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Dokumentenidentifikation DE60127470T2 29.11.2007
EP-Veröffentlichungsnummer 0001498489
Titel Herstellung von Ascorbinsäure in Hefen
Anmelder Tate & Lyle Ingredients Americas, Inc., Decatur, Ill., US
Erfinder Porro, Danilo, 22036 Erba (CO), IT;
Sauer, Michael, 6841 Maeder, AT
Vertreter derzeit kein Vertreter bestellt
DE-Aktenzeichen 60127470
Vertragsstaaten AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, SE, TR
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 02.08.2001
EP-Aktenzeichen 040234585
EP-Offenlegungsdatum 19.01.2005
EP date of grant 21.03.2007
Veröffentlichungstag im Patentblatt 29.11.2007
IPC-Hauptklasse C12P 17/04(2006.01)A, F, I, 20051017, B, H, EP
IPC-Nebenklasse C12N 1/19(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   C12N 15/53(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   C12N 15/55(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   

Beschreibung[de]
HINTERGRUND DER ERFINDUNG 1. GEBIET DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein das Gebiet der Ascorbinsäureherstellung. Genauer gesagt betrifft sie ein Verfahren für die Herstellung von L-Ascorbinsäure aus Hefe einschließlich rekombinanter Hefe.

2. BESCHREIBUNG DES BETREFFENDEN FACHGEBIETS

L-Ascorbinsäure (Vitamin C) ist ein kräftiges wasserlösliches Antioxidationsmittel, das lebensnotwendig für das Wachstum und die Aufrechterhaltung aller Gewebetypen bei Menschen ist. (Padh H., 1990, Biochem. Cell Biol. 68, 1166–1173). Eine wichtige Rolle von Ascorbinsäure ist ihre Beteiligung an der Herstellung von Collagen, einer wesentlichen zellulären Komponente für Bindegewebe, Muskeln, Sehnen, Knochen, Zähne und Haut. Collagen ist auch für die Wiederherstellung von Blutgefäßen, Blutergüssen und gebrochenen Knochen erforderlich. Ascorbinsäure hilft, den Blutdruck zu regulieren, trägt zu verringerten Cholesterinspiegeln bei und hilft bei der Entfernung von Cholesterinablagerungen aus Arterienwänden. Ascorbinsäure hilft auch bei der Metabolisierung von Folsäure, reguliert die Aufnahme von Eisen und ist für die Umwandlung der Aminosäuren L-Tyrosin und L-Phenylalanin in Noradrenalin erforderlich. Die Umwandlung von Tryptophan in Seratonin, das Neurohormon, verantwortlich für Schlaf, Schmerzbekämpfung und Wohlgefühl, erfordert ebenfalls adäquate Zuführungen von Ascorbinsäure.

Ein Mangel an L-Ascorbinsäure kann die Herstellung von Collagen beeinträchtigen und zu Gelenkschmerz, Anämie, Nervosität und verzögertem Wachstum führen. Andere Auswirkungen sind verringerte Immunantwort und erhöhte Anfälligkeit für Infektionen. Die extremste Form von Ascorbinsäuremangel ist Skorbut, ein Leiden, augenscheinlich durch Anschwellen der Gelenke, blutendes Zahnfleisch und das Bluten von Kapillaren unter der Oberfläche der Haut. Wenn der Skorbut unbehandelt bleibt, ist er tödlich.

Obwohl die Därme Ascorbinsäure leicht absorbieren, wird sie innerhalb von zwei bis vier Stunden nach der Einnahme in den Urin ausgeschieden. Daher kann sie nicht im Körper gelagert werden. L-Ascorbinsäure wird in allen höheren Pflanzen und in der Leber oder Niere von den meisten höheren Lebewesen, aber nicht Menschen, Fledermäusen, einigen Vögeln und einer Vielzahl von Fischen, hergestellt. Daher müssen Menschen Zugang zu ausreichenden Mengen von Ascorbinsäure aus adäquaten Nahrungsmittelquellen oder -ergänzungsstoffen haben, um optimale Gesundheit aufrecht zu erhalten.

Zu Lebensmittelquellen von Ascorbinsäure gehören Citrusfrüchte, Kartoffeln, Paprikafrüchte, grüne Blattgemüse, Tomaten und Beeren. Ascorbinsäure ist auch im Handel als Ergänzungsstoff in Formen wie beispielsweise Pillen Tabletten, Pulver, Oblaten und Sirupe erhältlich.

L-Ascorbinsäure ist zur Verwendung als Nahrungsmittelergänzungsstoff und chemisches Konservierungsmittel durch die US Food and Drug Administration genehmigt und ist auf der FDA-Liste von Substanzen, die allgemein als sicher anerkannt sind. L-Ascorbinsäure kann in Softdrinks als Antioxidationsmittel für Aromabestandteile, in Fleisch und fleischhaltigen Produkten, zum Konservieren und Einpökeln, in Mehl zur Verbesserung der Backqualität, in Bier als Stabilisator, in Fetten und Ölen als Antioxidationsmittel und in einer weiten Vielfalt von Lebensmitteln zur Ascorbinsäureanreicherung verwendet werden. L-Ascorbinsäure kann auch Verwendung in Fleckenentfernern, Haarpflegeprodukten, der Kunststoffherstellung, Photographie und Wasserbehandlung finden.

Die Enzyme der Biosynthesewege, die zu Ascorbinsäure führen, sind noch nicht bis zur Vollständigkeit identifiziert worden. Das gegenwärtige Verständnis der physiologischen Wege in Pflanzen und Tieren ist in 1 gezeigt.

Bei Tieren dient D-Glucose als die erste Vorstufe, und der letzte Schritt wird durch eine mikrosomale L-Gulono-1,4-lacton-Oxidase katalysiert. Das Enzym ist aus verschiedenen Quellen isoliert und charakterisiert worden. Das Gen aus der Ratte ist kloniert und sequenziert worden (Koshizaka T. et al., 1988, J. Biol. Chem. 263, 1619–1621).

Zwei unterschiedliche Wege sind für Ascorbinsäuresynthese in Pflanzen berichtet worden. Auf einem Weg wird L-Ascorbinsäure aus D-Glucose über L-Sorboson synthetisiert (Loewus M. W. et al., 1990, Plant Physiol. 94, 1492–1495). Die gegenwärtige Beweislage läßt vermuten, daß der hauptsächliche physiologische Weg von D-Glucose über L-Galactose und L-Galactono-1,4-lacton zu L-Ascorbinsäure verläuft (Wheeler G. L. et al., 1998, Nature, 393, 365–369). Die letzten zwei Schritte werden durch die Enzyme L-Galactose-Dehydrogenase und L-Galactono-1,4-lacton-Dehydrogenase katalysiert. Auch in diesem Fall wurde das letzte Enzym isoliert und charakterisiert und das Gen aus Brassica oleracea wurde kloniert und sequenziert (Østergaard J. et al. 1997, J. Biol. Chem, 272, 30009–30016).

Zur Verwendung als Nahrungsmittelzusatz kann Ascorbinsäure aus natürlichen Quellen isoliert oder chemisch durch die Oxidation von L-Sorbose wie in Variationen des Reichstein-Prozesses synthetisiert werden (US-Patentschrift 2265121).

Es bleibt wünschenswert, Methoden für die Herstellung von Ascorbinsäure durch geeignete Verfahren zu haben. Zwei Hauptanforderungen bei der Herstellung von Ascorbinsäure sind, daß die Synthese enantioselektiv sein sollte, weil nur das L-Enantiomer von Ascorbinsäure biologisch aktiv ist, und daß die Umgebung der finalen Schritte des Verfahrens nicht oxidativ sein sollte, weil Ascorbinsäure sehr leicht oxidiert wird.

Eine mögliche Herangehensweise ist die Herstellung von L-Ascorbinsäure aus Mikroorganismen. Mikroorganismen können leicht in einem industriellen Maßstab gezüchtet werden. Obwohl die Herstellung von L-Ascorbinsäure aus Mikroorganismen und Pilzen in der Vergangenheit berichtet worden ist, belegt kürzliches Beweismaterial, daß L-Ascorbinsäureanaloge und nicht L-Ascorbinsäure erzeugt werden (Huh W. K. et al. 1998, Mol. Microbiol. 30, 895–903) (Hancock R. D. et al., 2000, FEMS Microbiol. Let. 186, 245–250) (Dumbrava V. A. et al. 1987, BBA 926, 331–338). In Hefen (Candida- und Saccharomyces-Spezies) wurde die Herstellung von Erythroascorbinsäure berichtet (Huh W. K. et al., 1994, Eur. J. Biochem. 225, 1073–1079) (Huh W. K. et al., 1998, Mol. Microbiol. 30, 4, 895–903). In derartigen Hefen ist ein physiologischer Weg vorgeschlagen worden, der von D-Glucose über D-Arabinose und D-Arabinono-1,4-lacton zu Erythroascorbinsäure verläuft (Kim S. T. et al., 1996, BBA, 1297, 1–8). Die Enzyme D-Arabinose-Dehydrogenase und D-Arabinono-1,4-lacton-Oxidase aus Candida albicans ebenso wie S. cerevisiae sind charakterisiert worden. Interessanterweise sind L-Galactose und L-Galactono-1,4-lacton Substrate für diese Aktivitäten in vitro.

In-vivo-Herstellung von L-Ascorbinsäure wurde erhalten, indem L-Galactono-1,4-lacton in Wildtyp-Candida-Zellen geführt wurde (Internationale Patentanmeldung WO85/01745). Kürzlich wurde gezeigt, daß Wildtyp-S.-cerevisiae-Zellen L-Ascorbinsäure intrazellulär anreicherten, wenn sie mit L-Galactose, L-Galactono-1,4-lacton oder L-Gulono-1,4-lacton inkubiert wurden (Hancock et al., 2000, FEMS Microbiol. Lett. 186, 245–250) (Spickett C. M. et al., 2000, Free Rad. Biol. Med. 28, 183–192).

Wildtyp-Candida-Zellen, inkubiert mit L-Galactono-1,4-lacton, reichern L-Ascorbinsäure in dem Medium an, was vermuten läßt, daß diese Hefe einen biologischen Mechanismus für die intrazelluläre Freisetzung von angereicherter L-Ascorbinsäure hat; indessen ist L-Ascorbinsäure ein komplexes Molekül und es ist wissenschaftlich plausibel, daß ihre Anreicherung in dem Medium nicht in Zusammenhang mit einem einfachen Diffusionsprozeß steht, sondern von erleichtertem oder aktivem Transport abhängen sollte. Diese Schlußfolgerung wird durch die Identifizierung und Charakterisierung von L-Ascorbinsäure-Transportern in höheren eukaryotischen (Säuger-)Zellen unterstützt (Daruwala R. et al., 1999, FEBS Letters, 460, 480–484). Jedoch sind unter den Hefegattungen L-Ascorbat-Transporter nicht beschrieben worden. Nichtsdestotrotz ist, wenn auch Candida-Zellen, die in Medien, enthaltend L-Galactono-1,4-lacton, wachsen, L-Ascorbinsäure in dem Medium anreichern, Anreicherung in dem Medium von L-Ascorbinsäure aus S. cerevisiae-Zellen, inkubiert in Anwesenheit von Ascorbinsäurevorstufe, überraschenderweise niemals beschrieben worden.

Ein wünschenswertes Verfahren für die Herstellung von Ascorbinsäure in großem Maßstab umfaßt die Verwendung von genetisch veränderten Mikroorganismen (d.h. rekombinanten Mikroorganismen). Sowohl prokaryotische als auch eukaryotische Mikroorganismen werden heutzutage leicht und erfolgreich für die Herstellung von heterologen Proteinen ebenso wie für die Herstellung von heterologen Metaboliten verwendet. Unter Prokaryoten werden Escherichia coli und Bacillus subtilis oft verwendet. Unter Eukaryoten werden die Hefen S. cerevisiae und Kluyveromyces lactis oft verwendet. Trotz des großen Erfolgs dieser Wirte ist nur ein Beispiel für die Herstellung von L-Ascorbinsäure durch transformierte mikrobielle Zellen beschrieben worden. Da nur eukaryotische Zellen natürliche L-Ascorbinsäure-Hersteller sind, ist es noch überraschender, daß nur von einem prokaryotischen transformierten mikrobiellen Wirt beschrieben worden ist, zu intrazellulärer Anreicherung von L-Ascorbinsäure zu führen. Lee et al. (Appl. Environment. Microbiol., 1999, 65, 4685–4687) zeigte, daß das Klonieren des S. cerevisiae Gens, codierend D-Arabinono-1,4-lacton-Oxidase, in E. coli die Herstellung von L-Ascorbinsäure aus E. coli, inkubiert mit L-Galactono-1,4-lacton, erlaubt. Anreicherung von L-Ascorbinsäure wurde nur auf dem intrazellulären Niveau beobachtet.

Keine experimentellen Werte sind in der Literatur über die Herstellung von L-Ascorbinsäure aus transformierten eukaryotischen Mikroorganismen beschrieben worden. Østergaard et al. haben das Gen, codierend L-Galactono-1,4-lacton-Dehydrogenase, aus Blumenkohl in der Hefe S. cerevisiae kloniert (J. Biol. Chem., 1997, 272, 30009–30016). Wenn auch in vitro die Autoren L-Galactono-1,4-lacton-Dehydrogenase-Aktivität in dem Hefezellextrakt gefunden haben (Cytochrom-c-Assay, siehe Østergaard et al.), wurde in vivo keine Herstellung von L-Ascorbinsäure nachgewiesen.

Berry et al., Internationale Patentanmeldung WO 99/64618, diskutieren die potentielle Verwendung des pflanzlichen Biosyntheseweges von Ascorbinsäure; spezielle Betonung wird auf die Aktivität, katalysierend die Umwandlung von GDP-D-Mannose in GDP-L-Galactone, gelegt. Jedoch ist die Charakterisierung des Enzyms, katalysierend diesen Schritt, nicht ausführlich dargestellt worden. Ein überexprimiertes E. coli Homologes erwies sich als inaktiv.

Smirnoff et al., WO 99/33995, diskutieren die Verwendung von L-Galactose-Dehydrogenase zur Herstellung von Ascorbinsäure. Das Enzym wurde aus Erbsenkeimlingen gereinigt und die N-terminale Proteinsequenz wurde bestimmt. Die vollständige Sequenz ist nicht bekannt und wurde noch nicht berichtet. Die partielle Sequenz des L-Galactose-Dehydrogenase-Enzyms war zu 72% identisch mit den Aminosäuren 5–22 einer unidentifizierten mutmaßlichen Codierungssequenz aus Arabidopsis thaliana, Zugangs-Nr. 3549669.

Roland et al., US-Patentschriften 4595659 und 4916068, diskutieren die Verwendung von nicht rekombinanten Candida-Stämmen zur Umwandlung von L-galactonischen Substraten in L-Ascorbinsäure. Roland et al. beschrieben das verantwortliche Enzym als L-Galactono-1,4-lacton-Oxidase.

Kumar, WO 00/34502, diskutiert die Herstellung von L-Ascorbinsäure in Candida blankii und Cryptococcus dimennae Hefe, die imstande ist, 2-Keto-L-gulonsäure als alleinige Kohlenstoffquelle bei der Herstellung zu verwenden. Kumar schließt speziell die Herstellung aus Hefe durch einen Weg, der L-Galactonolacton-Oxidase beinhaltet, oder durch Umwandlung von L-galactonischen Vorstufen aus.

Es bleibt wünschenswert, Verfahren für die Herstellung von Ascorbinsäure durch einen geeigneten Fermentationsprozeß zu haben.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

In einer ersten Ausführungsform betrifft diese Erfindung ein Verfahren zum Erzeugen von Ascorbinsäure oder einem Salz davon, wie in den hierin enthaltenen Ansprüchen 1 bis 33 definiert wird.

In einer zweiten Ausführungsform betrifft diese Erfindung ein Verfahren zum Stabilisieren von Ascorbinsäure oder einem Salz davon in einem Medium, wie in den hierin enthaltenen Ansprüchen 34 bis 36 definiert wird.

Andere Ausführungsformen betreffen rekombinante Hefen, wie in den hierin enthaltenen Ansprüchen 37 bis 39 definiert wird.

BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

1 stellt eine schematische Darstellung des gegenwärtigen Verständnisses der physiologischen Biosynthesewege bereit, die in Pflanzen bzw. Tieren von D-Glucose zu L-Ascorbinsäure führen. Die folgenden Enzyme sind beteiligt: A, L-Galactono-1,4-lacton-Dehydrogenase (1.3.2.3.); B, L-Galactose-Dehydrogenase; C, Zucker-Phosphatase (3.1.3.23, mutmaßlich); D, Hydrolase (mutmaßlich); E, GDP-Mannose-3,5-Epimerase (5.1.3.18); F, Mannose-1-phosphat-Guanylyltransferase (2.7.7.22); G, Phosphomannomutase (5.4.2.8); H, Mannose-6-Phosphatisomerase (5.3.1.8); I, Glucose-6-phosphat-Isomerase (5.3.1.9); J, Hexokinase (2.7.1.1); 1, L-Gulono-1,4-lacton-Oxidase (1.1.3.8); 2, Aldonolactonase (3.1.1.17); 2a, Glucuronolacton-Reduktase (1.1.1.20); 3, D-Glucuronat-Reduktase (1.1.1.19); 3a, Uronolactonase (3.1.1.19) oder spontan; 4, D-Glucuronokinase (2.7.1.43); 5, Glucuronat-1-phosphat-Uridylyltransferase (2.7.7.44); 6, UDP-D-Glucose-Dehydrogenase (1.1.1.22); 7, UTP-Glucose-1-phosphat-Uridylyltransferase (2.7.7.9); 8, Phosphoglucomutase (5.4.2.2.), 9, Hexokinase (2.7.1.1). Jedoch muß betont werden, daß zur Herstellung von L-Ascorbinsäure im Umfang der vorliegenden Erfindung die verwendbaren Enzyme nicht auf die Enzyme der physiologischen Wege begrenzt sind.

2 zeigt die Stabilität von Ascorbinsäure unter Kulturbedingungen. Ascorbinsäure wurde zu mineralischem Medium (2% Glucose, 0,67% YNB) hinzugegeben und unter Standardkulturbedingungen für 7 Tage inkubiert. Die Flasche von Tafel A wurde zur Zeit 0 mit S. cerevisiae GRF18U zu einer anfänglichen OD660 von 0,05 beimpft, wohingegen die Flasche von Tafel B steril gehalten wurde. Proben wurden zu den angegebenen Zeiten genommen und die Ascorbinsäurekonzentration wurde bestimmt. Obwohl die Ascorbinsäure stabil in diesem Medium war, wenn lebensfähige Hefe vorhanden war, wurde sie in sterilem Medium innerhalb von 7 Tagen vollständig abgebaut. Dies demonstriert, daß Inkubation von lebensfähiger Hefe in einem Ascorbinsäure umfassenden Medium als Verfahren zum Stabilisieren von Ascorbinsäure verwendet werden kann.

3 zeigt die endogene Fähigkeit von Hefen zur Umwandlung der Vorstufen L-Galactono-1,4-lacton (Gal) oder L-Gulono-1,4-lacton (Gul) in Ascorbinsäure. Nicht transformierte Hefezellen (S. cerevisiae GRF18U, W3031B und Z. bailii ATCC 60483) wurden auf mineralischem Medium (2% Glucose, 0,67% YNB) in Anwesenheit von 100 mM L-Galactono-1,4-lacton bzw. L-Gulono-1,4-lacton für 72 h gezüchtet. (Anfängliche OD660 war 0,05); "-" bedeutet, daß keine Vorstufe hinzugegeben wurde. Wenn auch Ascorbinsäure innerhalb der Zelle angereichert wurde, konnte keine Ascorbinsäure in der Kulturbrühe nachgewiesen werden.

4 zeigt die endogene Fähigkeit von Hefen zur Umwandlung von L-Galactose in Ascorbinsäure. Nicht transformierte S. cerevisiae (GRF18U und W3031B), Z. bailii ATCC 60483 und K. lactis PM6-A wurden auf mineralischem Medium (2% Glucose, 0,67% YNB) ausgehend von einer OD660 von 0,05 über Nacht gezüchtet. Dann wurden 250 mg l–1 L-Galactose hinzugegeben und die Kulturen wurden vor der Bestimmung der Ascorbinsäure für weitere 24 h unter Standardbedingungen gehalten. Alle diese Stämme reicherten Ascorbinsäure intrazellulär an, während in der Kulturbrühe, außer für Z. bailii, welches eine kleine Menge anreicherte, keine Ascorbinsäure meßbar war. (Es wird angenommen, daß der hohe Hintergrund bei K. lactis auf Erythroascorbinsäure zurückzuführen ist, die natürlicherweise in dieser Hefespezies mit höheren Konzentrationen vorhanden ist, als sie bei S. cerevisiae gesehen werden).

5 zeigt die Umwandlung von L-Galactono-1,4-lacton in Ascorbinsäure durch rekombinante Hefen. S. cerevisiae GRF18U wt (Kontrolle), oder transformiert mit einer Codierungsregion, codierend AGD bzw. ALO, wurde auf mineralischem Medium (2% Glucose, 0,67% YNB) ausgehend von einer OD660 von 0,05 in Anwesenheit von 50 mM L-Galactono-1,4-lacton (Gal) für 72 h gezüchtet. Wenn auch die Kontrollzellen keine Ascorbinsäure in dem Kulturmedium anreicherten, reicherten Zellen, transformiert mit einer Codierungsregion, codierend AGD oder ALO, unerwarteterweise beträchtliche Mengen (d.h. größer als die Gehalte des Hintergrunds) von Ascorbinsäure in dem Kulturmedium an. Keine Ascorbinsäure wurde in Kulturen ohne die Zugabe von L-Galactono-1,4-lacton (markiert -) nachgewiesen.

6 zeigt die Umwandlung von L-Galactose in Ascorbinsäure durch rekombinante Hefen. S. cerevisiae GRF18U wt (Kontrolle), transformiert mit einer Codierungsregion oder Codierungsregionen, codierend LGDH; AGD; ALO; AGD und LGDH; ALO und LGDH; bzw. ARA bzw. ALO, wurden auf mineralischem Medium (2% Glucose, 0,67% YNB) ausgehend von einer OD660 von 0,05 über Nacht gezüchtet. Dann wurden 250 mg l–1 L-Galactose hinzugegeben und die Kulturen wurden vor der Bestimmung von Ascorbinsäure für weitere 24 h unter Standardbedingungen gehalten. Die Kontrollzellen oder Zellen, transformiert mit nur einer Codierungsregion, codierend LGDH, reicherten keine Ascorbinsäure in dem Kulturmedium an. Zellen, transformiert mit Codierungsregionen, codierend LGDH und entweder AGD oder ALO, ebenso wie Zellen, transformiert mit Codierungsregionen, codierend ARA und ALO, reicheren beträchtliche Mengen (d.h. größer als die Gehalte des Hintergrunds) von Ascorbinsäure in dem Medium an.

7 zeigt die Umwandlung von L-Galactose in Ascorbinsäure in einer Kultur mit hoher Zelldichte von rekombinanter Hefe. S. cerevisiae GRF18U wt (Kontrolle) oder GRF18U, transformiert mit einer Codierungsregion, codierend ALO, oder Codierungsregionen, codierend LGDH bzw. ALO, wurde auf mineralischem Medium (2% Glucose, 0,67% YNB) ausgehend von einer OD660 von 0,05 über Nacht gezüchtet. Zu der Zeit 0 wurden die Zellen um das Zehnfache konzentriert und 250 mg l–1 L-Galactose wurden hinzugegeben und die Kulturen wurden für 6 Tage unter Standardbedingungen gehalten. Zu den angegebenen Zeiten wurden Proben genommen und die Ascorbinsäurekonzentration in der Kulturbrühe wurde gemessen. Während die Kontrollzellen keine Ascorbinsäure in dem Kulturmedium anreicherten, reicherten Zellen, transformiert mit einer Codierungsregion, codierend ALO allein, oder mit Codierngsregionen, codierend ALO und LGDH, beträchtliche Mengen (d.h. größer als die Gehalte des Hintergrunds) von Ascorbinsäure in dem Medium an.

8 zeigt die Umwandlung von L-Galactose in Ascorbinsäure durch rekombinante Hefe. Z. bailii ATCC 36947 wt (Kontrolle), Z. bailii, transformiert mit leerem Vektor (pZ3); einer Codierungsregion, codierend LGDH; einer Codierungsregion, codierend ALO; bzw. Codierungsregionen, codierend ALO und LGDH, wurden auf mineralischem Medium (2% Glucose, 0,67% YNB) ausgehend von einer OD660 von 0,05 über Nacht in Anwesenheit von geeigneten selektiven Antibiotika (G418 für pZ3, Hygromycin für pAG26TPI oder beide) gezüchtet. Dann wurden 250 mg l–1 L-Galactose hinzugegeben und die Kulturen wurden vor der Bestimmung von Ascorbinsäure für weitere 24 h unter Standardbedingungen gehalten. Wt-Zellen Z. bailii ATCC 36947 reicheren bei Inkubation mit L-Galactose kleinere Mengen von Ascorbinsäure in dem Medium an. Zellen, transformiert mit dem leeren Vektor oder einem Vektor, umfassend die Codierungsregion, codierend LGDH, reicherten keine Ascorbinsäure in dem Kulturmedium an. Zellen, transformiert mit nur der Codierungsregion, codierend ALO, oder mit Codierungsregionen, codierend LGDH und ALO, reicherten beträchtliche Mengen (d.h. größer als die Gehalte des Hintergrunds) von Ascorbinsäure in dem Medium an. Expression von antibiotischer Resistenz, verwendet für Plasmidselektion, oder die Antibiotika, verwendet für derartige Selektion, können die Anreicherung oder Bestimmung von Ascorbinsäure in Kulturen beeinträchtigen. Dies korreliert mit den Werten, daß Zellen, die ALO exprimieren, ohne Hygromycin-Resistenz zu exprimieren, und ohne Hygromycin in dem Medium mehr Ascorbinsäure anreicherten als Zellen, die ALO zusammen mit Hygromycin-Resistenz exprimieren, welche in Medium, umfassend Hygromycin, gezüchtet wurden.

9 zeigt die Umwandlung von L-Gulonsäure und L-Gulono-1,4-lacton in Ascorbinsäure durch rekombinante S. cerevisiae GRF18U. Die GRF18U-Zellen wurden mit einem leeren Plasmid (pL, Kontrolle); Plasmid pL-RGLO; den Plasmiden pL und pH-AL; oder dem Plasmid pL-RGLO (RGLO ist GLO, isoliert aus R. norvegicus) bzw. pH-AL transformiert. Die rekombinante Hefe wurde auf Minimalmedium (2% Glucose, 0,67% YNB) ausgehend von einer OD660 von 0,05 über Nacht gezüchtet. Dann wurden 66 mM L-Gulonsäure oder L-Gulono-1,4-lacton hinzugegeben. Nach 48 Stunden wurden die Zellen geerntet und die intrazelluläre Ascorbinsäurekonzentration wurde bestimmt. Ascorbinsäure wurde in dem Überstand nicht nachgewiesen (nicht angegeben). Zellen, transformiert mit der Codierungsregion, codierend AL, reicherten Ascorbinsäure mit Gehalten, größer als der Hintergrund, an, wobei L-Gulonsäure als Substrat vorhanden war. Zellen, transformiert mit RGLO, reicherten nur etwa das dreifache der Menge von Ascorbinsäure, gesehen in der Kontrolle, an (z.B. GRF18U/pL), wobei L-Gulono-1,4-lacton als Substrat vorhanden war.

10 zeigt die intrazelluläre Umwandlung von L-Gulono-1,4-lacton (z.B. gul) in Ascorbinsäure in einer Kultur von rekombinanter Z. bailii. Z. bailii ATCC 36947 und Z. bailii ATCC 60483 wurden mit entweder dem leeren Z. bailii Expressionsplasmid pZ3 oder mit pZ3-RGLO (RGLO ist GLO, isoliert aus R. norvegicus) transformiert. Die Hefe wurde auf mineralischem Medium (2% Glucose, 0,67% YNB) ausgehend von einer OD660 von 0,05 über Nacht in Anwesenheit von G418 gezüchtet. Dann wurden 100 mM L-Gulonsäure-1,4-lacton hinzugegeben und die Kulturen wurden vor der Bestimmung von Ascorbinsäure für weitere 48 h unter Standardbedingungen gehalten. Beide Z. bailii Stämme, exprimierend RGLO, erzeugten in Anwesenheit von L-Gulono-1,4-lacton relativ hohe intrazelluläre Gehalte von Ascorbinsäure.

BESCHREIBUNG VON VERANSCHAULICHENDEN AUSFÜHRUNGSFORMEN

Das Medium, in welchem die Hefe kultiviert wird, kann ein beliebiges auf dem Fachgebiet bekanntes Medium sein, um für diesen Zweck geeignet zu sein. Kultivierungstechniken und Medien sind auf dem Fachgebiet bekannt. Typischerweise, ohne aber darauf begrenzt zu sein, wird die Kultivierung durch wässerige Fermentation in einem passenden Gefäß durchgeführt. Beispiele für ein typisches Gefäß für Hefefermentation umfassen eine Schüttelflasche oder einen Bioreaktor.

Das Medium umfaßt eine Komponente, erforderlich für das Wachstum der Hefe, und eine oder mehrere Vorstufen für die Herstellung von Ascorbinsäure. Komponenten für das Wachstum der Hefe und Vorstufen für die Herstellung von Ascorbinsäure können identisch sein oder nicht.

Das Medium umfaßt eine Kohlenstoffquelle, wie beispielsweise Glucose oder andere Kohlenhydrate (wie beispielsweise, unter anderen, Saccharose, Fructose, Arabinose, Lactose, Galactose, Maltose, Raffinose, Ethanol, Methanol, Glycerol oder Hydrolysate von Pflanzenresten). Typischerweise umfaßt das Medium auch eine Stickstoffquelle, entweder organisch oder anorganisch, und das Medium kann auch Komponenten wie beispielsweise Aminosäuren; Purine; Pyrimidine; Cornsteep-Lösung; Hefeextrakt; Proteinhydrolysate; wasserlösliche Vitamine, wie beispielsweise B-Komplex-Vitamine; oder anorganische Salze wie beispielsweise, unter anderen, Chloride, Hydrochloride, Phosphate oder Sulfate von Ca, Mg, Na, K, Fe, Ni, Co, Cu, Mn, Mo oder Zn umfassen. Weitere Komponenten, von denen dem Fachmann bekannt ist, daß sie beim Kultivieren von Hefe oder der Fermentation nützlich sind, können ebenfalls eingeschlossen werden. Das Medium kann gepuffert sein oder nicht.

Das Medium umfaßt auch eine Ascorbinsäurevorstufe. Die Ascorbinsäurevorstufe ist eine Verbindung, die in der Hefe, entweder direkt oder durch Zwischenschritte, in L-Ascorbinsäure umgewandelt werden kann. Ascorbinsäurevorstufen können aus der Gruppe, bestehend aus Monosacchariden, Oligosacchariden, Polysacchariden, C1-C6-Alkoholen, C2-C6-Polyolen, organischen Säuren einschließlich Aminosäuren und Fettsäuren und C5-C6-Lactonen, ausgewählt werden. Die Saccharide und organischen Säuren können Saccharide und organische Säuren umfassen, die phosphoryliert und/oder mit UDP oder GDP modifiziert worden sind. Vorzugsweise ist die Ascorbinsäurevorstufe aus der Gruppe, bestehend, unter anderen, aus Trehalose; Xylose; Xylulose; Raffinose; Ethanol; Maltose; Glycerol; Fructose; Arabinose; D-Glucose-6-P; D-Glucose-1-P; UDP-D-Glucose; UDP-Glucuronsäure; D-Glucuronsäure-1-P; D-Glucuronsäure; D-Glucuronolacton; L-Gulonsäure; D-Fructose-6-P; D-Mannose-6-P; D-Mannose-1-P; GDP-D-Mannose, GDP-L-Galactose; L-Galactose-1-P; Lactose; Saccharose; Stärke; Cellulose; Citrat; Methanol; Formaldehyd; Formiat; Methylamin; Alanin; Oleinsäure; L-Galactono-1,4-lacton; D-Glucose; L-Gulono-1,4-lacton; L-Galactose und L-Gulonsäure ausgewählt. Stärker bevorzugt ist die Ascorbinsäurevorstufe aus L-Galactono-1,4-lacton; D-Glucose; L-Gulono-1,4-lacton, L-Galactose und L-Gulonsäure ausgewählt. Zwei oder mehrere Ascorbinsäurevorstufen können ebenfalls verwendet werden. Weiterhin kann in bestimmten Ausführungsformen die Ascorbinsäurevorstufe auch als Kohlenstoffquelle zum Kultivieren der Hefe dienen.

Während des Verlaufs der Fermentation wandelt die Hefe die Ascorbinsäurevorstufe über einen oder mehrere Schritte in L-Ascorbinsäure um. Ein bevorzugtes Medium umfaßt Glucose, YNB (Yeast Nitrogen Base (Hefe-Stickstoff-Base)) und mindestens eines von L-Gulonsäure; L-Galactono-1,4-lacton; L-Gulono-1,4-lacton oder L-Galactose.

Nachdem das Kultivieren für eine ausreichende Zeitlänge, um eine gewünschte Konzentration von L-Ascorbinsäure in dem Kulturmedium zu erzeugen, vorangeschritten ist, wird die L-Ascorbinsäure isoliert. „Isoliert", wie hier verwendet, um Ascorbinsäure zu bezeichnen, bedeutet, durch Abtrennung von Ascorbinsäure von mindestens einer nicht-Ascorbinsäurekomponente der Hefe oder des Mediums zu einem Zustand größerer Reinheit gebracht. Vorzugsweise ist die isolierte Ascorbinsäure zu mindestens etwa 95% rein, stärker bevorzugt zu mindestens etwa 99% rein.

Um L-Ascorbinsäure aus der Hefe zu isolieren, ist der erste Schritt der Isolation, nachdem die Hefe von dem Medium abgetrennt worden ist, typischerweise Lysieren der Hefe durch chemische oder enzymatische Behandlung, Behandlung mit Glasperlen, Ultraschall, Gefrieren/Auftauen-Zyklus oder andere bekannte Techniken. L-Ascorbinsäure kann von der Membran, Protein, Nucleinsäure und anderen Fraktionen des Hefelysats durch geeignete Techniken, wie beispielsweise, unter anderen, Zentrifugation, Filtration, Mikrofiltration, Ultrafiltration, Nanofiltration, Flüssig-Flüssig-Extraktion, Kristallisation, enzymatische Behandlung mit Nuclease oder Protease oder Chromatographie gereinigt werden.

Um L-Ascorbinsäure, angereichert in dem Medium, zu isolieren, umfaßt die Isolierung Reinigen der Ascorbinsäure von dem Medium. Reinigung kann durch bekannte Techniken, wie beispielsweise, unter anderen, die Verwendung eines Ionenaustauscherharzes, Aktivkohle, Mikrofiltration, Ultrafiltration, Nanofiltration, Flüssig-Flüssig-Extraktion, Kristallisation oder Chromatographie durchgeführt werden.

L-Ascorbinsäure kann aus sowohl der Hefe als auch dem Medium isoliert werden.

Die Hefe reichert L-Ascorbinsäure in dem Medium während des Kultivierungsschritts an, und vorzugsweise wird die Konzentration von L-Ascorbinsäure stabilisiert oder ihr erlaubt zuzunehmen. Noch stärker bevorzugt wird die L-Ascorbinsäure in dem Medium durch die Anwesenheit von lebensfähiger Hefe stabilisiert.

In einer Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Erzeugen von Ascorbinsäure, umfassend (i) Kultivieren der rekombinanten Hefe in einem Medium, umfassend mindestens eine Ascorbinsäurevorstufe, dadurch Erzeugen von Ascorbinsäure und (ii) Isolieren der Ascorbinsäure.

Eine „rekombinante" Hefe ist eine Hefe, die eine Nucleinsäuresequenz, nicht natürlich in der Hefe vorkommend, oder eine zusätzliche Kopie oder Kopien einer endogenen Nucleinsäuresequenz enthält, wobei die Nucleinsäuresequenz in die Hefe oder eine Vorfahrenzelle davon durch menschliche Aktion eingeführt wird. Rekombinante DNA-Techniken sind bekannt, wie beispielsweise bei Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Molekulares Klonieren: Ein Laborhandbuch), Cold Spring Harbor Laboratory Press, welcher weitere Information in bezug auf verschiedene Techniken, bekannt auf dem Fachgebiet und hier diskutiert, bereitstellt. In dieser Ausführungsform wird eine Codierungsregion des homologen und/oder heterologen Gens aus einem Organismus isoliert, welcher das Gen besitzt. Der Organismus kann ein Bakterium, ein Prokaryot, ein Eukaryot, ein Mikroorganismus, ein Pilz, eine Pflanze oder ein Tier sein.

Genetisches Material, umfassend die Codierungsregion, kann aus Zellen des Organismus durch eine beliebige bekannte Technik extrahiert werden. Danach kann die Codierungsregion durch eine beliebige geeignete Technik isoliert werden. In einer bekannten Technik wird die Codierungsregion isoliert, indem erstens eine genomische DNA-Genbank oder einer cDNA-Genbank hergestellt wird und zweitens die Codierungsregion in der genomischen DNA-Genbank oder cDNA-Genbank identifiziert wird, wie beispielsweise durch Sondieren der Genbank mit einer markierten Nucleotidsonde, die ausgewählt ist, homolog mit der Codierungsregion zu sein, oder von der vermutet wird, daß sie es zumindest teilweise ist, wobei bestimmt wird, ob Expression der Codierungsregion einen nachweisbaren Phänotyp an einen Mikroorganismus der Genbank, umfassend die Codierungsregion, vermittelt, oder die gewünschte Sequenz durch PCR amplifiziert wird. Andere bekannte Techniken zum Isolieren der Codierungsregion können ebenfalls verwendet werden.

Hefen werden von N. J. W. Kreger-van Rij „The Yeasts" („Die Hefen"), Bd. 1 von Biology of Yeasts (Biologie der Hefen), Kap. 2, A. H. Rose und J. S. Harrison, Hrsg. Academic Press, London, 1987 beschrieben. Die gemäß der Erfindung verwendeten rekombinanten Hefen sind S. cerevisiae und Z. bailii. Vorzugsweise ist die Hefe der S. cerevisiae Stamm GRF18U oder W3031B oder Z. bailii ATCC 60483 oder Z. bailii ATCC 36947.

Vorzugsweise ist eine rekombinante Hefe der vorliegenden Erfindung nicht imstande, L-Ascorbinsäure aus 2-Keto-L-gulonsäure zu erzeugen.

Vorzugsweise umfaßt die rekombinante Hefe mindestens eine Codierungsregion, codierend ein Enzym, derart, daß die rekombinante Hefe, welche funktionell transformiert worden ist, imstande ist, eine Ascorbinsäurevorstufe in einem oder mehreren Schritten in Ascorbat umzuwandeln.

Das Medium, in welchem die rekombinante Hefe kultiviert wird, kann ein beliebiges Medium sein, von dem auf dem Fachgebiet bekannt ist, für diesen Zweck geeignet zu sein. Kultivierungstechniken und Medien sind auf dem Fachgebiet bekannt. Typischerweise, ohne aber darauf begrenzt zu sein, wird Kultivieren durch wässerige Fermentation in einem geeigneten Gefäß durchgeführt. Beispiele für ein typisches Gefäß für Hefefermentation umfassen eine Schüttelflasche oder einen Bioreaktor.

Das Medium umfaßt irgendeine Komponente, erforderlich für das Wachstum der Hefe, und eine oder mehrere Vorstufen für Herstellung von Ascorbinsäure. Komponenten für das Wachstum der Hefe und Vorstufen für die Herstellung von Ascorbinsäure können identisch sein oder nicht, und geeignete Komponenten des Mediums und Ascorbinsäurevorstufen sind vorstehend beschrieben. Während des Verlaufs der Fermentation wird die Ascorbinsäurevorstufe durch die rekombinante Hefe internalisiert und durch einen oder mehrere Schritte in L-Ascorbinsäure umgewandelt. Die L-Ascorbinsäure, erzeugt durch die rekombinante Hefe, kann innerhalb der Hefe enthalten sein oder kann in dem Medium mit größeren als den Hintergrundgehalten angereichert werden.

Nachdem das Kultivieren für eine ausreichende Zeitlänge, um eine gewünschte Konzentration von L-Ascorbinsäure in dem Kulturmedium zu erzeugen, fortgeschritten ist, wird die L-Ascorbinsäure wie vorstehend beschrieben isoliert. L-Ascorbinsäure kann aus sowohl der Hefe als auch dem Medium isoliert werden. Wie vorstehend erklärt wird vorzugsweise die Konzentration von L-Ascorbinsäure stabilisiert oder ihr erlaubt zuzunehmen. Noch stärker bevorzugt wird die L-Ascorbinsäure in dem Medium durch die Anwesenheit von lebensfähiger Hefe stabilisiert.

In einem Verfahren der vorliegenden Erfindung wird eine Codierungsregion, in eine rekombinante Hefe eingeführt, codiert mindestens ein erstes Enzym D-Arabinono-1,4-lacton-Oxidase (ALO). In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Codierungsregion von D-Arabinono-1,4-lacton-Oxidase (ALO) aus S. cerevisiae isoliert. Es sollte bemerkt werden, daß der Begriff „isoliert", wie hier in bezug auf eine Nucleinsäuresequenz verwendet, sich auf die letztliche Quelle, nicht die unmittelbare Quelle, der Codierungsregion bezieht. Das heißt, eine Codierungsregion wird aus einem Organismus „isoliert", wenn er eine Proteinsequenz codiert, die im wesentlichen identisch mit der des gleichen Proteins, gereinigt von Zellen des Organismus, ist.

In bestimmten Ausführungsformen ist die rekombinante Hefe imstande, mindestens etwa 25% der Ascorbinsäure in dem Medium, in welchen die Hefe kultiviert wird, in Ascorbinsäure umzuwandeln. Stärker bevorzugt ist die kultivierte rekombinante Hefe imstande, mindestens etwa 35% von mindestens einer Ascorbinsäurevorstufe in dem Kulturmedium in Ascorbinsäure umzuwandeln, und am meisten bevorzugt ist die Hefe imstande, mindestens etwa 40% der Ascorbinsäurevorstufe in Ascorbinsäure umzuwandeln.

Vorzugsweise wird die Ascorbinsäure in dem Medium zu einer finalen Konzentration von mindestens etwa 20 mg Ascorbinsäure/l Kulturmedium, stärker bevorzugt zu einer finalen Konzentration von mindestens etwa 40 mg Ascorbinsäure/l Kulturmedium und am meisten bevorzugt zu einer finalen Konzentration von mindestens etwa 70 mg Ascorbinsäure/l Kulturmedium angereichert.

In bestimmten Ausführungsformen, ist die rekombinante Hefe funktionell mit einer Codierungsregion, codierend ein zweites Enzym anders als das erste Enzym transformiert, wobei das zweite Enzym ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus L-Galactose-Dehydrogenase (LGDH), L-Galactono-1,4-lacton-Dehydrogenase (AGD) und D-Arabinose-Dehydrogenase (ARA).

In noch stärker bevorzugten Ausführungsformen werden die Codierungsregionen, codierend LGDH und AGD, aus A. thaliana isoliert, und die Codierungsregion, codierend ARA, wird aus S. cerevisiae isoliert.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Hefe funktionell mit der Codierungsregion, codierend ein Protein mit D-Arabinono-1,4-lacton-Oxidase-(ALO)-Aktivität, transformiert und weiterhin funktionell mit einer Codierungsregion, codierend ein Protein mit L-Galactose-Dehydrogenase-(LGDH)-Aktivität, transformiert.

In noch einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist die Hefe funktionell mit der Codierungsregion, codierend ein Protein mit D-Arabino-1,4-lacton-Oxydase (ALO)-Aktivität, und mit der Codierungsregion, codierend ein Protein mit D-Arabinose-Dehydrogenase (ARA)-Aktivität, transformiert.

In einer stärker bevorzugten Ausführungsform umfaßt die rekombinante Hefe weiterhin mindestens eine Codierungsregion, codierend ein Enzym, verbunden mit der Umwandlung einer Kohlenstoffquelle in L-Galactose. Das Enzym ist vorzugsweise aus der Gruppe, bestehend aus Hexokinase, Glucose-6-phosphat-Isomerase, Mannose-6-phosphat-Isomerase, Phosphomannomutase, Mannose-1-phosphat-Guanylyltransferase, GDP-Mannose-3,5-Epimerase, GDP-L-Galactose-Hydrolase und L-Galactosephosphat-Phosphatase, ausgewählt.

In einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfaßt die rekombinante Hefe weiterhin mindestens eine Codierungsregion, codierend ein Enzym, verbunden mit der Umwandlung einer Kohlenstoffquelle in L-Gulono-1,4-lacton. Das Enzym ist vorzugsweise aus der Gruppe, bestehend aus Hexokinase, Phosphoglucomutase, UTP-Glucose-1-phosphat-Uridylyltransferase, UDP-D-Glucose-Dehydrogenase, Glucuronat-1-phosphat-Uridylyltransferase, D-Glucurono-Kinase, und D-Glucuronat-Reduktase ausgewählt.

In einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfaßt die rekombinante Hefe weiterhin mindestens eine Codierungsregion, codierend ein Enzym, verbunden mit der Umwandlung einer Kohlenstoffquelle in L-Gulono-1,4-lacton. Das Enzym ist vorzugsweise aus der Gruppe, bestehend aus Hexokinase, Phosphoglucomutase, UTP-Glucose-1-phosphat-Uridylyltransferase, UDP-D-Glucose-Dehydrogenase, Glucuronat-1-phosphat-Uridylyltransferase, D-Glucurono-Kinase, Uronolactonase, D-Glucuronat-Reduktase und Glucuronolacton-Reduktase, ausgewählt.

In einer anderen stärker bevorzugten Ausführungsform hat die Aminosäuresequenz des LGDH-Enzyms oder eines Proteins mit LGDH-Aktivität mindestens etwa 70%, stärker bevorzugt etwa 80% und am meisten bevorzugt etwa 90% Ähnlichkeit mit SEQ ID NO: 11; hat die Aminosäuresequenz des AGD-Enzyms oder eines Proteins mit AGD-Aktivität mindestens etwa 70%, stärker bevorzugt etwa 80% und am meisten bevorzugt etwa 90% Ähnlichkeit mit SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3; hat die Aminosäuresequenz des ARA-Enzyms oder eines Proteins mit ARA-Aktivität mindestens etwa 70%, stärker bevorzugt etwa 80% und am meisten bevorzugt etwa 90% Ähnlichkeit mit SEQ ID NO: 20; hat die Aminosäuresequenz des ALO-Enzyms oder eines Proteins mit ALO-Aktivität mindestens etwa 70%, stärker bevorzugt etwa 80%, und am meisten bevorzugt etwa 90% Ähnlichkeit mit SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NO: 7; wobei „Ähnlichkeit" durch eine Sequenzausrichtung, durchgeführt unter Verwendung des CLUSTAL-Programms, bestimmt wird.

In einer anderen stärker bevorzugten Ausführungsform hat die Aminosäuresequenz des LDGH-Enzyms oder eines Proteins mit LGDH-Aktivität mindestens etwa 70%, stärker bevorzugt etwa 80% und am meisten bevorzugt etwa 90% Identität mit SEQ ID NO: 11; hat die Aminosäuresequenz des AGD-Enzyms oder eines Proteins mit AGD-Aktivität mindestens etwa 70%, stärker bevorzugt etwa 80% und am meisten bevorzugt etwa 90% Identität mit SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3; hat die Aminosäuresequenz des ARA-Enzyms oder eines Proteins mit ARA-Aktivität mindestens etwa 70%, stärker bevorzugt etwa 80% und am meisten bevorzugt etwa 90% Identität mit SEQ ID NO: 20; hat die Aminosäuresequenz des ALO-Enzyms oder eines Proteins mit ALO-Aktivität mindestens etwa 70%, stärker bevorzugt etwa 80% und am meisten bevorzugt etwa 90% Identität mit SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NO: 7, wobei „Identität" durch eine Sequenzausrichtung, durchgeführt unter Verwendung des CLUSTAL-Programms, bestimmt wird.

In einer anderen stärker bevorzugten Ausführungsform hat die Codierungsregion, codierend das LGDH-Enzym oder ein Protein mit LGDH-Aktivität, mindestens etwa 70%, stärker bevorzugt etwa 80% und am meisten bevorzugt etwa 90% Identität mit SEQ ID NO: 12; hat die Codierungsregion, codierend das AGD-Enzym oder ein Protein mit AGD-Aktivität, mindestens etwa 70%, stärker bevorzugt etwa 80% und am meisten bevorzugt etwa 90% Identität mit SEQ ID NO: 2 oder den Nucleotiden 56 bis 1858 von SEQ ID NO: 4; hat die Codierungsregion, codierend das ARA-Enzym oder ein Protein mit ARA-Aktivität, mindestens etwa 70%, stärker bevorzugt etwa 80% und am meisten bevorzugt etwa 90% Identität mit Nukleotiden 285 bis 1319 von SEQ ID NO: 21; hat die Codierungsregion, codierend das ALO-Enzym oder ein Protein mit ALO-Aktivität, mindestens etwa 70%, stärker bevorzugt etwa 80% und am meisten bevorzugt etwa 90% Identität mit SEQ ID NO: 6 oder den Nucleotiden 4 bis 1584 von SEQ ID NO: 8, wobei „Identität" durch eine Sequenzausrichtung, durchgeführt unter Verwendung des CLUSTAL-Programms, bestimmt wird.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch Polypeptide, welche durch Nucleinsäuresequenzen codiert werden, welche imstande sind, unter Standardbedingungen mit einer Oligonucleotidsonde zu hybridisieren, welche unter den gleichen Bedingungen mit der Nucleinsäuresequenz, angegeben in SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 2, den Nucleotiden 56 bis 1858 von SEQ ID NO: 4, den Nukleotiden 285 bis 1319 von SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 6 und den Nucleotiden 4 bis 1584 von SEQ ID NO: 8, ebenso wie einem komplementären Strang davon oder eine Subsequenz davon hybridisiert (J. Sambrook, E. F. Fritsch und T. Maniatus, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Molekulares Klonieren: Ein Laborhandbuch), 2. Auflage, Cold Spring Harbor, New York). Die Oligonucleotidsonde kann aus der Codierungsregion selbst oder einer Subsequenz davon bestehen. Hybridisierung zeigt an, daß eine analoge Nucleinsäuresequenz in sowohl der Sequenz, die sondiert wird, als auch in der Nucleotidsequenz, angegeben in SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 2, den Nucleotiden 56 bis 1858 von SEQ ID NO: 4, den Nukleotiden 285 bis 1319 von SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 6 und den Nucleotiden 4 bis 1584 von SEQ ID NO: 8 oder einer Subsequenz davon existiert.

So ist in einer anderen bevorzugten Ausführungsform die rekombinante Hefe funktionell mit einer Codierungsregion transformiert, die aus einer Codierungsregion, codierend ein Protein mit LGDH-Aktivität, die mit einem komplementären Strang des Polynucleotids, angegeben in SEQ ID NO: 12, hybridisiert; einer Codierungsregion, codierend ein Protein mit AGD-Aktivität, die mit einem komplementären Strang des Polynucleotids, angegeben in SEQ ID NO: 2, oder den Nucleotiden 56 bis 1858 von SEQ ID NO: 4 hybridisiert; und einer Codierungsregion, codierend ein Protein mit ARA-Aktivität, die mit einem komplementären Strang des Polynucleotids, angegeben in Nukleotiden 285 bis 1319 von SEQ ID NO: 21, und einer Codierungsregion codierend ein Protein mit ALO-Aktivität die mit einem komplementären Strang des Polipetids angegeben in SEQ ID NO: 6 oder den Nucleotiden 4 bis 1584 von SEQ ID NO: 8 hybridisiert, und wobei die Codierungsregion mit dem komplementären Strang des Polynucleotids unter stringenten Hybridisierungsbedingungen hybridisiert, ausgewählt ist. Stringente Hybridisierungsbedingungen können vom mittlerer oder von hoher Stringenz sein. Unter mittleren Stringenzbedingungen erfolgen zum Beispiel Prähybridisierung und Hybridisierung bei 42°C in 5 × SSPE, 0,3% SDS, 200 &mgr;g/ml von einer Scherbehandlung unterworfenen und denaturierten Lachssperma-DNA und 35% Formamid nach standardmäßigen Southern-Blotting-Prozeduren. Unter Bedingungen hoher Stringenz erfolgen zum Beispiel Prähybridisierung und Hybridisierung bei 42°C in 5 × SSPE, 0,3% SDS, 200 &mgr;g/ml von einer Scherbehandlung unterworfenen und denaturierten Lachssperma-DNA und 50% Formamid.

Die Nucleinsäuresequenzen, angegeben in SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 2, den Nucleotiden 56 bis 1858 von SEQ ID NO: 4, den Nukleotiden 285 bis 1319 von SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 6 und den Nucleotiden 4 bis 1584 von SEQ ID NO: 8, oder Subsequenzen davon können verwendet werden, um DNA, codierend homologe Proteine von anderen Stämmen unterschiedlicher Gattungen oder Spezies, die verwendet werden können, um Ascorbinsäure entsprechend auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren zu erzeugen, zu identifizieren und zu klonieren. So kann eine genomische oder cDNA-Genbank, hergestellt aus derartigen anderen Organismen, für DNA gescreent werden, welche mit SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 2, den Nucleotiden 56 bis 1858 von SEQ ID NO: 4, den Nukleotiden 285 bis 1319 von SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 6 und den Nucleotiden 4 bis 1584 von SEQ ID NO: 8 oder Subsequenzen davon hybridisiert.

Genomische oder andere DNA von derartigen anderen Organismen kann durch Agarose- oder Polyacrylamid-Gelelektrophorese oder andere Trennungstechniken getrennt werden. DNA aus den Genbanken oder die aufgetrennte DNA kann auf Nitrocellulose oder anderes geeignetes Trägermaterial überführt und darauf immobilisiert werden. Um Klone oder DNA, welche mit SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 2, den Nucleotiden 56 bis 1858 von SEQ ID NO: 4, den Nukleotiden 285 bis 1319 von SEQ ID NO: 21 SEQ ID NO: 6 und den Nucleotiden 4 bis 1584 von SEQ ID NO: 8 oder Subsequenzen davon homolog sind, zu identifizieren, wird die immobilisierte DNA mit einer Sonde hybridisieren gelassen, die mit einer von diesen Sequenzen hybridisiert. Nach der Hybridisierung wird das Trägermaterial gewaschen. Zum Beispiel wird ein Southern Blot, der eine Sonde gehabt hat, die zu auf ihr immobilisierter DNA hybridisierte, indem er dreimal für jeweils 30 Minuten unter Verwendung von 0,2 × SSC, 0,1% SDS bei 40°C, stärker bevorzugt nicht höher als 45°C, stärker bevorzugt nicht höher als 50°C, stärker bevorzugt nicht höher als 55°C, noch stärker bevorzugt nicht höher als 60°C, speziell nicht höher als 65°C, gewaschen wird. Moleküle, zu welchen die Sonde unter diesen Bedingungen hybridisiert, werden unter Verwendung von auf dem Fachgebiet bekannten Methoden nachgewiesen. Diese Moleküle können dann kloniert und funktionell transformiert werden, um zu bestimmen, daß sie die gewünschte enzymatische Aktivität haben, und um die Nucleotidsequenzidentität mit SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 2, den Nucleotiden 56 bis 1858 von SEQ ID NO: 4, den Nukleotiden 285 bis 1319 von SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 6 und den Nucleotiden 4 bis 1584 von SEQ ID NO: 8 zu bestimmen.

In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist die rekombinante Hefe funktionell mit einer Codierungsregion transformiert, die aus einer Codierungsregion, codierend ein Protein mit LGDH-Aktivität und immunologischen Eigenschaften eines Enzyms mit SEQ ID NO: 11; Enzyme mit AGD-Aktivität und immunologischen Eigenschaften eines Enzyms mit SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3; und Enzyme mit ARA-Aktivität und immunologischen Eigenschaften eines Enzyms mit SEQ ID NO: 20 und Enzyme mit ALO-Aktivität und immunologischen Eigenschaften eines Enzyms mit SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NO: 7, ausgewählt ist.

So betrifft die vorliegende Erfindung auch Polypeptide mit (1) LGDH-, AGD- ARA, oder ALO-Aktivität und (2) immunochemischer Identität oder teilweiser immunochemischer Identität mit den Polypeptiden mit den Aminosäuresequenzen (a) SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NO: 7 und (b) ähnlicher Enzymaktivität. Ein Polypeptid mit immunologischen Eigenschaften eines Enzyms mit einer speziellen SEQ ID bedeutet, daß ein Antiserum, enthaltend Antikörper gegen die Antigene des nativen Polypeptids mit der speziellen SEQ-ID-Zahl mit den Antigenen des anderen Proteins mit ähnlicher Enzymaktivität, aber einer unterschiedlichen Aminosäuresequenz in einer identischen Weise reagiert, wie beispielsweise totale Fusion von Niederschlägen, identische Morphologie des Niederschlags und/oder identische elektrophoretische Mobilität unter Verwendung einer speziellen immunochemischen Technik. Eine weitere Erklärung immunochemischer Identität ist von Axelsen, Bock und Krøll in N. H. Axelsen, H. Krøll und B. Weeks, Herausgeber, A Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis (Ein Handbuch quantitativer Immunoelektrophorese), Blackwell Scientific Publications, 1973, Kapitel 10, beschrieben.

Teilweise immunochemische Identität bedeutet, daß ein Antiserum, enthaltend Antikörper gegen die Antigene des nativen Enzyms (z.B. Enzyme mit Aminosäuresequenzen von SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NO: 7) mit den Antigenen eines Polypeptids mit ähnlicher Enzymaktivität wie das native Enzym in einer teilweise identischen Weise reagiert, wie beispielsweise teilweise Fusion von Niederschlägen, teilweise identische Morphologie des Niederschlags und/oder teilweise identische elektrophoretische Mobilität unter Verwendung einer speziellen immunochemischen Technik. Eine weitere Erklärung teilweiser immunochemischer Identität ist von Bock und Axelsen in N. H. Axelsen, H. Krøll und B. Weeks, Herausgeber, A Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis (Ein Handbuch quantitativer Immunoelektrophorese), Blackwell Scientific Publications, 1973, Kapitel 11 beschrieben.

Die immunologischen Eigenschaften werden durch Identitätstests mit immunologischer Kreuzreaktion durch die bekannte Ouchterlony-Verfahrensweise der doppelten Immundiffusion bestimmt. Genau gesagt wird ein Antiserum gegen das Polypeptid der Erfindung durch Immunisieren von Kaninchen gezüchtet (oder anderen Nagetieren, entsprechend der Verfahrensweise, beschrieben von Harboe und Ingild, in N. H. Axelsen, H. Krøll und B. Weeks, Herausgeber, A Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis (Ein Handbuch quantitativer Immunoelektrophorese), Blackwell Scientific Publications, 1973, Kapitel 23, oder Johnstone und Thorpe, Immunochemistry in Practice (Immunchemie in der Praxis), Blackwell Scientific Publications, 1982 (genauer gesagt die Seiten 27–31)). Monoklonale Antikörper können hergestellt werden, z.B. nach den Verfahren von E. Harlow und D. Lane, Herausgeber, 1988, Antibodies, A Laboratory Manual (Antikörper, ein Laborhandbuch), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York. Gereinigte Immunoglobuline können aus dem Antiserum, z.B. durch Ammoniumsulfatausfällung, gefolgt von Dialyse und Ionenaustauschchromatographie, erhalten werden (z.B. DEAE-Sephadex). Homologe Polypeptide und Polypeptide mit identischen oder teilweise identischen immunologischen Eigenschaften können aus Mikroorganismen einer beliebigen Gattung, vorzugsweise aus einem Pflanzen-, Tier- oder Pilzausgangsstoff, erhalten werden.

In einer anderen bevorzugten Ausführungsform, in der als zweites Enzym ARA codiert wird, enthält das ARA-Enzym Motiv I und Motiv II der Superfamilie der Aldo-Keto-Reduktase (AKR), insbesondere die Aminosäuresequenz GXRXXDXAXXXXXEXXXG (SEQ ID NO: 13) und bzw. GXXN (SEQ ID NO: 26) (Kim S. T. et al. 1998, BBA, 1429, 29–39).

Vorzugsweise wird eine Codierungsregion, codierend ein gewünschtes Enzym, in die Hefe in einer derartigen Weise eingebracht, daß das gewünschte Enzym in der Hefe erzeugt wird und im wesentlichen funktionell ist. Eine derartige Hefe kann hier als „funktionell transformiert" bezeichnet werden.

Sobald die Codierungsregion isoliert worden ist, kann sie für Transformation in die und Expression in der Hefe, verwendbar in der vorliegenden Erfindung, vorbereitet werden. Im Minimum beinhaltet dies die Insertion der Codierungsregion in einen Vektor und operable Verknüpfung mit einem Promotor, gefunden auf dem Vektor und aktiv in dem Zielorganismus (d.h. in der vorliegenden Erfindung eine Hefe). Ein beliebiger Vektor (integrativ, chromosomal oder episomal) kann verwendet werden.

Ein beliebiger Promotor, aktiv in dem Zielwirt (homolog oder heterolog, konstitutiv, induzierbar oder reprimierbar) kann verwendet werden. Eine derartige Insertion beinhaltet oft die Verwendung von Restriktionsendonucleasen, um den Vektor an einem gewünschten Punkt „zu öffnen", wo operable Verknüpfung mit dem Promotor, gefolgt von Ligation der Codierungsregion in den gewünschten Punkt, möglich ist. Wenn gewünscht, kann die Codierungsregion vor Insertion in den Vektor zur Verwendung in dem Zielorganismus vorbereitet werden. Dies kann Ändern der Codons, verwendet in der Codierungsregion, um vollständiger der Codonverwendung des Zielorganismus zu entsprechen; Verändern der Sequenzen in der Codierungsregion, die die Transkription oder Translation der Codierungsregion oder die Stabilität eines mRNA-Transkripts der Codierungsregion beeinträchtigen könnten; oder Hinzufügen oder Entfernen von Anteilen, codierend signalgebende Peptide (Regionen des Proteins, codiert durch die Codierungsregion, die das Protein zu speziellen Lagen richten (z.B. eine Organelle, die Membran der Zelle oder einer Organelle oder extrazelluläre Sekretion), unter anderen auf dem Fachgebiet bekannten möglichen Vorbereitungen beinhalten.

In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfaßt das L-Galactono-1,4-lacton-Dehydrogenase-Protein (AGD) als ein zweites Enzym ein signalgebendes Peptid, und die Codierungsregion, codierend die L-Galactono-1,4-lacton-Dehydrogenase, codiert auch das signalgebende Peptid. In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfaßt das L-Galactono-1,4-lacton-Dehydrogenase-Protein (AGD) als zweites Enzym kein signalgebendes Peptid und die Codierungsregion, codierend die L-Galactono-1,4-lacton-Dehydrogenase, codiert auch kein signalgebendes Peptid. Genau gesagt umfaßt die AGD-Sequenz, angegeben in SEQ ID NO: 1, ein signalgebendes Peptid der Aminosäuren 1–100 und umfaßt die AGD-Sequenz, angegeben in SEQ ID NO: 2, ein signalgebendes Peptid der Aminosäuren 1–90. Wie der Fachmann erkennt, kann Deletion einer Nucleinsäuresequenz, codierend ein signalgebendes Peptid von einer längeren Nucleinsäuresequenz, codierend ein gewünschtes Enzym, die Zugabe eines im-Rahmen-ATG-Codons erfordern, um richtige Initiierung von Translation des gewünschten Enzyms zu erlauben.

Ungeachtet dessen, ob die Codierungsregion modifiziert ist, wird die Codierungsregion, wenn sie in den Vektor insertiert wird, operabel mit einem in der Hefe aktiven Promotor verknüpft. Ein Promotor, wie bekannt ist, ist eine DNA-Sequenz, die die Transkription einer nahegelegenen Codierungsregion richten kann. Wie bereits beschrieben kann der Promotor konstitutiv, induzierbar oder reprimierbar sein. Induzierbare Promotoren können durch die Zugabe eines geeigneten Inducer-Moleküls zu dem Medium oder durch eine geeignete Veränderung der chemischen oder physikalischen Wachstumsumgebung (wie beispielsweise die Temperatur, pH-Werte) induziert werden, wie durch die Identität des Promotors bestimmt wird. Reprimierbare Promotoren können durch die Zugabe eines geeigneten Repressormoleküls zu dem Medium oder durch eine geeignete Veränderung der chemischen oder physikalischen Wachstumsumgebung (wie beispielsweise die Temperatur, pH-Werte) reprimiert werden, wie durch die Identität des Promotors bestimmt wird. Konstitutive Promotoren werden bevorzugt, da die Verwendung eines Inducer- oder Repressormoleküls oder eine Veränderung der chemischen oder physikalischen Wachstumsumgebung nicht erforderlich ist. Ein bevorzugter konstitutiver Promotor ist der S. cerevisiae Triosephosphatisomerase-(TPI)-Promotor.

Der Vektor, umfassend die Codierungsregion, operabel verknüpft mit dem Promotor, kann unter anderen, von denen auf dem Fachgebiet bekannt ist, zur Verwendung in Hefegattungen geeignet zu sein, ein Plasmid, ein Cosmid oder ein künstliches Chromosom der Hefe sein. Zusätzlich zu der Codierungsregion, operabel verknüpft mit dem Promotor, kann der Vektor auch andere genetische Elemente umfassen. Zum Beispiel umfaßt, wenn nicht erwartet wird, daß der Vektor in das Hefegenom integriert, der Vektor wünschenswerterweise einen Replikationsursprung, welcher erlaubt, daß der Vektor an die Nachkommenzellen einer Hefe, umfassend den Vektor, weitergegeben wird. Wenn Integration des Vektors in das Hefegenom gewünscht wird, kann der Vektor Sequenzen homolog zu Sequenzen, gefunden in dem Hefegenom, umfassen und kann auch Codierungsregionen umfassen, die die Integration erleichtern können. Um zu bestimmen, welche Hefezellen transformiert sind, umfaßt der Vektor vorzugsweise einen selektierbaren Marker oder ein screenbaren Marker, welcher einen Phänotyp an die Hefe vermittelt, der sie von untransformierter Hefe unterscheidet, z.B., unter anderen Phänotypen, überlebt sie auf einem Medium, umfassend ein Antibiotikum, tödlich für untransformierte Hefe, oder metabolisiert sie eine Komponente des Mediums in ein Produkt, was die untransformierte Hefe nicht tut. Zusätzlich kann der Vektor andere genetische Elemente, wie beispielsweise Restriktionsendonuclease-Stellen und andere, typischerweise gefunden in Vektoren, umfassen.

Nachdem der Vektor hergestellt worden ist, wobei die Codierungsregion operabel mit dem Promotor verknüpft ist, wird die Hefe mit dem Vektor transformiert (d.h. der Vektor wird in mindestens eine von den Zellen einer Hefepopulation eingeführt). Techniken für Hefetranformation sind etabliert und schließen unter anderem Elektroporation, Mikroprojektil-Bombardierung und das LiAc/ssDNA/PEG-Verfahren ein. Hefezellen, welche transformiert sind, können dann durch die Verwendung eines screenbaren oder selektierbaren Markers auf dem Vektor nachgewiesen werden. Es sollte vermerkt werden, daß der Ausdruck „transformierte Hefe" im wesentlichen die gleiche Bedeutung hat wie „rekombinante Hefe", wie sie vorstehend definiert wurde. Die transformierte Hefe kann eine sein, die den Vektor in einer Transformationstechnik empfangen hat, oder kann eine Nachkommenschaft einer derartigen Hefe sein.

Bestimmte Ausführungsformen sind auf eine rekombinante Hefe gerichtet, die funktionell mit einer Codierungsregion, codierend ein Protein mit einer ALO-Enzym-Aktivität und wahlweise eine weitere Codierungsregion codierend L-Galactose-Dehydrogenase (LGDH), L-Galactono-1,4-lacton-Dehydrogenase (AGD) oder D-Arabinose-Dehydrogenase (ARA), transformiert, wie vorstehend beschrieben wurde.

Nachdem eine rekombinante Hefe erhalten worden ist, wird die Hefe in einem Medium kultiviert. Das Medium ist wie vorstehend beschrieben.

Ein bevorzugtes Medium umfaßt Glucose, YNB und L-Galactose. Eine besonders bevorzugte transformierte Hefe, welche in diesem Medium kultiviert werden kann, ist ein S. cerevisiae Stamm (vorzugsweise GRF18U) oder ein Z. bailii Stamm (vorzugsweise ATCC 36947), umfassend (i) einen TPI-Promotor, operabel verknüpft mit einer Codierungsregion, codierend S. cerevisiae D-Arabinono-1,4-lacton-Oxydase (ALO) und (ii) einen TPI-Promotor, operabel verknüpft mit einer Codierungsregion, codierend A. thaliana L-Galactose-Dehydrogenase (LGDH). Eine zweite besonders bevorzugte transformierte Hefe, welche in diesem Medium kultiviert werden kann, ist ein S. cerevisiae Stamm (vorzugsweise GRF18U) oder ein Z. bailii Stamm (vorzugsweise ATCC 36947), umfassend (i) einen TPI-Promotor, operabel verknüpft mit einer Codierungsregion, codierend S. cerevisiae D-Arabinono-1,4-lacton-Oxidase (ALO) und (ii) einen TPI-Promotor operabel verknüpft mit einer Codierungsregion, codierend S. cerevisiae D-Arabinose-Dehydrogenase (ARA).

Wie vorstehend für nicht-rekombinante Hefe beschrieben wird während des Verlaufs der Fermentation die Ascorbinsäurevorstufe durch einen oder mehrere Schritte in L-Ascorbinsäure umgewandelt.

Während die nicht-rekombinanten Hefezellen (beschrieben vorstehend), inkubiert in ähnlichen Medien, typischerweise nicht Ascorbinsäure über Hintergrundgehalte in dem Medium anreichern, sind überraschenderweise die hier beschriebenen rekombinanten Stämme imstande, beträchtliche Mengen von L-Ascorbinsäure über Hintergrundgehalte anzureichern. Eine Hefe, transformiert mit nur LGDH, reichert nicht L-Ascorbinsäure über Hintergrundgehalte an. Eine Hefe, transformiert mit RGLO und/oder AL, reichert nicht L-Ascorbinsäure über Hintergrundgehalte an. Die rekombinante Hefe, verwendet gemäß der vorliegenden Erfindung, reichert L-Ascorbinsäure in dem Medium über Hintergrundgehalte an.

Isolierung der Ascorbinsäure aus den Medien geschieht wie vorstehend beschrieben. Ausbeuten von Ascorbinsäure von mehr als etwa 25% und 35% sind beobachtet worden, wie nachstehend in den Beispielen beschrieben wird. Daher erzeugt in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform die rekombinante Hefe Ascorbinsäure mit einer Ausbeute von mehr als 25% der Vorstufe. Der Begriff „Ausbeute" bezeichnet die erzeugte Menge von Ascorbinsäure (molar ebenso wie Gewicht/Volumen), dividiert durch die verbrauchte Menge von Vorstufe (molar ebenso wie Gewicht/Volumen), multipliziert mit 100.

Die folgenden Definitionen werden bereitgestellt, um den Fachmann beim Verständnis der ausführlichen Beschreibung der vorliegenden Erfindung zu unterstützen.

Der Begriff „Anreicherung von Ascorbinsäure über Hintergrundgehalte" bezeichnet die Anreicherung von Ascorbinsäure über die nicht nachweisbaren Gehalte, wie sie unter Verwendung der hier beschriebenen Verfahrensweisen bestimmt wird.

„Ascorbinsäure" ebenso wie „Ascorbat" bezeichnen, wie hier verwendet, Vitamin C, L-Ascorbinsäure und Salze oder Ionen davon.

„Ascorbinsäurevorstufe" ist eine Verbindung, die durch eine Hefe der vorliegenden Erfindung, entweder direkt oder durch eine oder mehrere Zwischenverbindungen, in L-Ascorbinsäure oder ein Salz davon umgewandelt werden kann.

„Amplifikation" bezeichnet das Anwachsen der Anzahl von Kopien eines gewünschten Nucleinsäuremoleküls oder die Zunahme der Aktivität eines Enzyms durch welche Mittel auch immer.

„Kohlenstoffquelle" bezeichnet eine organische Verbindung, verwendet durch Hefe in Kultur als Quelle von Kohlenstoff, um neue Biomasse zu erzeugen, und im zellulären Metabolismus.

„Codon" bezeichnet eine Sequenz von drei Nucleotiden, die eine spezielle Aminosäure spezifizieren. „DNA-Ligase" bezeichnet ein Enzym, das kovalent zwei Stücke von doppelsträngiger DNA verbindet.

„Elektroporation" bezeichnet ein Verfahren der Einführung von fremder DNA in Zellen, das eine kurze Ladung von Gleichstrom mit hoher Spannung verwendet, um die Wirtszellen zu permeabilisieren, wobei sie veranlaßt werden, extra-chromosomale DNA aufzunehmen.

„Endonuclease" bezeichnet ein Enzym, das doppelsträngige DNA an inneren Standorten hydrolysiert.

Enzym 1.1.3.37, D-Arabinono-1,4-lacton-Oxidase, bezeichnet ein Protein, das die Umwandlung von D-Arabinono-1,4-lacton + O2 in D-Erythroascorbat + H2O2 katalysiert. Das gleiche Enzym katalysiert aufgrund der Breite des Substratbereichs die Umwandlung von L-Galactono-1,4-lacton + 02 in L-Ascorbinsäure + H2O2. Irrtümlicherweise wird das gleiche Enzym als L-Galactono-1,4-lacton-Oxidase (Enzym 1.1.3.24) bezeichnet (siehe Huh, W. K. et al., 1998, Mol. Microbiol. 30, 895–903) (Nishikimi, M., et al., 1978, Arch. Biochem. Biophys. 191, 47986) (Bleeg, H. S. und Christensen, F., 1982, Eur. J. Biochem. 127, 391–96).

Enzym 1.3.2.3, L-Galactono-1,4-lacton-Dehydrogenase, bezeichnet ein Protein, das die Umwandlung von L-Galactono-1,4-lacton + 2 Ferricytochrom C in L-Ascorbinsäure + 2 Ferrocytochrom C katalysiert.

Enzym 1.1.3.8, L-Gulono-1,4-lacton-Oxidase, bezeichnet ein Protein, das die Oxidation von L-Gulono-1,4-lacton zu L-Xylo-hexulonolacton katalysiert, welches spontan zu L-Ascorbinsäure isomerisiert. Andere interessierende Enzyme und ihre Klassifikationsnummern sind wie folgt: Hexokinase 2.7.1.1 Glucose-6-P-Isomerase 5.3.1.9 Mannose-6-P-Isomerase 5.3.1.8 Phosphomannomutase 5.4.2.8 Mannose-1-P-Guanylyltransferase 2.7.7.22 GDP-Mannose-3,5-Epimerase 5.1.3.18 Zucker-Phosphatase 3.1.3.23 L-Galactose-Dehydrogenase *) L-Galactono-1,4-lacton-Dehydrogenase 1.3.2.3 D-Mannose-Kinase 2.7.1.1 Phosphoglucomutase 5.4.2.2 UTP-Glucose-1-P-uridilyltransferase 2.7.7.9 UDP-D-Glucose-Dehydrogenase 1.1.1.22 UDP-Glucuronat-4-Epimerase 5.1.3.6 Glucuronat-1-P-Uridilyltransferase 2.7.7.44 D-Glucuronokinase 2.7.1.43 D-Glucuronat-Reduktase 1.1.1.19 Aldonolactonase 3.1.1.17 L-Gulono-1,4-lacton-Oxidase 1.1.3.8 Uronolactonase 3.1.1.19 Glucuronolacton-Reduktase-Aktivität 1.1.1.20 L-Galactono-1,4-lacton-3-Epimerase *) Galacturonat-1-P-Uridilyltransferase *) Galacturonokinase 2.7.1.44 Hexuronat-(D-Galacturonat)-Reduktase *) Myoinositol-1-P-Synthase 5.5.1.4 Myoinositol-1-P-Monophosphatase 3.1.3.25 Myoinositol-Oxygenase 1.13.99.1 D-Galactokinase 2.7.1.6 UTP-Hexose-1-P-Uridilyltransferase 2.7.7.10 UDP-Glucose-4-Epimerase 5.1.3.2 Suc-Synthase 2.4.1.13 Fructokinase 2.7.1.4

  • *) Klassifizierungsnummer in Datenbanken nicht verfügbar.

Der Begriff „Expression" bezeichnet die Transkription eines Gens, um die entsprechende mRNA zu erzeugen, und Translation dieser mRNA, um das entsprechende Genprodukt, d.h. ein Peptid, Polypeptid oder Protein, zu erzeugen.

Der Ausdruck „funktionell verknüpft" oder „operabel verknüpft" bezeichnet einen Promotor oder eine Promotorregion und eine Codierung oder strukturelle Sequenz in einer derartigen Orientierung und Distanz, daß Transkription der Codierung oder strukturellen Sequenz durch den Promotor oder die Promotorregion gerichtet werden können.

Der Begriff „Gen" bezeichnet chromosomale DNA, Plasmid-DNA, cDNA, synthetische DNA oder andere DNA, die ein Peptid, Polypeptid, Protein oder RNA-Molekül und Regionen, flankierend die Codierungssequenz, beteiligt an der Regulierung der Expression, codiert.

Der Begriff „Genom" umschließt sowohl die Chromosomen als auch die Plasmide innerhalb einer Wirtszelle. Codierende DNAs der vorliegenden Erfindung, eingeführt in Wirtszellen, können daher entweder chromosomal integriert oder Plasmid-lokalisiert sein.

„Heterologe DNA" bezeichnet DNA aus einer Quelle, unterschiedlich von der der Empfängerzelle.

„Homologe DNA" bezeichnet DNA aus der gleichen Quelle wie der der Empfängerzelle.

„Hybridisierung" bezeichnet die Fähigkeit eines Stranges von Nucleinsäure, sich mit einem komplementären Strang durch Basenpaarung zu verbinden. Hybridisierung erfolgt, wenn komplementäre Sequenzen in den zwei Nucleinsäuresträngen sich aneinander binden.

Der Begriff „Medium" bezeichnet die chemische Umgebung der Hefe, umfassend eine Komponente, erforderlich für das Wachstum der Hefe oder der rekombinanten Hefe, und eine oder mehrere Vorstufen für die Herstellung von Ascorbinsäure. Komponenten für das Wachstum der Hefe und Vorstufen für die Herstellung von Ascorbinsäure können identisch sein oder nicht.

„Offener Leserahmen (ORF)" bezeichnet eine Region von DNA oder RNA, codierend ein Peptid, Polypeptid oder Protein.

„Plasmid" bezeichnet ein zirkuläres, extra-chromosomales, replizierbares Stück von DNA.

„Polymerasekettenreaktion (PCR)" bezeichnet eine enzymatische Technik, mehrfache Kopien einer Sequenz von Nucleinsäure zu erzeugen. Kopien einer DNA-Sequenz werden durch Shuttling einer DNA-Polymerase zwischen zwei Amplimeren hergestellt. Die Basis dieses Amplifizierungsverfahrens besteht in mehrfachen Zyklen von Temperaturänderungen, um Amplimere zu denaturieren, dann zu reannealen, mit nachfolgender Extension, um neue DNA-Stränge in der Region, gelegen zwischen den flankierenden Amplimeren, zu synthetisieren.

Der Begriff „Promotor" oder „Promotorregion" bezeichnet eine DNA-Sequenz, gewöhnlich stromaufwärts (5') zu einer Codierungssequenz gefunden, die Expression der Codierungssequenz durch Steuern der Herstellung von Messenger-RNA (mRNA) steuert, indem die Erkennungsstelle für RNA-Polymerase und/oder andere Faktoren, notwendig für den Start von Transkription an der korrekten Stelle, bereitgestellt werden.

Eine „rekombinante Zelle" oder „transformierte Zelle" ist eine Zelle, die eine Nucleinsäuresequenz, nicht natürlicherweise in der Zelle vorkommend, oder eine zusätzliche Kopie oder Kopien einer endogenen Nucleinsäuresequenz enthält, wobei die Nucleinsäuresequenz durch menschliche Aktion in die Zelle oder einen Vorläufer davon eingeführt wird.

Der Begriff „rekombinanter Vektor" oder „rekombinantes DNA- oder RNA-Konstrukt" bezeichnet ein beliebiges Mittel wie beispielsweise ein Plasmid, Cosmid, Virus, autonom replizierende Sequenz, Phage oder lineare oder zirkuläre einsträngige oder doppelsträngige DNA- oder RNA-Nucleotidsequenz, abgeleitet von einer beliebigen Quelle, imstande zu genomischer Integration oder autonomer Replikation, umfassend ein Nucleinsäuremolekül, in welchem ein oder mehrere Sequenzen in einer funktionell operativen Weise verknüpft worden sind. Derartige rekombinante Konstrukte oder Vektoren sind imstande, eine 5'-Regulierungssequenz oder Promotorregion und eine DNA-Sequenz für ein ausgewähltes Genprodukt in eine Zelle in einer derartigen Weise einzuführen, daß die DNA-Sequenz in eine funktionelle mRNA transkribiert wird, welche translatiert werden kann oder nicht und daher exprimiert werden kann.

„Restriktionsenzym" bezeichnet ein Enzym, das eine spezielle Sequenz von Nucleotiden in doppelsträngiger DNA erkennt und beide Stränge spaltet; es wird auch Restriktionsendonuclease genannt. Spaltung erfolgt typischerweise innerhalb der Restriktionsstelle oder nahe zu ihr.

„Selektierbarer Marker" bezeichnet eine Nucleinsäuresequenz, deren Expression einen Phänotyp überträgt, der die Identifizierung von Zellen, enthaltend die Nucleinsäuresequenz, erleichtert. Zu selektierbaren Markern gehören diejenigen, welche Resistenz gegen toxische Chemikalien (z.B. Ampicillin, Kanamycin, G418, Hygromycin) übertragen oder eine die Ernährung betreffende Defizienz komplementieren (z.B. Uracil, Histidin, Leucin).

„Screenbarer Marker" bezeichnet eine Nucleinsäuresequenz, deren Expression eine sich visuell unterscheidende Eigenschaft vermittelt (z.B. Farbänderungen, Fluoreszenz).

„Transkription" bezeichnet den Prozeß der Erzeugung einer RNA-Kopie aus einem DNA-Templat.

„Transformation" bezeichnet einen Prozeß der Einführung einer exogenen Nucleinsäuresequenz (z.B. ein Vektor, Plasmid oder rekombinantes Nucleinsäuremolekül) in eine Zelle, in welchem diese exogene Nucleinsäure in ein Chromosom eingebracht wird oder zu autonomer Replikation imstande ist. Eine Zelle, die Transformation durchlaufen hat, oder ein Abkömmling einer derartigen Zelle ist „transformiert" oder „rekombinant". Wenn die exogene Nucleinsäure eine Codierungsregion, codierend ein gewünschtes Protein, umfaßt und das gewünschte Protein in der transformierten Hefe erzeugt wird und im wesentlichen funktionell ist, ist eine derartige transformierte Hefe „funktionell transformiert".

„Translation" bezeichnet die Herstellung von Protein aus Messenger-RNA.

Der Begriff „Ausbeute" bezeichnet die erzeugte Menge von Ascorbinsäure (molar oder Gewicht/Volumen), dividiert durch die verbrauchte Menge von Vorstufe (molar oder Gewicht/Volumen), multipliziert mit 100.

„Einheit" von Enzym bezieht sich auf die enzymatische Aktivität und zeigt die Menge von Mikromolen von Substrat, umgewandelt pro mg von Gesamtzellproteinen pro Minute, an.

„Vektor" bezeichnet ein DNA- oder RNA-Molekül (wie beispielsweise, unter anderen, ein Plasmid, Cosmid, Bakteriophage, künstliches Chromosom der Hefe oder Virus), das Nucleinsäuresequenzen in eine Wirtszelle trägt. Der Vektor oder ein Teil von ihm kann in das Genom der Wirtszelle insertiert werden.

LISTE VON ABKÜRZUNGEN:

  • Asc L-Ascorbinsäure (Vitamin C) oder ein Salz davon
  • AGD L-Galactono-1,4-lacton-Dehydrogenase
  • AL Aldonolactonase
  • ALO D-Arabinono-1,4-lacton-Oxidase
  • ARA D-Arabinose-Dehydrogenase
  • Gal L-Galactono-1,4-lacton
  • Gul L-Gulono-1,4-lacton
  • LGDH L-Galactose-Dehydrogenase
  • GLO L-Gulono-1,4-lacton-Oxidase
  • RGLO L-Gulono-1,4-lacton-Oxidase, isoliert aus R. norvegicus
  • TCA Trichloressigsäure
  • TPI Triosephosphatisomerase
  • OD660 optische Dichte bei 660 nm

Es sollte bemerkt werden, daß die Abkürzungen für die Enzymaktivitäten die jeweiligen Aktivitäten und nicht ein spezielles Enzym bezeichnen.

BEISPIELE

Die folgenden Beispiele sind eingeschlossen, um bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung zu demonstrieren. Es sollte vom Fachmann erkannt werden, daß die Techniken, offenbart in den Beispielen, welche folgen, Techniken darstellen, die von den Erfindern entdeckt wurden, um in der praktischen Ausführung der Erfindung gut zu funktionieren, und so dafür angesehen werden können, bevorzugte Arten für ihre praktische Ausführung auszumachen. Jedoch sollte der Fachmann angesichts der vorliegenden Offenbarung erkennen, daß viele Veränderungen in den speziellen Ausführungformen, welche offenbart sind, gemacht werden können und dennoch ein gleiches oder ähnliches Ergebnis erhalten, ohne von der Erfindung abzuweichen

MATERIALIEN UND METHODEN 1. BESTIMMUNG VON ASCORBINSÄURE

Ascorbinsäure wurde spektrophotometrisch bestimmt, indem einem Verfahren nach Sullivan et al. (1955, Assoc. Off. Agr. Chem., 38, 514–518) gefolgt wurde. 135 &mgr;l Probe wurden in einer Küvette mit 40 &mgr;l H3PO4 (85%) gemischt. Dann wurden 675 &mgr;l &agr;,&agr;'-Bipyridyl (0,5%) und 135 &mgr;l FeCl3 (1%) hinzugefügt. Nach 10 min wurde die Extinktion bei 525 nm gemessen. Die Identität der Ascorbinsäure wurde durch HPLC (Tracer-Extrasil-Säule C8, 5 &mgr;M, 15 × 0,46 cm, Teknokroma, S. Coop. C. Ltda. # TR-016077; Eluent: 5 mM Cetyltrimethylammoniumbromid, 50 mM KH2PO4 in 95/5 H2O/Acetonitril; Fließgeschwindigkeit: 1 ml min–1, Nachweis UV @ 254 nm) mit reiner L-Ascorbinsäure (Aldrich, A9, 290-2) als Standard bestätigt.

2. BESTIMMUNG DER PROTEINKONZENTRATION

Proteinkonzentrationen wurden in Befolgung der Lowry-Methode (Lowry O. H. et al., 1951, J. Biol. Chem. 193, 265–275) bestimmt, indem der Bio-Rad DC Protein Assay Kit II (Kat.-Nr. 500-0112) mit BSA als Standard verwendet wurde.

3. AMPLIFIKATION SPEZIELLER GENSEQUENZEN

Um spezielle Gensequenzen zu amplifizieren, wurde PfuTurbo DNA-Polymease (Stratagene #600252) auf einem GeneAmp PCR System 9700 (PE Appl. Biosystems, Inc.) verwendet. Verwendete Standardbedingungen waren: 400 &mgr;M dNTP, 0,5 &mgr;M Primer, 0,5 mM MgCl2 (zusätzlich zu dem Puffer) und 3,75 U Pfu pro 100 &mgr;l Reaktion.

Die Sequenzen der verwendeten Gene sind öffentlich über die Genbank wie folgt berichtet worden

Das folgende Programm wurde zur Amplifikation von AGD verwendet:

Das folgende Programm wurde zur Amplifikation von AL verwendet:

Das folgende Programm wurde zur Amplifikation von ALO verwendet:

Das folgende Programm wurde zur Amplifikation von ARA verwendet:

Das folgende Programm wurde zur Amplifikation von LGDH verwendet:

Das folgende Programm wurde zur Amplifikation von RGLO verwendet:

Templat-DNA für AGD und LGDH: 50 ng Plasmid cDNA-Genbank pFL61 Arabidopsis (ATCC #77500 (Minet M. et al., 1992, Plant J., 2, 417–422)). Templat-DNA für RGLO: 0,5 ng Rattenleber Marathon-Ready-cDNA-Genbank (Clontech #7471-1). Templat-DNA für AL: 50 ng genomische DNA von Zymomonas mobilis (ATCC #10988), extrahiert unter Verwendung eines Standardverfahrens. Templat-DNA für ALO und ARA: 50 ng genomische DNA von S. cerevisiae GRF18U, extrahiert unter Verwendung eines Standardverfahrens. PCR-Produkte wurden in die EcoRV-Stelle von pSTBlue-1 unter Verwendung des perfekt mit glattem Ende klonierenden Kits von Novagen Inc. (#70191-4) mit glattem Ende kloniert.

4. PLASMIDKONSTRUKTION

Die hier verwendete benennende Konvention ist, daß pSTBlue-1, enthaltend zum Beispiel AGD in Sense-Richtung hinsichtlich seiner mehrfachen Klonierungsstelle (MCS), als pSTB AGD-1 bezeichnet wurde. In einem weiteren Beispiel wurde pSTBlue-1, enthaltend AGD in antisense-Richtung hinsichtlich seiner MCS, als pSTB AGD-2 und so weiter bezeichnet.

Standardverfahrensweisen wurden für alle Klonierungszwecke angewendet (Sambrook J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Molekulares Klonieren: Ein Laborhandbuch), Cold Spring Harbor Laboratory Press).

Konstruktion des Expressionsplasmids:

Die pYX-Plasmide sind eine Serie von im Handel erhältlichen Hefeexpressionsvektoren (R & D Systems, Inc.).

pAG26TPI:

Die Expressionskassette (bestehend aus TPI-Promotor, mehrfacher Klonierungsstelle und Terminator) aus pYX022 wurde mit den Restriktionsenzymen AatII/PvuII geschnitten, mit glatten Enden versehen und in pAG26 kloniert (Goldstein A. L. und McCusker J. H., 1999, Yeast 15, 1541–1553), welches mit Restriktionsenzym ApaI geschnitten worden war und mit glatten Enden versehen worden war.

pZ3:

Die ARS/CEN-Region wurde aus YCplac33 geschnitten (Gietz R. D. und Sugino A., 1988, Gene 74, 527–534), indem sie mit dem Restriktionsenzym ClaI geschnitten wurde, die Enden glatt gemacht wurden und mit dem Restriktionsenzym SpeI geschnitten und in pYX022 kloniert wurde, welches mit dem Restriktionsenzym DraIII geschnitten worden war, behandelt, um die Enden glatt zu machen, und mit dem Restriktionsenzym SpeI geschnitten. Das resultierende Plasmid wurde mit dem Restriktionsenzym KpnI geöffnet und die Enden glatt gemacht, um die G418-Resistenzkassette zu erhalten, geschnitten aus pFA6-KanMX4 (Wach et al., 1994, Yeast 10, 1793–1808) mit den Restriktionsenzymen SphI/SacI und die Enden glatt gemacht.

5. HEFEKULTIVIERUNG UND UNTERSUCHUNG:

Die verwendeten Hefestämme waren S. cerevisiae GRF18U, W3031B, Z. bailii ATCC 60483, Z. bailii ATCC 36947 und K. lactis PM6-7A (Wésolowski-Louvel, M. et al., 1992, Yeast 8, 711–719). GRF18U wurde bei der Agricultural Research Service Culture Collection hinterlegt und hat die folgende Katalognummer NRRL Y-30320. Alle Stämme wurden in Schüttelflaschen in Minimalmedium (0,67% Gew./Vol. YNB (Difco Laboratories, Detroit, MI #919-15), 2% Gew./Vol. Glucose, Zugabe der entsprechenden Aminosäuren oder Adenin bzw. Uracil zu 50 mg l–1) unter Standardbedingungen (Schütteln bei 30°C) kultiviert. Die anfängliche optische Dichte bei 660 nm betrug etwa 0,05.

Zur Inkubation mit L-Galactose wurden die Zellen über Nacht gezüchtet, dann wurden 250 mg l–1 L-Galactose hinzugegeben und die Zellen wurden für 24 h inkubiert. Zur Inkubation mit Substraten anders als L-Galactose wurden die Zellen in Anwesenheit von 50 mM oder 100 mM der entsprechenden Substrate für 72 h gezüchtet, wenn nicht anderweitig festgestellt. Für die Bestimmung von intrazellulärer Ascorbinsäure wurden die Zellen wie folgt behandelt; Zellen wurden durch Zentrifugation mit 4000 U/min für 5 min bei 4°C gewonnen, einmal mit kaltem destilliertem H2O gewaschen, in etwa dem 3-fachen Pelletvolumen von kaltem 10% TCA resuspendiert, heftig verwirbelt, für etwa 20 min auf Eis gehalten, und dann wurde der Überstand von der Zelldebris durch Zentrifügation geklärt.

6. HEFETRANSFORMATION

Transformation von Hefezellen wurde in Befolgung des standardmäßigen LiAc/ss-DNA/PEG-Verfahrens (Agatep, R., et al., 1998) ausgeführt. S. cerevisiae GRF 18U und verschiedenartige transformierte Hefe wurden bei der NRRL hinterlegt. Die nachstehende Tabelle führt die Stämme und ihre NRRL-Nummern auf.

Die Stämme wurden bei der Agricultural Research Service Culture Collection, 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604, USA, hinterlegt. Diese Hinterlegung wurde nach den Bestimmungen des Budapester Vertrages über die Internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke des Patentverfahrens und die Regulierungen davon (Budapester Vertrag) gemacht. Die Hefestämme werden durch die NRRL unter den Bedingungen des Budapester Vertrages über Erteilung einer US-Patentschrift mit entsprechenden Patentansprüchen verfügbar gemacht. Verfügbarkeit der hinterlegten Hefen ist nicht als Lizenz zur praktischen Ausführung der Erfindung in Übertretung der Rechte, gewährt unter der Autorität einer Regierung in Übereinstimmung mit ihren Patentgesetzen, anzusehen.

EXPERIMENTELLE ERGEBNISSE 1. STABILITÄT VON L-ASCORBINSÄURE

Um die Stabilität von L-Ascorbinsäure unter Kulturbedingungen zu bestimmen, gaben wir Ascorbinsäure zu unserem Standardmedium (2% Glucose, 0,67% YNB) hinzu und inkubierten die Lösung in Schüttelflaschen, wobei bei 30°C geschüttelt wurde. 2 zeigt die entsprechenden Ergebnisse. In sterilem Medium wird Ascorbinsäure schnell abgebaut (siehe Tafel B), wohingegen sie vollständig stabil ist, wenn lebensfähige Hefe vorhanden ist (siehe Tafel A). Dieses Ergebnis zeigt, daß Kultivieren von Hefe in einem Medium ein Verfahren zur Stabilisierung von Ascorbinsäure ist.

Daher wird die Ascorbinsäure, potentiell erzeugt durch Hefe, durch die Anwesenheit der Hefe stabilisiert, was Verfahren der vorliegenden Erfindung geeignet für die Herstellung von Ascorbinsäure macht.

2. ASCORBINSÄUREHERSTELLUNG AUS NICHT-TRANSFORMIERTEN HEFEN

Entsprechend der Literatur umfaßt Wildtyp-(wt)-Hefe eine D-Arabinono-1,4-lacton-Oxidase-Aktivität mit einer breiten Substratspezifität (Huh W. K. et al., 1994, Eur. J. Biochem. 225, 1073–1079). Derartige Aktivität wurde in vitro demonstriert. Um zu bestimmen, ob die Substrate oder das Produkt die Zellmembran durchqueren könnten, haben wir drei verschiedene Hefestämme (S. cerevisiae GRF18U und W3031B, ebenso wie Z. bailii ATCC 60483) mit L-Galactono-1,4-lacton (die letzte Vorstufe des pflanzlichen Biosyntheseweges, der zu Ascorbinsäure führt) oder L-Gulono-1,4-lacton (die letzte Vorstufe des tierischen Stoffwechselweges) inkubiert. Wie in 3 gezeigt können beide Substanzen in die Hefezelle internalisiert werden und können in Ascorbinsäure umgewandelt werden. Keine Ascorbinsäure wurde in der Kulturbrühe angereichert (nicht gezeigt), aber wesentliche Mengen wurden in den Extrakten der ganzen Zelle gemessen.

Die nächstfrühere Vorstufe auf dem Pflanzenweg ist L-Galactose. 4 zeigt die Ergebnisse der Inkubationen von Hefezellen mit diesem Substrat. S. cerevisiae, Z. bailii und K. lactis sind imstande, Ascorbinsäure aus dieser Verbindung zu erzeugen und in diesem Fall wird Ascorbinsäure im Inneren der Zelle in wesentlicher Menge angereichert (4).

3. HERSTELLUNG UND ANREICHERUNG VON ASCORBINSÄURE IN DEM MEDIUM AUS TRANSFORMIERTEN HEFEN

Wir haben die Gene, codierend für D-Arabinono-1,4-lacton-Oxidase (ALO), D-Arabinose-Dehydrogenase (ARA), L-Galactono-1,4-lacton-Dehydrogenase (AGD), L-Galactose-Dehydrogenase (LGDH), L-Gulono-1,4-lacton-Oxidase (RGLO) und Aldonolactonase (AL) kloniert. Diese Gene wurden in verfügbare Hefeexpressionsvektoren kloniert, wie in Materialien und Methoden ausgeführt ist. Kurz gesagt lenkt der TPI-Promotor, ein natürlicherweise starker und konstitutiver Promotor von S. cerevisiae, die Expression der fraglichen Gene. Bei Inkubation von S. cerevisiae GRF18U, transformiert mit AGD oder ALO, mit L-Galactono-1,4-lacton, haben die Zellen nicht nur Ascorbinsäure intrazellulär angereichert (nicht gezeigt), sondern auch überraschenderweise beträchtliche Mengen von Ascorbinsäure in die Kulturbrühe angereichert (5). Dies traf auch für die gleichen transformierten Zellen, inkubiert mit L-Galactose, zu (6). Cotransformation von L-Galactose-Dehydrogenase oder D-Arabinose-Dehydrogenase vergrößerte wesentlich die Fähigkeit des entsprechenden Hefestammes, L-Galactose in Ascorbinsäure umzuwandeln (6). Ergebnisse ähnlich den vorstehend beschriebenen für rekombinante GRF18U, wobei (a) ALO; (b) LGDH und ALO; oder (c) ARA und ALO exprimiert wurde, kultiviert in Medien, umfassend L-Galactose, wurden mit rekombinanter S. cerevisiae W3031B gesehen, wobei die entsprechenden Enzyme exprimiert wurden und in Medien, umfassend L-Galactose, kultiviert wurde. (Ergebnisse nicht angegeben). 7 zeigt Werte einer Kultur mit hoher Dichte, die L-Galactose in Ascorbinsäure umwandelt. Die entsprechenden Hefestämme wurden über Nacht in Standardminimalmedium gezüchtet. Am nächsten Tag wurden die Zellen aseptisch zentrifugiert und das Pellet wurde in 1/10 des Überstands resuspendiert, um die Zellen auf das 10-fache zu konzentrieren. Dann wurden 250 mg l–1 L-Galactose hinzugegeben und die Kulturen wurden für 6 Tage unter Standardbedingungen inkubiert. Nach 6 Tagen hatte der Stamm, transformiert mit ALO und LGDH, über 70 mg Ascorbinsäure pro Liter Kulturmedium angereichert. 30 mg l–1 Ascorbinsäure wurden intrazellulär angereichert (nicht gezeigt). Nimmt man diese zwei Werte zusammen, entspricht das einer Umwandlung von rund 40% der zugegebenen L-Galactose.

Um die Fähigkeit zu testen, Ascorbinsäure aus einer unterschiedlichen Hefe zu erzeugen, wurde Z. bailii ATCC 36947 mit ALO und/oder LGDH transformiert. Die transformierten Zellen wurden mit L-Galactose unter den gleichen Bedingungen inkubiert, wie sie für die transformierte S. cerevisiae beschrieben sind (8). Gerade wie bei den vorstehend beschriebenen Beispielen hinsichtlich S. cerevisiae wurde Anreicherung von Ascorbat in der Kulturbrühe beobachtet. Die Wildtyp-Z. bailii Zellen waren imstande, bei Inkubation mit L-Galactose eine kleinere Menge von Ascorbinsäure anzureichern. Transformation der Zellen mit einem Plasmid, übertragend Resistenz gegen das Antibiotikum G418 oder Hygromycin, und Inkubation der Zellen mit dem entsprechenden Antibiotikum scheinen diese endogene Fähigkeit aufgehoben zu haben. Funktionelle Expression von ALO oder ALO und LGDH führt zu einer deutlichen Anreicherung von Ascorbinsäure in der Kulturbrühe. Die niedrigere Anreicherung von Ascorbat durch Zellen, die ALO exprimieren, inkubiert mit beiden Antibiotika, im Vergleich zu den Zellen, die ALO exprimieren, inkubiert mit nur G418, zeigt an, daß entweder die Anwesenheit von Hygromycin oder die Expression des Hygromycin-Resistenzgens die Anreicherung/oder den Nachweis von Ascorbinsäure wesentlich beeinträchtigt. Die höhere Anreicherung von Ascorbat in Kulturen von Zellen, die ALO und LGDH exprimieren, im Vergleich zu Ascorbatgehalten in Kulturen von Zellen, die nur ALO exprimieren, wenn die Zellen in beiden Fällen in Anwesenheit von sowohl G418 als auch Hygromycin kultiviert werden, zeigt an, daß LGDH funktionell in Z. bailii exprimiert wird.

Bei Inkubation von S. cerevisiae GRF18U, transformiert mit RGLO in Anwesenheit von L-Gulono-1,4-lacton, reicherten die Zellen Ascorbinsäure intrazellulär (9), aber nicht in der Kulturbrühe an (Werte nicht angegeben). Untransformierte Zellen wandelten eine bestimmte Menge von L-Gulono-1,4-lacton aufgrund der Kreuzreaktivität des endogenen ALO wie vorstehend diskutiert um. Bei Expression von RGLO in den Zellen wurde die angereicherte Menge von Ascorbinsäure wesentlich erhöht. Zusätzliche Expression von AL führte zu niedrigeren Gehalten der Ascorbinsäureanreicherung. Aufgrund von Hydrolyse ist L-Gulono-1,4-lacton in Gleichgewicht mit L-Gulonsäure, wenn es in einer wässerigen Umgebung ist. Dieses Gleichgewicht favorisiert stark die freie Säure, aber das Gleichgewicht wird sehr langsam erreicht (Tage). Zellen, inkubiert mit L-Gulono-1,4-lacton, sind imstande, die Verbindung zu internalisieren und sie in Ascorbinsäure unzuwandeln. Bei funktioneller Coexpression von AL und beiden Enzymen RGLO und ALO konkurrieren alle drei Enzyme um Substrat von der gleichen Gleichgewichtsreaktion zwischen L-Gulono-1,4-lacton und L-Gulonsäure. Das Gleichgewicht mit L-Gulonsäure, welche kein Substrat für ALO oder für RGLO ist, wird viel schneller erreicht, so wird die Menge des Lactons, die durch ALO/RGLO in Ascorbinsäure umgewandelt wird, verringert. Die reverse Reaktion (Lactonisierung von L-Gulonsäure zu L-Gulono-1,4-lacton) findet in einer wässerigen Umgebung ohne Katalysierung durch ein Enzym kaum, wenn überhaupt, statt. Daher reicherte S. cerevisiae GRF18U, das kein Protein überexprimiert, oder GRF18U, exprimierend RGLO, inkubiert mit L-Gulonsäure keinerlei Ascorbinsäure an, weder intrazellulär (9) noch extrazellulär (Werte nicht angegeben). Bei Expression von AL in S. cerevisiae GRF18U wurde eine kleine Menge von L-Gulonsäure in L-Gulono-1,4-lacton umgewandelt, welches als Substrat für ALO oder ALO und RGLO diente. Daher waren diese Zellen imstande, L-Gulonsäure in Ascorbinsäure umzuwandeln. Dies machte das AL-Enzym zusätzlich zu ALO und/oder RGLO verwendbar für die Herstellung von Ascorbinsäure aus Hefen.

Bei Inkubation von Z. bailii ATCC36947 oder ATCC60483, transformiert mit RGLO, mit L-Gulono-1,4-lacton reicherten die Zellen Ascorbinsäure intrazellulär (10), aber nicht in der Kulturbrühe an (Werte nicht angegeben). Daher waren Werte, erhalten von diesen Z. bailii Hefestämmen, vergleichbar mit dem, was von der Hefe S. cerevisiae beobachtet wurde.

Die folgende Tabelle faßt die hauptsächlichen Beispiele zusammen, über die in dieser Erfindung berichtet wird. Man beachte, daß „nicht best." in der nachstehenden Tabelle „nicht bestimmt" anzeigen soll.

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SEQUENZAUFLISTUNG


Anspruch[de]
Verfahren zum Herstellen von Ascorbinsäure oder einem Salz davon, umfassend:

a) Beschaffen einer rekombinanten Hefe von Saccaromyces cerevisiae oder Zygosaccharomyces bailii, die funktionell mit einer codierenden Region transformiert ist, die eine erste Enzym-D-Arabinono-1,4-lacton-Oxidase (ALO) codiert, wobei die Hefe zur Umwandlung eines Ascorbinsäure-Präkursors zu Ascorbinsäure oder einem Salz davon in der Lage ist;

b) Inkulturnehmen der rekombinanten Hefe in einem Medium, das einen Ascorbinsäure-Präkursor aufweist, wodurch Ascorbinsäure oder ein Salz gebildet werden, wobei die Hefe in dem Medium Ascorbinsäure in Mengen akkumuliert, die größer sind als der Hintergrund, und

c) Abtrennen der Ascorbinsäure oder des Salzes davon.
Verfahren nach Anspruch 1, bei welchem die Hefe ausgewählt ist aus einem S. cerevisiae-Strang: NRRL Y-30321, NRRL Y 30324, NRRL Y-30327, NRRL Y-30328, NRRL Y-30329; oder aus einem Z. bailii-Strang: NRRL Y-30498, NRRL Y-30499, NRRL Y-30501, worin sich "NRRL" auf das "Northern Regional Research Laboratory, Agricultural Research Service, United States Department of Abriculture" bezieht. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das ALO-Enzym zu mindestens 70% Identität mit den SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NO: 7 oder mindestens 70% Identität mit SEQ ID NO: 6 oder Nucleotiden 4 bis 1584 von SEQ ID NO: 8 hat. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Hefe ferner funktionell mit einer codierenden Region transformiert ist, die ein zweites Enzym codiert, das ausgewählt ist aus L-Galactosedehydrogenase (LGDH), L-Galactono-1,4-lactondehydrogenase (AGD) und D-Arabinosedehydrogenase (ARA). Verfahren nach Anspruch 4, wobei das LGDH-Enzym zu mindestens 70% Identität mit SEQ ID NO: 11 oder mindestens 70% Identität mit SEQ ID NO: 12 hat. Verfahren nach Anspruch 4, wobei das AGD-Enzym zu mindestens 70% Identität mit SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 oder mindestens 70% Identität mit SEQ ID NO: 2 oder Nucleotiden 56 bis 1858 von SEQ ID NO: 4 hat. Verfahren nach Anspruch 4, wobei das ARA-Enzym zu mindestens 70% Identität mit SEQ ID NO: 20 oder mindestens 70% Identität mit Nucleotiden 285 bis 1319 von SEQ ID NO: 21 hat. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die codierende Region, die das zweite Enzym codiert, mit einem Promotor verknüpft ist, der in der Hefe aktiv ist. Verfahren nach Anspruch 8, wobei der Promotor der S.cerevisiae Triosephosphatisomerase(TPI)-Promotor ist. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die codierende Region, die das ALO-Enzym codiert, aus S. cerevisiae isoliert wurde. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die codierende Region, die das LGDH-Enzym codiert, aus A. thaliana isoliert wurde. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die codierende Region, die das AGD-Enzym codiert, von A. thaliana isoliert wurde. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die codierende Region, die das ARA-Enzym codiert, von S. cerevisiae isoliert wurde. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die codierende Region, die das erste Enzym codiert, ein ALO-Enzym codiert, welches zu einem komplementären Strang des in SEQ ID NO: 6 angegebenen Polynucleotids hybridisiert, und wobei die codierende Region zu dem komplementären Strang des Polynucleotids unter stringenten Bedingungen der Hybridisierung hybridisiert. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die codierende Region, die das erste Enzym codiert, ein ALO-Enzym codiert, welches die gleichen immunologischen Eigenschaften eines Enzyms mit SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NO: 7 hat. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die codierende Region, die das zweite Enzym codiert, ein LGDH-Enzym codiert, das zu einem komplementären Strang des in SEQ ID NO: 12 angegebenen Polynucleotids hybridisiert, und wobei die codierende Region zu dem komplementären Strang des Polynucleotids unter stringenten Bedingungen der Hybridisierung hybridisiert. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die codierende Region, die das zweite Enzym codiert, ein LGDH-Enzym codiert, das die gleichen immunologischen Eigenschaften eines Enzyms mit SEQ ID NO: 11 hat. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die codierende Region, die das zweite Enzym codiert, ein AGD-Enzym codiert, das zu einem komplementären Strang des in SEQ ID NO: 2 angegebenen Polynucleotids hybridisiert, und wobei die codierende Region zu dem komplementären Strang des Polynucleotids unter stringenten Bedingungen der Hybridisierung hybridisiert. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die codierende Region, die das zweite Enzym codiert, ein AGD-Enzym codiert, das die gleichen immunologischen Eigenschaften eines Enzyms mit SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 hat. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die codierende Region, die das zweite Enzym codiert, ein ARA-Enzym codiert, das zu einem komplementären Strang des Polynucleotids hybridisiert, das in den Nucleotiden 285 bis 1319 der SEQ ID NO: 21 angegeben ist, und wobei die codierende Region zu dem komplementären Strang des Polynucleotids unter stringenten Bedingungen der Hybridisierung hybridisiert. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die codierende Region, die das zweite Enzym codiert, ein ARA-Enzym codiert, das die gleichen immunologischen Eigenschaften eines Enzyms mit SEQ ID NO: 20 hat. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Ascorbinsäure-Präkursor ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus: Monosacchariden, Oligosacchariden, Polysacchariden, C1-C6-Alkohole, C2-C6-Polyolen, organischen Säuren und C5-C6-Lactonen. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Ascorbinsäure-Präkursor ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus: Trehalose, Raffinose, Ethanol, Xylose, Xylulose, Maltose, Glycerol, Fructose, Arabinose, D-Glucose-6-P, D-Glucose-1-P, UDP-D-Glucose, UDP-Glucuronsäure, D-Glucuronsäure-1-P, D-Glucuronsäure, D-Glucuronolacton, L-Gulonsäure, D-Fructose-6-P, D-Mannose-6-P, D-Mannose-1-P, GDP-D-Mannose, GDP-L-Galactose, L-Galactose-1-P, Lactose, Saccharose, Stärke, Cellulose, Citrat, Methanol, Formaldehyd, Formiat, Methylamin, Alanin, Oleinsäure, L-Galctono-1,4-lacton, D-Glucose, L-Gulono-1,4-lacton, L-Galactose und L-Gulonsäure. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Ascorbinsäure-Präkursor ausgewählt ist aus: L-Galacton-1,4-lacton, D-Glucose, L-Gulon-1,4-lacton, L-Galactose und L-Gulonsäure. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Ascorbinsäure-Präkursor auch eine Kohlenstoffquelle für die rekombinante Hefe ist. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Schritt des Isolierens das Lysieren der Hefe umfasst. Verfahren nach Anspruch 26, wobei der Schritt des Isolierens ferner umfasst: Zentrifugation, Filtration, Mikrofiltration, Ultrafiltration, Nanofiltration, Flüssig-Flüssig-Extraktrion, Aktivkohle, Kristallisation, enzymatische Behandlung mit Nuclease oder Protease oder Chromatographie. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Schritt des Inkulturnehmens die Akkumulation von Ascorbinsäure in dem Medium mit einer Endkonzentration von mindestens 20 mg/l umfasst. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Schritt des Inkulturnehmens die Akkumulation von Ascorbinsäure in dem Medium mit einer Endkonzentration von mindestens 40 mg/l umfasst. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Schritt des Inkulturnehmens die Akkumulation von Ascorbinsäure in dem Medium mit einer Endkonzentration von mindestens 70 mg/l umfasst. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die rekombinante Hefe zur Umwandlung von mindestens 25% des Präkursors zur Ascorbinsäure in der Lage ist. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die rekombinante Hefe zur Umwandlung von mindestens 35% des Präkursors zur Ascorbinsäure in der Lage ist. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die rekombinante Hefe zur Umwandlung von mindestens 40% des Präkursors zur Ascorbinsäure in der Lage ist. Verfahren zum Stabilisieren von Ascorbinsäure oder einem Salz davon in einem Medium, welches Verfahren umfasst: Inkulturnehmen einer rekombinanten Saccaromyces cerevisiae oder Zygosaccharomyces bailii-Hefe, funktionell transformiert mit einer codierenden Region, die ein erstes Enzym D-Arabinono-1,4-lacton-Oxidase (ALO) in einem Medium codiert, das Ascorbinsäure oder ein Salz davon aufweist, wobei Ascorbinsäure in dem Medium durch die Hefe erzeugt wird, die Hefe Ascorbinsäure durch Umwandlung mindestens eines Ascorbinsäure-Präkursors zu Ascorbinsäure erzeugt und das Medium den Ascorbinsäure-Präkursor aufweist. Verfahren nach Anspruch 34, wobei Ascorbinsäure oder das Salz davon dem Medium zugegeben werden. Verfahren nach Anspruch 34, wobei die Hefe ferner funktionell mit einer codierenden Region transformiert ist, die ein zweites Enzym codiert, ausgewählt aus L-Galactosedehydrogenase (LGDH), L-Galactono-1,4-lactonedehydrogenase (AGD) und D-Arabinosedehydrogenase (ARA). Saccharomyces cerevisiae, wobei die S. cerevisiae funktionell transformiert sind mit einer codierenden Region, die D-Arabino-1,4-lacton-Oxidase (ALO) codiert, und einer codierenden Region, die L-Galactosedehydrogenase (LGDH), L-Galactono-1,4-lactondehydrogenase (AGD) oder D-Arabinosedehydrogenase (ARA) codiert. Zygosaccharomyces bailii, wobei die Z. bailii funktionell transformiert sind mit einer codierenden Region, die D-Arabinono-1,4-lactonoxidase (ALO) codiert. Z. bailii nach Anspruch 38, wobei die Z. bailii ferner funktionell mit einer codierenden Region transformiert sind, die L-Galactosedehydrogenase (LGDH), L-Galactono-1,4-lactondehydrogenase (AGD) oder D-Arabinosedehydrogenase (ARA) codiert.






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