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Dokumentenidentifikation DE60312743T2 29.11.2007
EP-Veröffentlichungsnummer 0001583961
Titel NEUER SCREENING-TEST FÜR ANTIMALARIAMITTEL
Anmelder The Registrar, Indian Institute of Science, Bangalore, Karnataka State, IN
Erfinder UTPAL, Tatu IISC Campus, 560 012 Bangalore, Karnataka State, IN;
SOUNDARA RAGHAVAN, Pavithra IISC, 560 012 Bangalore, Karnataka State, IN;
GOWRISHANKAR, Banumathy IISC, 560 012 Bangalore, Karnataka State, IN
Vertreter Notarbartolo & Gervasi GmbH, 80336 München
DE-Aktenzeichen 60312743
Vertragsstaaten AT, BE, BG, CH, CY, CZ, DE, DK, EE, ES, FI, FR, GB, GR, HU, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, RO, SE, SI, SK, TR
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 01.12.2003
EP-Aktenzeichen 037771581
WO-Anmeldetag 01.12.2003
PCT-Aktenzeichen PCT/IN03/00374
WO-Veröffentlichungsnummer 2004057327
WO-Veröffentlichungsdatum 08.07.2004
EP-Offenlegungsdatum 12.10.2005
EP date of grant 21.03.2007
Veröffentlichungstag im Patentblatt 29.11.2007
IPC-Hauptklasse G01N 31/00(2006.01)A, F, I, 20051017, B, H, EP
IPC-Nebenklasse G01N 33/00(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   C07K 14/445(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   

Beschreibung[de]

Die Erfindung betrifft einen neunen Assay zum Screenen von Antimalariamitteln unter Verwendung von Hitzeschockprotein 90 als Zielmolekül.

STAND DER TECHNIK

Hsp90 ist mit einem Anteil von 1-2 % am gesamten Zellprotein eines der am häufigsten Proteine der Zelle. Dieses Protein ist für die Lebensfähigkeit von Hefe (1) unentbehrlich: Außerdem hat sich herausgestellt, dass Hsp90 essenziell für Wachstum und Entwicklung bei Fruchtfliegen (2) und Pflanzen (3) ist. Hsp90 unterstützt zusammen mit Hsp70 und anderen Co-Chaperonen die Faltung bestimmter Untergruppen von neu synthetisierten Proteinen und hilft ihnen ihre reife, funktionelle Konformation zu erreichen. Dieses Protein wirkt im Cytosol von Eukaryonten zusammen mit einer Vielzahl von Substraten, wie beispielsweise den Transkriptionsfaktoren (Steroidrezeptoren, Arylhydrocarbon-Rezeptor, Hitzeschock-Faktor, p53-Mutant usw.), Kinasen (pp60 v-src, Raf-1, eff-2&agr; Kinase usw.), Cytoskelettproteinen (Actin und Tubulin), Telomerase und Proteosomen und nimmt so teil an verschiedenen wichtigen Zellfunktionen, wie beispielsweise der Regulation von Genexpression, Signaltransduktion, Zellproliferation und Proteinabbau (4, 5).

Es wurde auch nachgewiesen, dass dieses multifunktionelle Protein am Protein-Targeting beteiligt ist, indem es sich mit anderen Co-Chaperonen assoziiert. Zum Beispiel benutzt es das Co-Chaperon p50 cdc37, um Kinasen zur Plasmamembran zu transportieren und FKBPs und p23, um Steroidrezeptoren vom Cytosol zum Nukleus zu translozieren.

Hsp90 bildet zusammen mit Hsp70 und Hop (Hsp70-Hsp90 Organizing Protein) eine Multi-Chaperon-Maschinerie im eukaryontischen Cytosol (6). Dieser vorgeformte Komplex bildet einen Teil von „foldosome", was bei der Faltung und dem Zusammenbau von Client-Proteinen hilfreich ist Während Stresssituationen wird dadurch eine Fehlfaltung und die unspezifische Zusammenlagerung von Proteinen verhindert. Es besteht auch eine Beteiligung an der Faltung des Tumorsuppressorproteins, p53.

Hsp90 findet sich in erhöhten Konzentrationen in verschiedenen Tumorzelllinien. In Tumorzellen stabilisiert Hsp90 onkogene Proteinkinasen, p53-Mutant usw. und ist somit an der Tumorzellproliferation (7) beteiligt. Die Hemmung der Hsp90-Funktion in Tumorzellen würde daher die Rückführung in einen normalen Phänotyp herbeiführen.

Ansamycin-Antibiotika, Geldanamycin (GA) und Herbimycin A (HA) wurden aus dem Pilz Streptomyces hygroscopicus isoliert. Der Ansa-Ring von GA und HA ist ähnlich der Adeninbase von ATP, und der Benzchinonanteil ist analog zu der Ribose- und Phosphatgruppe von ATP. Sie konkurrieren daher mit ATP um die Bindung an der ATP-Bindungsdomäne von of Hsp90 (8). Von GA ist bekannt, dass es mit der Hsp90-Funktion interferiert, indem es sich an die ATP-Bindungsstelle bindet. Wenn Zellextrakte über eine GA-immoblisierte Säule gegeben wurden, war Hsp90 das einzige Protein aus den Zelllysaten, welches eine spezifische Bindung mit der Säule einging (9, 10).

Während seines asexuellen Lebenszyklus in humanen Erythrozyten durchläuft der Malariaparasit drei Wachstumsphasen (11). Die frühe Form, die auf die Infektion mit dem Erregers folgt und als Ringphase bezeichnet wird, ist die Phase, in der der Parasit in den Erythrozyten eindringt. Die Trophozoit-Phase ist die metabolisch aktivste, biosynthetische Phase, während die Schizont-Phase die Phase der Kernteilung vor der Freisetzung von Merozoiten aus dem Erythrozyten darstellt. Hitzeschockproteine der Klasse Hsp60, Hsp70 und Hsp90 sind bekannt dafür, dass sie durch den Parasiten während der intraerythrozytären Phasen im Wirbeltierwirt (12, 13, 14) exprimiert werden. Während diese Hitzeschockproteine bestimmte gemeinsame Homologien mit ihren Säugetier-Pendants aufweisen sind bisher nur sehr wenige Informationen über ihre funktionellen Rollen bei der Parasitenentwicklung verfügbar.

Hsp90 von Plasmodium falciparum (PfHsp90) wird durch ein „single copy" Gen, welches auf Chromosom 7 lokalisiert ist, kodiert. Das Gen hat ein einziges Intron von 800 bp und das kodierte Proteinprodukt besitzt 745 Aminosäuren mit einem Molekulargewicht von 86 kDa (15). Die PfHsp90-Sequenz ist bei verschiedenen Spezies stark vertreten. Sie zeigt eine Identität von 59 % und eine Ähnlichkeit von 69 % gegenüber Hsp90 von Säugetieren. In Bezug auf die funktionelle Rolle von PfHsp90 (16, 17) stehen bislang nur sehr begrenzt Informationen zur Verfügung.

Aufgabe der Erfindung

Wohl bekannt war bereits, dass Plasmodium Hitzeschockproteine der Klasse Hsp60, Hsp70 und Hsp90 durch den Parasiten während der intraerythrozytären Phasen in dem Wirbeltierwirt exprimiert werden und dass diese Hitzeschockproteine bestimmte Homologien zu ihren Säugetierpendants aufweisen; es gibt allerdings nur wenige Informationen über ihre funktionellen Rollen bei der Parasitenentwicklung. Die Aufgabe der Erfindung war es, zu bestimmten, ob diese Hitzeschockproteine funktionell wichtig für das Wachstum der Parasiten in vivo und in vitro sind unter Verwendung von HSP90 als einem Modell sowie geeignete Screeningassays zu entwickeln, welche nützlich dabei sein werden, die chemische Bibliothek von Verbindungen zu testen und neuartige Antimalariamittel zu selektieren.

Darstellung der Erfindung

Bei der Sequenzabgleichung von Plasmodium falciparum HSP90 mit humanem HSP90 (&agr; und &bgr;) und seinem Homolog Grp94 ergibt sich bei der N-terminalen Domäne von PfHsp90 eine Identität von 69 % zu humanem Hsp90. Ein Vergleich der Sequenz mit humanem Hsp90 offenbart, dass diese Domäne eine ATP/Geldanamycin-Bindungsstelle aufweist. Das Sequenzmotiv GXXGXG in dieser Domäne, welches essenziell für die ATP-Bindung ist, kommt auch in PfHsp90 vor. Die Reste, welche den Kontakt mit GA in Säugetier-Hsp90 herstellen, kommen ebenso in PfHsp90 vor. Sowohl Geldanamycin als auch Herbimycin A töten den Malariaparasiten im Stadium der frühen Trophozoitentwicklung ab, und zeigen dadurch, dass Verbindungen, die sich an die Geldanamycin-Bindungsstelle binden, potenzielle Antimalariamittel sein können. In In-vitro-Assays hat sich herausgestellt, dass Geldanamycin an Plasmodium falciparum HSP90 bindet und eine solche Bindung quantifiziert werden kann mithilfe von geeigneten immunochemischen oder radiochemischen oder nicht-radioaktiven Assays. Es ist daher möglich Assays zu beschreiben, in welchen jede geeignete immobilisierte Verbindung auf ihr Potenzial zur Bindung an Plasmodium HSP90 getestet werden kann; der spezifische Antimalariaeffekt einer Verbindung, welche an Plasmodium HSP90 bindet, kann dann unter Verwendung bekannter Verfahren getestet werden. Solche Assays können weiter entwickelt werden zu Assays mit einem hohen Probendurchsatz mithilfe der derzeit bekannten Techniken, die das Screenen von Verbindungsbibliotheken ermöglichen, wie beispielhaft an dem BIAcore-Assay gezeigt

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Unten stehend wird ein Prototyp-Assay beschrieben.

  • 1.0: Kovalente Immobilisierung von Testverbindungen auf geeigneten Matrizes, wie beispielsweise auf Sepharose- oder BIAcore CMS-Sensorchips, durch Einsatz bekannter Verfahren.
  • 2.0: Herstellung von saponinfreiem (d. h. durch Saponin freigesetztes) Plasmodium-Trophozoitenlysat. Mit P. falciparum infizierte Erythrozyten im Trophozoit-Stadium wurden mit einer Endkonzentration von 0,075 % Saponin in PBS (10 mM Natriumphosphat (pH 7,4), 137 mM NaCl, 2,7 mM KG.) behandelt und bei 4.500 U/min für 4 min. zentrifugiert. Die Parasiten befinden sich dann in der Pelletfraktion und werden anschließend zweimal in PBS gewaschen und in TNESV-Puffer (50 mM Tris-HCl, (pH 7,5), 1 % NP-40,2 mM EDTA, 100 mM NaCl, 1 mM Orthovanadat) lysiert.
  • 3.0: Reagieren lassen des Trophozoitenlysats mit der kovalent immobilisierten Testverbindung.
  • 4.0: Nachweis des an die Verbindung gebundenen Plasmodium falciparum Hitzeschockproteins von 90kDa. Durchgeführt werden kann dies entweder durch Western Blotting unter Verwendung von polyclonalen Antikörpern für PfHsp90 oder mithilfe von radiomarkierten Trophozoitproteinextrakten und anschließendem Nachweis über Phosphorimager-Analyse, wie für die Analyse von GA-Bindung in den Beispielen 3.1 bis 3.4 beschrieben. Alle Verbindungen, die mehr als 10 % an der Gesamtbindung an PfHsp90 aufwiesen, wurden für das weitere Sreening benutzt.

Bekannte kovalente Immobilisierungsverfahren sind:

  • 1. Photochemische Kopplung.
  • 2. Kovalente Immobilisierung von Biomolekülen mithilfe von Beads (Kügelchen), die mit Carboxylgruppen (z. B. LiquiChip Carboxy Beads, Qiagen) überzogen sind durch Anwendung von Carbodiimidchemie. In diesem Verfahren werden die Beads gewaschen und mit einem Aktivator (typischerweise EDC/NHS) inkubiert, noch einmal gewaschen und dann das Capture-Molekül zugegeben und inkubiert und die Beads erneut gewaschen.
  • 3. Verwendung von immobilisierten PCR-Primem
  • 4. Räumlich kontrollierte kovalente Immobilisierung von Biomolekülen auf Silikonoberflächen. Darüber hinaus kann auch ein nicht-radioaktiver Assay für das Screenen von Testverbindungen und verwandten Verbindungen mithilfe von SPR-Analyse mit einem BIAcore 2000TM (Amersham Biosciences) Biosensorsystem benutzt werden basierend auf technischen Details, die für die GA-Bindung in Beispiel 3.4 bereitgestellt sind. Kurz gesagt wird eine Testverbindung kovalent auf den CMS-Sensorchips, Research Grade, mit einer Konzentration von 20 mM in 8 % DMSO unter Verwendung des Aminkopplungskits (1-ethyl-3-(dimethylaminopropyl) carbodiimid), (N-hydroxysuccinimid), das vom Hersteller bereitgestellt wird, immobilisiert.

Für Verbindungen mit unbekannter Struktur wird die Derivatisierung mit Biotin durchgeführt mithilfe von Photobiotinacetat (22) gefolgt von der BIAcore-Analyse unter Verwendung des BIAcore SA Chip, welcher eine Streptavidin-Oberfläche trägt. Alle Messungen werden mit TNESV-Puffer (50 mM Tris-HCl, (pH 7,5), 1 % NP-40, 2 mM EDTA, 100 mM NaCl, 1 mM Orthovanadat) durchgeführt. Die Oberfläche wird durch eine 50 s-Pulsierung mit 0,5 % SDS bei einer Flussrate von 10 &mgr;l/min regeneriert. Für die Bindungsanalyse werden durch Saponin freigesetzte Trophozoiten von P. falciparum in einem gleichen Volumen an TNESV-Puffer lysiert, und das Lysat wird durch Zentrifugation bei 20.000 g für 20 min. geklärt. Die Bindung wird bewertet, indem das Parasitenlysat mit einer Flussrate von 1 &mgr;l/min in TNESV-Puffer durchläuft und die Änderung im Brechungsindex, wie für die GA-Bindung in Beispiel 3.4 durchgeführt, gemessen wird.

Verbindungen, die auf diese Weise durch einen dieser Assays oder eine Kombination daraus selektiert wurden, können dann weiter getestet werden unter Verwendung von bekannten Assays, die in den Beispielen 2.1 und 2.2 beschrieben sind und dem neuartigen Flusszytometrie-Assay, wie in Beispiel 3.5 beschrieben, um die gewünschte Antimalariawirkung auszuwählen.

Kurzbeschreibung der Zeichnungen Abb. 1.

  • A Die N-terminale Sequenz von PfHsp90 (1-177 Aminosäuren) wurde dem Progamm SWISSMODEL unterzogen, um die 3-D-Struktur mithilfe der Kristallstruktur des N-terminalen humanen Hsp90 (PDB Code: 1 YET) als Template (Schablone) zu erhalten. Dieses Modell wurde über die Struktur des humanen Hsp90-GA-Komplexes unter Verwendung des Programms STAMP (Structure Alignment of Multiple Protein) gelegt. PfHsp90 ist mit blauer Linie dargestellt, während die gelbe Linie das Säugetier-Hsp90 kennzeichnet.
  • B. Vergößerte Ansicht der GA-Bindungsregion und der Reste, welche den Kontakt herstellen, und zwar Lys 58, Asp 93, Gly 97, Lys 112, Phe 138 und Gly 183.

Beispiele: Beispiel 1.0 Geldanamvcin-Bindungsstelle in Pf HSP90

Der Sequenzvegleich von humanem Hsp90 (&agr; und &bgr;) und seinem Homolog Grp94 mit PfHsp90 deutet darauf hin, dass verschiedene Domänen evolutionär verankert sind, was vermuten lässt, dass eine funktionelle Ähnlichkeit unter den Hsp90-Proteinen bei unterschiedlichen Organismen besteht. PfHsp90 weist eine geladene Säuredomäne in der mittleren Region auf, welche in humanem Hsp90 fehlt. Die N-terminale Domäne von PfHsp90 zeigt verglichen mit dem humanen Hsp90 eine Identität von 69 %. Ein Sequenzvergleich mit humanem Hsp90 offenbart, dass diese Domäne eine ATP/Geldanamycin-Bindungsstelle aufweist. Das Sequenzmotiv GXXGXG in dieser Domäne, welches essenziell für die ATP-Bindung ist, kommt auch in PfHsp90 vor. Die Reste, welche den Kontakt mit GA in Säugetier-Hsp90 herstellen, kommen ebenso in PfHsp90 vor.

Die Kristallstruktur des N-terminalen Hsp90 – GA-Komplexes ist bereits aufgeklärt (PDB ID: 1YET) (18). Die hochgadige Ähnlichkeit zwischen den ATP-Bindungsdomänen von Säugetier-Hsp90 und PfHsp90 ermöglichten uns die ATP-Bindungsdomäne von PfHsp90 unter Verwendung von Säugetier-Hsp90 als einem Template zu modellieren. Die N-terminale Sequenz von PfHsp90 (1-177 Aminosäuren) wurde dem Progamm SWISS-MODEL unterzogen, um die 3-D-Struktur mithilfe der Kristallstruktur des N-terminalen humanen Hsp90 (PDB Code: 1 YET) als Template zu erhalten. Dieses Modell wurde über die Struktur des humanen Hsp90-GA-Komplexes unter Einsatz des Progamms STAMP (Structure Alignment of Multiple Protein) gelegt, wie in der beiliegenden Zeichnungen dargestellt.. PfHsp90 ist mit blauer Linie dargestellt, während die gelbe Linie das Säugetier-Hsp90 kennzeichnet. GA ist in gelber Farbe in der Mitte der Struktur dargestellt.

zeigt eine vergößerte Ansicht der GA-Bindungsregion und der Reste, welche den Kontakt herstellen, und zwar wurden Lys 58, Asp 93, Gly 97, Lys 112, Phe 138 und Gly 183 angegeben. Vergleiche der Sequenz und Struktur lassen vermuten, dass GA auch möglicherweise mit PfHsp90 interagieren könnte.

Beispiel 2.0 Wirkung von Ansamvcin-Antibiotika auf den Plasmodiumparasiten. 2.1: Wirkung der Wachstumshemmung von GA:

Um zu überprüfen, ob GA das Wachstum von Plasmodium falciparum in vitro hemmen könnte, haben wird hoch synchrone Ring-infizierte Parasiten mithilfe von 5 % Sorbit hergestellt.. Diese Ringstadien-Parasiten wurden in RPMI suspendiert, um einen Hämatokrit-Wert von 5 % zu erhalten. 200 &mgr;l Zellsuspension wurden mit DMSO oder mit GA in DMSO in verschiedenen Konzentrationen (0,5, 1, 5 und 10 &mgr;M) für 24 h behandelt. Am Ende jeder Behandlung wurden Abstriche genommen, mit Giemsa gefärbt und unter dem Mikroskop betrachtet. Während die mit DMSO behandelten Ringe nach 24 Stunden sich weiter zur Trophozoit-Phase entwickelten, blieben die GA-behandelten Parasiten selbst nach 24 Stunden in dem Ringstadium. Das Ausmaß der Hemmung in der Stadiumsprogession nahm mit steigender Konzentration an GA zu. Die maximale Wachstumshemmung ergab sich bei einer Konzentration von 5 &mgr;M. Das gleiche Experiment wurde auch mit frühen Trophozoiten und Schizonten durchgeführt. Wenn GA im Trophozoit-Stadium zugegeben wurde, war eine 100 %ige Wachstumshemmung bei einer GA-Konzentration von 10 &mgr;M zu beobachten. Dies korreliert mit verstärkter Expression von Pfhsp90 in dem Trophozoit-Stadium im Vergleich zum Ringstadium. Wenn Parasiten in der Schizont-Phase mit GA behandelt wurden, wurde die Freisetzung von Merozoiten und ihre nachfolgende Reinvasion in die Erythrozyten nicht beeinflusst.

2.2 : Antimalariawirkung von GA und HA:

Um die Wirkung von GA auf die Parasitämie insgesamt zu zeigen, wurden Ring-infizierte Erythrozyten entweder mit DMSO oder nut 5 &mgr;M GA für 48 Stunden (Kultur wurde alle 24 Stunden mit frischem Medium und GA versorgt) behandelt und die Parasitämie anhand der Giemsa-Färbung bewertet. Während die pseudobehandelten Parasiten sich am Ende von 48 Stunden vermehrten, wurde die Parasitämie in mit GA behandelten Kulturen nach 48 Stunden auf 50 Prozent gesenkt. Wurden die Kulturen ähnlich nut unterschiedlichen Konzentrationen von HA (0,5, 1, 5 und 10 &mgr;M) behandelt, war eine maximale Reduktion bei der Parasitämie mit einer Konzentration von 10 &mgr;M zu beobachten.

Die Beispiele 2.1 und 2.2 zeigen deutlich, dass Ansamycin-Antibiotika auf die Parasitämie insgesamt im Stadium der Trophozoitenbildung wirken.

Beispiel 3.0 In-Vitro-Assay zum Testen der Wirkung von Geldanamvcin auf die Bindung an PfHsp90 und Hemmung des Parasitenwachstums 3.1 Festphase-GA-Bindungsassay:

Geldanamycin wurde auf Sepharose-Beads (9) immobilisiert. Zuerst wurde GA modifiziert durch Zugabe von 1,6-Hexandiamin als einem Linker für die Kopplung an die aktivierten Ester-Beads. 1,6-Hexandiamin wurde zu GA (10 mM in CHCl3) zugegeben, um einen 10fachen molaren Überschuss zu ereichen und bei Raumtemperatur für 2 h im Dunkeln stehen gelassen, um 17-Hexamethylendiamin-17-demethoxy-Geldanamycin zu erhalten. Die Reaktionslösung wurde mit Wasser extrahiert, um das nicht reagierte 1,6- Hexandiamin zu entfernen. Die Produkte wurden dann unter Stickstoff getrocknet, erneut in DMSO aufgelöst und mit NHS-aktivierten Sepharose 4 Fast Flow Beads (Amersham Biosciences) für 2 h im Dunkeln bei Raumtemperatur zur Reaktion gebracht. Die entstandenen Beads wurden zweimal in eiskaltem TNESV-Puffer (50 mM Tris-HCl, (pH 7,5), 1 % NP-40, 2 mM EDTA, 100 mM NaCl, 1 mM Orthovanadat) gewaschen und über Nacht bei 4 °C geschüttelt. Die GA-Beads wurden dann mit 1 % BSA für 1 h geblockt. Für die Kontrollbeads wurde das Harz auf die gleiche Weise behandelt, aber ohne Zugabe von 17-Hexamethylendiamin-17-demethoxy-Geldanamycin.

3.2 : Immunoblot-Analyse von PfHSP90 und GA-Bindung:

Kulturen von P. falciparum wurden mit Saponin in einer Konzentration von 0,075 % behandelt, um die Trophozoiten freizusetzen. Durch Saponin freigesetzte Trophozoiten von P. falciparum wurden in TNESV-Puffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1% NP-40, 2 mM EDTA, 100 mM NaCl, 1 mM Orthovanadat), welcher Proteasehemmer enthielt, lysiert. Geklärtes Lysate wurde entweder mit GA gekuppelten Beads oder Kontrollbeads über Nacht bei 4 °C inkubiert. Die Beads wurden viermal mit TNESV-Puffer gewaschen, in Laemmli-Puffer gelöst und auf SDS-PAGE (7,5 % Trenngel mit 3 % Sammelgel) (19) analysiert. Die Proteine wurden auf Nitrocellulosemembran transferiert und die Membrane wurde in 1 % Milchpulver in TBST (20 mM Tris, 136 mM NaCl, 0,05 % Tween-20, pH 7,2) für 1 h geblockt. Die Membrane wurde dann dreimal mit TBST für jeweils 10 min gewaschen. Die Membran wurde dann mit polyclonalen Antikörpern vom Kaninchen gegen PfHsp90 sondiert. Nach dreimaligem Waschen mit TBST für jeweils 10 min wurde die Membran mit anti-Kaninchen-IgG-Konjugat mit ALP (alkalische Phosphatase) sondiert. Entwickelt wurde die Membran unter Verwendung von BCIP (5-Brom-3-Chlor-Indolylphosphat)/NBT (Nitroblautetrazolium) als Substrat. Unter diesen Bedingungen konnten wir deutlich die Bindung von PfHsp90 an die GA-gekoppelten Beads beobachten. Die Kontrollbeads zeigten keine Bindung an PfHsp90.

3.3 : Analyse von PfHSP90 und GA-Bindung durch metabolische Markierung von Proteinen:

Mit P. falciparum infizierte Erythrozyten im Trophozoit-Stadium wurden mit [35S]-cys und [35S]-met markiert. Im Anschluss an die Lyse mit 0,075 % Saponin, wurden die Parasiten in TNESV-Puffer, welcher Proteasehemmer enthielt, lysiert. Das Lysat wurde entweder mit GA-gekoppelten Beads oder mit Kontrollbeads inkubiert und über Nacht bei 4 °C rotiert. Die Beads wurden viermal mit TNESV-Puffer gewaschen und in 2D-Lysepuffer aufgelöst. Die Probe im 2D-Lysepuffer wurde auf 7 cm × 1,5 mm IEF Röhrchengele aufgetragen, welche bei 250 V für 30 min. vorfokussiert wurden. Im Anschluss daran wurden die Röhrchengele bei 500 V für 4 Stunden elektrophoresiert. Nach dem Elektrophoreselauf wurden die Röhrchengele in 1 ml Äquilibrierungspuffer (125 mM Tris (pH 6,8), 4,9 mM DTT, 10 % Glycerin und 2 % SDS, pH 6,8) für 9 Minuten inkubiert. Die Röhrchengele wurden horizontal oben auf 7,5 %ige SDS-Polyacrylamidgele gelegt und mit 1 % Agarose in SDS-PAGE-Laufpuffer (50 mM Tris, 380 mM Glycin und 0,1 % SDS) überschichtet. Die SDS-PAGE-Elektrophorese wurde bei 110 V für eine Stunde und 10 Minuten durchgeführt. Die Punkte wurden mithilfe von Fluorographie (20) sichtbar gemacht. Durch frühere Laborarbeiten war die Position von PfHsp90 (pI = 4.94, Mw = 86 kDa) auf 2D-PAGE (21) bereits eindeutig festgelegt. Basierend auf diesem Wert wurde das Protein, das an GA-gekoppelte Beads gebunden war, als PfHsp90 identifiziert. Die Kontrollbeads zeigten keine Bindung an PfHsp90.

3.4 Analyse von PfHSP90 und GA-Bindung durch Oberflächen-Plasmonresonanzspektroskopie:

Um die Durchführbarkeit eines nicht-radioaktiven Assays für das Screening von GA und verwandten Verbindungen haben wir die SPR-Analyse mit einem BIAcore 2000TM (Amersham Biosciences) Biosensorsystem benutzt Geldanamycin wurde auf den CMS-Sensorchips, Research Grade, mit einer Konzentration von 20 mM in 8 % DMSO unter Verwendung des Aminkopplungskits (1-ethyl-3-(dimethylaminopropyl) carbodiimide, N-hydroxysuccinimid), das durch den Hersteller bereitgestellt wurde, kovalent immobilisiert. Annähernd 700 Resonanzeinheiten (RU) von GA wurden unter diesen Bedingungen immobilisiert. Die nicht reagierten Anteile auf der Oberfläche wurden mit 1M Ethanolamin blockiert. Alle Messungen wurden mit TNESV-Puffer durchgeführt. Die Oberfläche wurde mit einer 50 s-Pulsierung mit 0,5 % SDS bei einer Flussrate von 10 &mgr;l/min. regeneriert.

Für die Bindungsanalyse wurden durch Saponin freigesetzte Trophozoiten von P. falciparum in einem gleichen Volumen an TNESV-Puffer lysiert und das Lysate wurde durch Zentrifugation bei 20.000 g für 20 min. geklärt. Die Bindung wurde bewertet, indem das Parasitenlysat mit einer Flussrate von 1 &mgr;l/min in TNESV-Puffer durchläuft und Änderungen im Brechungsindex als Reaktionseinheiten gemessen werden. Während das Parasitenlysat über den GA-gekoppelten Chip geführt wurde, wurde eine beträchtliche Bindung (Reaktion von 900 RU) beobachtet. Um Sicherzustellen, dass die Bindung aufgrund von PfHsp90 erfolgte, wurde das Parasitenlysat mit Antiserum gegen PfHsp90 gemischt und dann über den GA-gekoppelten Chip geleitet. In diesem Moment wurde die Bindung vollständig aufgehoben, was darauf hindeutete, dass PfHsp90 aus dem Parasitenlysat spezifisch an GA, das an den Chip gekoppelt war, gebunden wurde.

3.5; Analyse der Wachstumshemmung von P. falciparum durch GA mittels Flusszytometrie

Zur Bestätigung der Hemmung von P. falciparum durch GA und verwandte Verbindungen haben wir einen Assay entwickelt, der die Flusszytometrie miteinbezieht. Kurz gesagt wurden die Parasiten dreimal über 75 % Percoll gereinigt, um eine reine Parasitenpopulation frei von nicht infizierten RBC zu erhalten. 30 &mgr;l einer solchen Suspension wurden zu 600 &mgr;l der Färbelösung (6 mg/l an Acridinorange in 10 mM Tricin und 120 mM NaH2PO4 bei pH 9) zugegeben. Die Suspension von gefärbten Zellen wurde in ein Flusszytometer (BD (Becton Dickinson) FACScan) injiziert, welches mit einem Argon-Ionenlaser, eingestellt auf 488 nm bei einer Leistungsabgabe von 15 mW, ausgestattet war. Bei 560 nm wurde eine grüne Fluoreszenz (GF) nachgewiesen. Mit der GF wurde gleichzeitig Streulicht (SSC) entdeckt. Es wurden höchstens 10.000 Zellen bewertet und in einem zwei-dimensionalen Scattergramm von SSC (linearer Maßstab) gegen GF (logarithmischer Maßstab) in weniger als 60 Sekunden geplottet. Der Parasitenbereich wurde in einem zwei-dimensionalen Scattergramm von SSC gegen GF definiert. Die Ring- und Trophozoitformen wurden eindeutig durch Analyse von Scattergrammen für Parasiten zu unterschiedlichen Zeiten nach der Synchronisation definiert. Die Validität des Assays wurde bestätigt durch Behandlung von hoch synchronen Parasiten im Ringstadium mit 10 &mgr;M GA für 24 h. Mit DMSO behandelte Parasiten wurden als Kontrolle benutzt. Mit GA behandelte Parasiten zeigten ein Scattergramm entsprechend den Ringformen, während das Scattergramm der mit DMSO behandelten Kontrollen, dem von Trophozoiten entsprach. Die Daten zeigen deutlich, dass GA und verwandte Verbindungen als Antimalariamittel wirksam sein können.

Basierend auf den Assays, die in Beispiel 3 für diese Spezifikation beschrieben wurden, ist es für einen Fachmann auf diesem Gebiet möglich, ähnliche Assays zu entwickeln und auf Bindung von Testverbindungen an Pfhsp90 (mithilfe von Festphasenkopplung an Sepharose Beads und BIACORE Chips) sowie auf Wachstumshemmung von P. falciparum (mithilfe des Flusszytometrie-Assays) zu testen.

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Anspruch[de]
Assay zum Screenen von Antimalariamitteln, in welchem eine Testverbindung auf die Bindung am Plasmodium Hitzeschockprotein von 90kDa untersucht wird, welcher umfasst:

a) Kovalente Immobilisierung der Testverbindung auf Sensorchips, enthaltend eine carboxymethylierte Dextranmatrix, die an einer Goldoberfläche befestigt ist;

b) Herstellung von saponinfreiem Plasmodien-Trophozoitenlysat;

c) Reagieren lassen des Trophozoitenlysats mit der kovalent immobilisierten Testverbindung, und

d) Nachweis des an die Verbindung gebundenen Plasmodium Hitzeschockproteins von 90kDa.
Assay, wie in Anspruch 1 beansprucht, wobei das an die Verbindung gebundene Plasmodium Hitzeschockprotein von 90 kDa mithilfe von immunochemischen Methoden nachgewiesen wird. Assay, wie in Anspruch 1 beansprucht, wobei das an die Verbindung gebundene Plasmodium Hitzeschockprotein von 90 kDa mithilfe von radiometrischen Methoden, wie beispielsweise 2D-Gelelektrophorese und Fluorographie nachgewiesen wird. Assay, wie in Anspruch 1 beansprucht, wobei eine Festphasenmatrix, wie beispielsweise carboxymethylierte Dextranmatrix, die an einer Goldoberfläche befestigt ist, verwendet wird, um den Assay durchzuführen. Assay, wie in Anspruch 4 beansprucht, wobei der Assay auf carboxymethylierter Dextranmatrix durchgeführt wird, die an einer Goldoberfläche befestigt ist, und die folgenden Schritte umfasst:

a) Kovalentes Immobilisieren von Verbindungen, welche mit primären Aminen derivatisiert sind, auf Sensorchips, wobei die genannten Sensorchips carboxymethylierte Dextranmatrix in einer Konzentration von 20 mM in 8% DMSO unter Verwendung von 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodümidhydrochlorid, N-hydroxysuccinimid und Ethanolamin-HCl enthalten;

b) Blocken der nicht reagierten Anteile auf der Oberfläche mit 1M Ethanolamin;

c) Regenerieren der Oberfläche mittels einer 50 s-Pulsierung mit 0,5% SDS bei einer Flussrate von 10 &mgr;l/min;

d) Lyse von saponinfreien Trophozoiten von P. falciparum in einem gleichen Volumen an Puffer, enthaltend 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 1% NP-40, 2 mM EDTA, 100 mM NaCl und 1 mM Orthovanadat;

e) Klären des Lysats durch Zentrifugation bei 20.000 g für 20 min; und

f) Bewerten der Bindung durch Messen der Änderung im Brechungsindex als Reaktionseinheiten, nachdem das Parasitenlysat mit einer Flussrate von 1 &mgr;l/min in einem Puffer, enthaltend 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 1% NP-40, 2 mM EDTA, 100 mM NaCl und 1 mM Orthovanadat durchgelaufen ist.
Assay, wie in einem der vorherigen Ansprüche beansprucht, wobei Verbindungen von unbekannter Struktur einer Derivatisierung mit Biotin unter Verwendung von Photobiotinacetat unterzogen werden und anschließend eine mit Streptavidin überzogene Sensoroberfläche eingesetzt wird.






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