, wie von Kiss (1991) beschrieben, untersucht, außer dass es sich bei dem verwendeten Antibiotikum statt um Kanamycin um 10 mg/l Chloramphenicol handelte. Als eine Kontrolle ließ man den parentalen Stamm ATCC 21799 in Abwesenheit eines Antibiotikums wachsen. 1 ml von einer Vorkultur, die auf LB gewachsen war, wurde in 50 ml CGM1-Medium (Kiss, 1991) verdünnt und bei 30°C in 250 ml-Erlenmeyerkolben mit Schikanen auf einem Schüttler bei 250 UpM gezüchtet. Die Aminosäuren in den Überständen wurden mittels HPLC und Glucose mit einem Enzym-Test untersucht. Ergebnisse sind in der Tabelle 4 gezeigt.

Tabelle 4. Produktion von Lysin durch einen Kontrollstamm (ATCC 21799) und zwei erfindungsgemäße Transformanten von Corynebacterium glutamicum

Die zwei transformierten Stämme VTT E-991203 und VTT E-991204 wuchsen langsamer als die Kontrolle, weil sie (im Gegensatz zu der Kontrolle) Shuttle-Vektoren enthielten und in Gegenwart von Chloramphenicol gezüchtet wurden. Als die Lysinproduktion gemessen wurde, waren die Transformanten noch in Phase I der Fermentation, d.h. Threonin war noch vorhanden, wohingegen die Kontrolle nah an oder in der stationären Phase war und fast das gesamte Threonin aufgebraucht hatte. In Corynebacteria beginnt die Überproduktion von L-Lysin erst in Phase II, nachdem das Threonin verwertet ist (Vallino, 1991). Bemerkenswerterweise produzierten die Transformanten Lysin schon während der Phase I, und die Mengen an produziertem Lysin pro Gramm Biomasse waren nur 16% und 12% geringer als die durch die Kontrolle in dem für die Lysin-Überproduktion normalen Stadium produzierten (Phase II). Des Weiteren nahmen die Ausbeuten von Lysin auf verwerteter Glucose, die man von den Transformanten erhielt, deutlich zu, wenn die Transformanten während der Phase I wuchsen (von 0,105 g/g, als 49% des Threonins aufgebraucht war bis 0,15 g/g, als 63% des Threonins aufgebraucht waren). Für herkömmliche Lysin-überproduzierende Stämme von Corynebacterium glutamicum sind die erwarteten Lysinausbeuten auf verwerteter Glucose in diesem Stadium der Fermentation nahe bei Null (Vallino, 1991). Es ist offensichtlich, dass, wenn die Transformanten aus der Phase I in das für die Überproduktion von Lysin normale Stadium kommen (wenn das Wachstum abgeschlossen ist und Glucose nicht mehr in die Produktion von Biomasse umgeleitet wird), die Raten und die Ausbeuten an Lysinproduktion diejenigen der Kontrolle übersteigen werden. Es ist den Fachleuten klar, dass das langsame Wachstum der Transformanten dadurch gesteigert werden kann, dass man das Gen für die NAD-verbundene Glutamatdehydrogenase in die Genome der Transformanten integriert, wodurch man den Nachteil vermeidet, ein Plasmid aufrecht zu erhalten und die Notwendigkeit für Chloramphenicol in dem Wachstumsmedium eliminiert.

Dieses Beispiel offenbart, dass die Transformation eines Lysin-überexprimierenden Stamms von Corynebacterium glutamicum mit einem Gen für NAD-verbundene Glutamatdehydrogenase gemäß der Erfindung die Produktion von Lysin durch die Transformante mindestens während der frühen Wachstumsstadien verbessert. Es wird erwartet, dass man eine wesentliche Verbesserung der Lysinausbeuten auf Glucose erhalten wird, wenn die Fermentationen mit Transformanten in die Phase II weitergeführt werden.

Beispiel 24: Co-Expression der Gene von Alcaligenes eutrophus, welcher Polyhydroxybuttersäure (PHB)-Reduktase und PHB-Synthase codiert, mit dem Gen, welches die NAD-abhängige Glutamatdehydrogenase von S. cerevisiae codiert, oder dem Gen, welches „malic enzyme" von S. cerevisiae codiert

Da Plasmid pRS303 (Sikorski und Hieter, 1989) wurde mit SacI und XbaI verdaut und aus einem 0,7% Agarosegel isoliert. Das 4,8 kbp große GDH2-Fragment (welches das Gen mit seinem eigenen Promotor enthält) auf einer SacI/XbaI-Kassette (Boles et al., 1993) wurde in den Vektor pRS303 ligiert, wodurch das Plasmid pGDH2-303 erzeugt wurde. Der 2 Mikron-Replikationsursprung wurde mit EcoRI aus dem Plasmid pLGSD5 (Guarente et al., 1982) herausgeschnitten und die Enden mit dem großen Fragment der Klenow-Polymerase in glatte Enden überführt. Der Replikationsursprung wurde dann in pRS303 ligiert, was das Plasmid pTL92 erzeugte.

Das Plasmid pGDH2-303 wurde mit SmaI verdaut und eine Doppelbande von ~4,8 kbp, die sowohl das GDH2-Fragment (4,8 kbp) als auch den Basisvektor (4,5 kbp) enthielt, wurde aus einem Agarosegel isoliert. Die wiedergewonnenen Fragmente wurden dann mit KpnI verdaut. Diese Verdauung spaltet den Basisvektor (pRS303) in zwei Fragmente, was somit die Isolierung der 4,8 kbp großen Bande ermöglicht, welche das GDH2-Fragment enthält. Das Plasmid pTL92 wurde mit SmaI linearisiert und aus einem Agarosegel isoliert. Der linearisierte Vektor wurde mit CIAP (alkalische Kälberdarmphosphatase) bei 37°C für eine Stunde dephosphoryliert und dann auf einem Agarosegel aufgereinigt. Das mit glatten Enden versehene GDH2-Fragment und der mit glatten Enden versehene Vektor pTL92 wurden ligiert, womit p2-GDH2 erzeugt wurde.

Das Plasmid p2-GDH2 kann in den S. cerevisiae-Stamm D603 (MAT&agr;/MATa, ura3-52, lys2-801, met, his3, ade2-101, regt-501; Srienc et al., 1986) transformiert werden, welches die heterologen Gene von Alcaligenes eutrophus exprimiert, die PNB-Reduktase und PHB-Synthase auf dem Plasmid mit mehrfacher Kopienzahl p2DPT mit einem bidirektionalen, induzierbaren Galactose-Promotor (Carlson, 1999) codieren. Züchtungen in Schüttelkolben und Fermentern mit zweckdienlichen Kontrollen können in angereichertem SD-Medium (DaSilva, 1988) durchgeführt werden, das jeweils 10 g/l Glucose und Galactose enthält. Der PHB-Gehalt von Kontrollzellen und Zellen, die gemäß der Erfindung transformiert worden sind, wird durch GC-Analyse von Dichlorethan-Extrakten von getrocknetem Zellmaterial bestimmt, welches einer Propanolyse unterzogen wurde (Riis und Mai, 1988; Leaf et al., 1996). Der Zuckerverbrauch und Gasaustausch werden mit Standardmethoden gemessen. Auf diese Weise können die von der Erfindung erwarteten Vorteile wie z.B. eine erhöhte Ausbeute von PHB auf Glucose, eine erhöhte Produktivität, eine verringerte CO2-Produktion und ein verringertes Sauerstoffbedürfnis gezeigt werden.

Es ist klar, dass das 3,8 kbp große Fragment mit dem MAE1-Gen zwischen dem Promotor und dem Terminator von PGK1 (siehe Beispiel 10) cloniert und in der Hefe D603 mit einer ähnlichen Strategie exprimiert werden kann, wie sie für das GDH2-Gen verwendet worden ist.

Ähnliche Strategien können verwendet werden, um Gene für Dehydrogenasen gemäß der Erfindung in andere Mikroorganismen einzuführen, welche PHB und andere PHAs produzieren, einschließlich Bakterien, welche bereits für die industrielle Produktion von PHAs eingesetzt werden, wie z.B. Alcaligenes eutrophus. Zu vorteilhaften Enzymen gehört die NAD-verbundene Glutamatdehydrogenase von Peptostreptococcus asaccharolyticus, die in Beispiel 21 dazu verwendet worden ist, um ein anderes Bakterium, Corynebacterium glutamicum, zu transformieren.

Hinterlegte Mikroorganismen

Die folgenden Mikroorganismen wurden unter den Bestimmungen des Budapester Vertrags bei der DSMZ – Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Deutschland hinterlegt.

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SEQUENZPROTOKOLL


Anspruch[de]
Mikroorganismus, transformiert mit mindestens einem rekombinanten DNA-Molekül, codierend oder anderweitig die Expression bewirkend von zumindest einem der Enzyme ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus "malic enzyme", Glutamatdehydrogenase, Aldehyd-dehydrogenase, Malatdehydrogenase, Glycerol-3-phosphat-dehydrogenase, Xylose-1-dehydrogenase, Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase, Orotatreduktase und Ferredoxinreduktase, welches die funktionelle Kupplung der Oxidation und Reduktion von Substraten durch zwei Pyridinnucleotidverbundene Dehydrogenase-Reaktionen bewirkt, die ein gemeinsames Substrat teilen und die verschiedene Spezifitäten für die NAD/NADH- und NADP/NADPH-Coenzympaare haben, und so den Transfer von Elektronen zwischen den beiden Coenzympaaren durch die Substrate unterstützt, wodurch der transformierte Mikroorganismus verwendbare Produkte effizienter herstellen kann als der entsprechende nicht-transformierte Mikroorganismus. Mikroorganismus nach Anspruch 1, wobei der Mikroorganismus mehr Produkt pro Einheit des Ausgangsmaterials herstellt als der entsprechende nicht-transformierte Mikroorganismus. Mikroorganismus nach Anspruch 1, wobei der Mikroorganismus ein Produkt schneller herstellt als der entsprechende nicht-transformierte Mikroorganismus. Mikroorganismus nach Anspruch 1, wobei der Mikroorganismus weniger CO2 pro Einheit des hergestellten Produktes produziert als der entsprechende nicht-transformierte Mikroorganismus. Mikroorganismus nach Anspruch 1, wobei der Mikroorganismus einen geringeren Sauerstoffbedarf pro Einheit des hergestellten Produktes hat als ein entsprechender nicht-transformierter Mikroorganismus. Mikroorganismus nach Anspruch 1, der unter den Bedingungen eines biotechnologischen Verfahrens einen höheren Grad an metabolischer Kapazität aufrechterhält, der für das Verfahren erforderlich ist, als der entsprechende nicht-transformierte Mikroorganismus. Mikroorganismus nach Anspruch 6, wobei die erforderliche metabolische Kapazität eines entsprechenden nicht-transformierten Mikroorganismus unter den Bedingungen des biotechnologischen Verfahrens mit der Zeit abnimmt. Mikroorganismus nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das Produkt Ethanol ist. Mikroorganismus nach Anspruch 8, wobei das Ethanol von einer Pentose stammt. Mikroorganismus nach Anspruch 8, wobei das Ethanol von einer Hexose stammt. Mikroorganismus nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das Produkt eine oder mehrere Aminosäuren ist. Mikroorganismus nach Anspruch 11, wobei die Aminosäure Lysin ist. Mikroorganismus nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das Produkt Polyhydroxyalkanoat ist. Mikroorganismus nach Anspruch 13, wobei das Polyhydroxyalkanoat Polyhdroxybutyrat ist. Mikroorganismus nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das Produkt ein Pentit ist. Mikroorganismus nach Anspruch 15, wobei das Pentit Xylit ist. Mikroorganismus nach einem der Ansprüche 1 bis 16, wobei der Mikroorganismus eine Hefe ist. Mikroorganismus nach Anspruch 17, wobei der Mikroorganismus ein Stamm von Saccharomyces spp., Schizosaccharomyces spp. oder Pichia spp. ist. Mikroorganismus nach Anspruch 9, welcher ein Stamm von Saccharomyces spp. oder Schizosaccharomyces spp. ist, der Gene exprimiert, die Xylosereduktase und Xylitdehydrogenase codieren, und welcher transformiert ist mit dem mindestens einen rekombinanten DNA-Molekül, das ein Enzym, welches eine Pyridinnucleotidverbundene Dehydrogenase ist, codiert oder anderweitig seine Expression bewirkt. Mikroorganismus nach Anspruch 19, welcher ferner ein Gen exprimiert, das Xylulokinase codiert. Mikroorganismus nach einem der Ansprüche 1 bis 16, wobei der Mikroorganismus ein Bakterium ist. Mikroorganismus nach Anspruch 21, wobei der Mikroorganismus ein Stamm von Corynebacteria oder Brevibacteria ist. Saccharomyces cerevisiae-Stämme, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus H1791 (VTT C-98298, DSM 12213), H1795 (VTT C-98300, DSM 12214), H1803 (VTT C-98302, DSM 12215), H2193 (VTT C-99317, DSM 12722), H2195 (VTT C-99320, DSM 12723) and H2222 (VTT C-99322, DSM 12724). Schizosaccharomyces pombe-Stämme, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus H2369 (VTT C-99323, DSM 12725) und H2370 (VTT C-99324, DSM 12726). Corynebacteria-Stämme, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus VTT E-991203 (DSM 12728) und VTT E-991204 (DSM 12729). Verfahren zur Herstellung verwendbarer Produkte aus Ausgangsmaterialien, umfassend die Schritte der Fermentierung der Ausgangsmaterialien mit einem Mikroorganismus nach Anspruch 1. Verfahren nach Anspruch 26, wobei die Ausgangsmaterialien Pentose, Pentosepolymere oder Gemische davon umfassen. Verfahren nach Anspruch 26, wobei die Ausgangsmaterialien Hexose, Hexosepolymere oder Gemische davon umfassen. Verfahren nach Anspruch 27, wobei ein Pentit hergestellt wird. Verfahren nach Anspruch 29, wobei das Pentit Xylit ist. Verfahren nach einem der Ansprüche 26 bis 28, wobei Ethanol hergestellt wird. Verfahren nach einem der Ansprüche 26 bis 28, wobei eine oder mehrere Aminosäuren hergestellt werden. Verfahren nach Anspruch 32, wobei die Aminosäure Lysin ist. Verfahren nach einem der Ansprüche 26 bis 28, wobei ein oder mehrere Polyhydroxyalkanoate hergestellt werden. Verfahren nach Anspruch 34, wobei das Polyhydroxyalkanoat Polyhydroxybutyrat ist. Verfahren zur Herstellung von Ethanol aus Ausgangsmaterialen umfassend Pentosen, Pentosepolymere oder Gemische davon, umfassend den Schritt der Fermentierung der Ausgangsmaterialien mit einem Mikroorganismus nach einem der Ansprüche 17, 19 und 20.






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