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Dokumentenidentifikation DE69737364T2 29.11.2007
EP-Veröffentlichungsnummer 0000948601
Titel METHODEN ZUR VIRUS-REINIGUNG
Anmelder Schering Corp., Kenilworth, N.J., US
Erfinder TANG, John, Chu-Tay, Livingston, NJ, US;
VELLEKAMP, Gary J., Glen Ridge, NJ, US;
BONDOC, Laureano L., Piscataway, NJ, US
Vertreter Uexküll & Stolberg, 22607 Hamburg
DE-Aktenzeichen 69737364
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, NL, PT, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 11.12.1997
EP-Aktenzeichen 979508058
WO-Anmeldetag 11.12.1997
PCT-Aktenzeichen PCT/US97/22134
WO-Veröffentlichungsnummer 1998026048
WO-Veröffentlichungsdatum 18.06.1998
EP-Offenlegungsdatum 13.10.1999
EP date of grant 14.02.2007
Veröffentlichungstag im Patentblatt 29.11.2007
IPC-Hauptklasse C12N 7/02(2006.01)A, F, I, 20051017, B, H, EP
IPC-Nebenklasse C12N 7/00(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   

Beschreibung[de]
HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Die Kultivierung und Aufreinigung von Viren ist für die Gentherapie und für die Impfstoffentwicklung zunehmend wichtig geworden. Huyghe et al. (Human Gene Therapy 6: 1403–1416 (1995)) offenbarten einen Vergleich von verschiedenen Verfahren zum Auf reinigen von rekombinanten Adenoviren einschließlich der Anionenaustauschchromatographie, der Größenausschlußchromatographie, der Affinitätschromatographie mit immobilisiertem Zink („immobilized zinc affinity chromatography") und der Ultrazentrifugation, und schlußfolgerten, daß das bevorzugten Verfahren zum Auf reinigen eines rekombinanten Adenovirus eine Nukleasebehandlung eines Zelllysats gefolgt von einer Filtration durch Membranfilter gefolgt von DEAE-Chromatographie, gefolgt von Zinkaffinitätschromatographie ist.

Die WO 97/08298 betrifft ein Verfahren zum Auf reinigen von Adenovirus und Adeno-assoziiertem Virus.

Die WO 98/00524, betrifft ein Verfahren zum Herstellen von rekombinantem Adenovirus.

Die EP 0 593 339 A betrifft Verfahren zum Herstellen von Hepatitis A-Antigenen und -Impfstoffen.

Die EP 0 522,291 A betrifft ein Verfahren zum Auf reinigen von Hepatitis A-Virus.

Im Hinblick auf den ständig ansteigenden Bedarf nach aufgereinigten Viren, zum Beispiel für die Verwendung als virale Vektoren für die Gentherapie, wären verbesserte Verfahren der Aufreinigung höchst wünschenswert.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Ein Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren zum Auf reinigen von Adenovirus aus einer Virusaufbereitung, das die folgenden aufeinanderfolgenden Schritte umfasst:

  • a) Unterwerfen der Virusaufbereitung einer Anionenaustauschchromatographie, wobei das Adenovirus aus einem Anionenaustauschchromatographie-Medium eluiert wird, und
  • b) Unterwerfen des Eluats aus Schritt a), welches das Adenovirus enthält, einer Größenausschlußchromatographie, wobei das Adenovirus aus einem Größenausschlußchromatographie-Medium eluiert wird,

    wobei das Größenausschlußchromatographie-Medium ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus G6000PWXL, SB-806, SEPHACRYLRTM S-400 HR, SEPHADEX G-200, SEPHAROSERTM CL-2B, SUPER-DEXRTM 200 mit Präparationsgüte, SUPEROSERTM 6 mit Präparationsgüte, TSK 6000PWXL und ULTRAHYDROGEL 2000. Die Viruszubereitung kann ein Zelllysat sein, das vor Schritt a) filtriert werden kann. Das Adenovirus kann ein rekombinantes Adenovirus sein, wie beispielsweise ACN53 (offenbart in der WO 95/11984).

Das Anionenaustausch-Medium kann Diethylaminoethylgruppen auf einem Grundgerüst aus kreuzvernetzter Agarose, Cellulose, Polyacrylamid oder Polystyren umfassen, wie beispielsweise FRACTOGELTM-DEAE. Das Größenausschluß-Medium kann ein kreuzvernetztes Polysaccharid umfassen, und kann ein Verbund aus kreuzvernetzter Agarose und Dextran sein. Ein beispielhaftes Größenausschluß-Medium ist SuperdexRTM-200. Das Anionenaustausch-Medium kann vor Anwendung auf die Viruszubereitung gründlich gewaschen werden.

Das Größenausschluß-Medium kann in einer Säule bereitgestellt werden, die als ein Salzgradient zubereitet wurde, der hinsichtlich der Ionenstärke von der Spitze des Mediums zum Boden hin abnimmt, wobei die Spitze der Säule einen Puffer aufweist, der eine Ionenstärke besitzt, die mit der des Produktes aus Schritt a im Wesentlichen identisch ist.

Die Erfindung betrifft ferner ein Virus, das durch das Verfahren gemäß Anspruch 1 aufgereinigt wurde.

BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORM

Die vorliegende Erfindung betrifft die Aufreinigung eines Virus, und zwar eines Adenovirus, das zum Beispiel durch Kultivierung in einem zellulären Wirt und dann durch Freisetzen mittels Lyse der Zellen und Abtrennung von zellulären Trümmern hergestellt worden sein kann. Der Begriff "Virus" schließt Wildtyp-, Mutanten- und rekombinante Viren, insbesondere adenovirale Vektoren für die Expression von heterologen Nukleinsäuresequenzen, ein.

Die Ausführungsformen der Erfindung fallen unter die. allgemeine Strategie der Adsorptionschromatographie einer Viruszubereitung gefolgt von Größenausschlußchromatographie. Üblicherweise wird die Anionenaustauschchromatographie auf einem Anionenaustauschharz durchgeführt, das aus basischen Gruppen in Seitenketten besteht, die an ein makromolekulares Grundgerüst geheftet sind. Die basischen Gruppen sind bevorzugt substituierte Aminogruppen, insbesondere di-(Niederalkyl)aminoalkylgruppen, bei denen jede Niederalkylgruppe 1 bis 4, bevorzugt 2 Kohlenstoffatome aufweist, und jede Alkylgruppe 2 bis 4, bevorzugt 2 Kohlenstoffatome aufweist. Das Grundgerüst kann aus Kieselsäure oder einer organischen Matrix zusammengesetzt sein, zum Beispiel kreuzvernetzter Agarose, Cellulose, Polyacrylamid oder Polystyren. Es ist insbesondere bevorzugt, ein Anionenaustauschharz zu verwenden, das aus Dimethylaminoethylgruppen (DMAE-Gruppen) oder insbesondere aus Diethylaminoethylgruppen (DEAE-Gruppen) auf einem kreuzvernetzten Agarose-Grundgerüst besteht; besonders bevorzugte Harze des DEAE-Typs sind solche, die unter dem Handelsnamen "DEAE-Fractogel" verkauft werden, zum Beispiel "FRACTOGELTM EMD DEAE-650M" und "FRACTOGELTM AE". In einigen, Ausführungsformen der Erfindung kann das "Grundgerüst" ein fester Träger, wie beispielsweise ein Kügelchen sein.

Das Anionenaustauschharz wird vor dem Beladen mit der Viruszubereitung gründlich gewaschen, um Konservierungsmittel, wie beispielsweise Natriumazid und Ethanol, und andere Fremdmaterialien zu entfernen, in dem die Säule mit ungefähr 5 bis 10 Säulenvolumen einer basischen Lösung, wie beispielsweise 50 mM NaOH/1 M NaCl gewaschen wird, gefolgt von ungefähr 5 bis 10 Säulenvolumen einer neutralisierenden Lösung, wie beispielsweise 50 mM HCl/1 M NaCl, gefolgt von ungefähr 5 bis 30 Volumen von Ladungs- und/oder Elutionspuffern. Wahlweise wird die Säule mit einem Puffer mit niedrigerer Salzkonzentration als die des Lade- und/oder Elutionspuffers gewaschen, bevor sie mit Lade- und/oder Elutionspuffer gewaschen wird.

Üblicherweise wird eine Viruszubereitung, wie beispielsweise ein Zelllysat, in einer gepufferten Lösung von ungefähr pH 7,0–8,5 mit einer Salzkonzentration von ungefähr 100–360 mM auf das chromatographische Medium geladen. Das Salz ist üblicherweise NaCl. In einigen Ausführungsformen werden andere Puffer, wie beispielsweise Phosphat oder Tris verwendet. Kontaminationen können bevorzugt durch Waschen der Säule mit einem Puffer bei einer Salzkonzentration von ungefähr 250–380 mM eluiert werden. Das Adenovirus kann durch eine Lösung mit einer Salzkonzentration von ungefähr 360–600 mM eluiert werden. Das Salz ist üblicherweise NaCl. Üblicherweise werden ungefähr 5 bis 50, bevorzugter ungefähr 30 Puffervolumen verwendet, um das Virus zu eluieren. Die Fraktionen können gesammelt und auf die Anwesenheit von Virus hin durch Messen der A260 oder der A280 und Vereinen der Peakfraktionen getestet werden; alternativ kann das Eluat, das den A260- oder den A280-Peak enthält, in einer einzelnen Fraktion gesammelt werden. Diese einzelne A260-oder A280-Fraktion oder die vereinten Fraktionen in dem Eluat, die das Virus enthält/enthalten, werden hier als "Anionenaustausch-Pool" bezeichnet.

In dem Größenausschlußchromatographieschritt werden Moleküle entsprechend ihrer Größe in einem Bett getrennt, das mit einem inerten porösen Medium gepackt ist, insbesondere einem inerten Gelmedium, das bevorzugt ein Verbund von kreuzvernetzten Polysacchariden, zum Beispiel kreuzvernetzter Agarose und Dextran in der Form von kugelförmigen Kügelchen ist. Moleküle, die größer sind als die größten Poren in dem gequollenen Gelkügelchen, gelangen nicht in die Gelkügelchen und wandern daher am schnellsten durch das chromatographische Bett: Kleinere Moleküle, die in unterschiedlichem Ausmaß in Abhängigkeit von ihrer Größe und Form in die Gelkügelchen gelangen, werden bei ihrer Passage durch das Bett zurückgehalten. Moleküle werden daher im allgemeinen in der Reihenfolge einer abnehmenden molekularen Größe eluiert. Viren eluieren wegen ihrer großen Größe im Allgemeinen in dem Durchflussvolumen ("void volume"). Beispielsweise haben Adenoviren einen Durchmesser von ungefähr 80 nm. Für die Größenausschlußchromatographie von Adenoviren geeignete Medien sind die Harze G6000PWXL (TosoHaas), SB-806 (Alltech), SEPHACRYLRTM S-400 HR, SEPHADEX G-200, SEPHARO-SERTM CL-2B, SUPERDEXRTM 200 in Präparationsgüte, SUPEROSERTM 6 in Präparationsgüte (Pharmacia), TSK 6000PWXL (Bodman) und UL-TRAHYDROGEL 2000 (Waters).

Die "Größenausschluß"-Chromatographie, wie sie hier verwendet wird, soll eine Gelfiltrationschromatographie einschließen. Das unter dem Handelsnamen "SUPERDEXRTM 200" verkaufte Medium ist ein besonders bevorzugtes Größenausschluß-Medium; siehe den Pharmacia-Katalog von 1996, Seiten 338–339, Codenr. 17-1043-01 (lose) oder 17-1069-01 oder 17-1071-01 (vorgepackte Säulen). Da eine Gruppentrennung der Viren von Unreinheiten mit niedrigerem Molekulargewicht erreicht wird, kann das Ladevolumen der Ausgangsmaterialien aus dem Anionenaustausch-Pool verhältnismäßig groß sein, zum Beispiel bis zu 20 %, bevorzugter 15 % des Bettvolumens.

Beispielhafte Materialien für die Ausführung der Anionenaustausch- und Größenausschlußchromatographieschritte der vorliegenden Erfindung werden in Tabelle I bereitgestellt. Beispielhafte Variablen und Kontrollen werden in den Tabellen II und III bereitgestellt.

Tabelle 2: Beispielhafte Materialien, die in der Anionenaustausch- und Größenausschlußchromatographie verwendet werden
Tabelle II: Prozessinterne Kontroll- und Betriebsvariablen für die Anionenaustauschchromatographie
Tabelle III: Prozessinterne Kontroll- und Betriebsvariablen für die Größenausschlußchromatographie

In einer Ausführungsform der Erfindung wird das Virus aus dem Anionenaustausch-Pool auf eine Größenausschlußsäule geladen. In einigen Ausführungsformen wird die Säule mit einem Salzgradienten bereitgestellt, dessen Ionenstärke von der Spitze zum Boden der Säule hin abnimmt. Nach dem Beladen wandert das Virus durch den Salzgradienten abwärts (da das Virus bevorzugt durch das Harz nicht adsorbiert wird) und die sanfte Veränderung der Ionenstärke verhindert Schaden an dem Virus. Nach Durchlaufen („overtaking") des Salzgradienten wird das Virus in einen Niedrigsalz (zum Beispiel 0–200 mM NaCl)-Puffer eluiert. Solche Niedrigsalz-Puffer schließen Formulierungen für Langzeitlagerung oder die Verabreichung an Patienten ein, sind aber nicht auf diese beschränkt.

In einigen Ausführungsformen wird Glycerin zu den chromatographischen Puffern, wie beispielsweise dem Eluierungspuffer, oder zu den vereinten Fraktionen, die das Virus enthalten, zugegeben. Üblicherweise liegt das Glycerin in einer Endkonzentration von 5–20 %, noch üblicher von 10 % vor. Folglich liegt in einigen Ausführungsformen Glycerin in allen Lösungen während des gesamten Verfahrens vor. In weiteren Ausführungsformen können andere Hilfsstoffe, wie beispielsweise ungefähr 2–16 % Saccharose anstelle des Glycerins verwendet werden.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Größenausschlußchromatographiesäule mit einem Puffer bei niedriger Salzkonzentration, zum Beispiel ungefähr 100 bis 150 mM, insbesondere ungefähr 130 mM NaCl äquilibriert. Kurz vor Beladen mit der Beschickung wird ein Salzgradient von einer niedrigen Salzkonzentration (ungefähr 130 mM NaCl) bis zur der höheren Salzkonzentration der Beschickung (zum Beispiel 400 bis 450 mM NaCl, insbesondere ungefähr 420 mM NaCl), der einer mittleren Fraktion des Bettvolumens, zum Beispiel 10 bis 20 %, bevorzugt ungefähr 15 % entspricht, geladen.

Ein einfacher Test wird durchgeführt, um die Qualität des DEAE-FractogelRTM-Pools zu bestimmen, und um nachfolgend zu bestimmen, ob ein Salzgradient verwendet werden sollte. Dieser Test hängt von der Konstanz des A320/A260-Verhältnisses des DEAE-FractogelRTM-Pools, der mit einem geeigneten Puffer von pH 7,5 verdünnt wurde, über einen Zeitraum von einigen wenigen Minuten (zum Beispiel 5 Minuten) ab. Ein geeigneter Puffer besteht aus 50 mM Natriumphosphat, pH 7,5, 2 mM MgCl2, 2 % Saccharose und keinem NaCl. Wenn das A320/A260-Verhältnis über einen Zeitraum von 5 Minuten im Wesentlichen konstant bleibt (wenn es sich zum Beispiel nicht um mehr als 0,04 erhöht), dann ist die Probe entweder für isokratische Größenausschlußchromatographie oder Größenausschlußchromatographie mit einem Salzgradienten geeignet. Wenn sich das Verhältnis von A320/A260 während des Zeitraums um mehr als ungefähr 0,04 erhöht, dann wird dieser DEAE-Fractogel-Pool bevorzugt auf einer Größenausschlußchromatographie mit einem Salzgradienten durchgeführt, um die Ausbeute zu verbessern. Die Tabelle IV stellt exemplarische Materialien und Protokolle für die Verwendung von Größenausschlußchromatographie mit einem Salzgradienten zur Verfügung.

Tabelle IV: Exemplarische Materialien und Protokolle für die Verwendung von Größenausschlußchromatographie mit einem Salzgradienten

Das erfindungsgemäße Aufreinigungsverfahren ist für ein Hochskalieren (oder ein Herabskalieren) und für großtechnische Sicherheitsbehälter geeignet. Geeignete Verfahren und im Fachgebiet gut bekannte Richtlinien können verwendet und befolgt werden, um das Virus zu kontrollieren und um biologisch riskante Situationen ("biohazardous situations") zu vermeiden: siehe zum Beispiel "Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories", 3. Auflage, herausgegeben von Richman und McKinney, US-Department of Health and Human Services, veröffentlicht durch das Center for Disease Control und das National Institute of Health, Washington, DC, US Government Printing Office, Mai 1993.

Die durch die erfindungsgemäßen Verfahren aufgereinigten Adenoviren sind bevorzugt rekombinante Adenoviren, können jedoch klinische Isolate, attenuierte Impfstoffstämme und so weiter einschließen.

Folglich ist beispielsweise ACN53, das in der PCT-Patentanmeldung Nr. WO 95/11984 offenbart ist, ein beispielhaftes rekombinantes Adenovirus, das durch das erfindungsgemäße Verfahren auf gereinigt werden kann.

In dem ersten Schritt wird der ACN53-adenovirale Vektor durch Anionenaustauschchromatographie auf einer DEAE-Säule aufgereinigt. Dafür wird das Virus üblicherweise in 293-Nierenzellen vermehrt, geerntet und einer Konzentration und Ultrafiltration unterzogen. Das Konzentrat wird gefroren und bis zur Verwendung bei ungefähr –20 °C gelagert. Gefrorenes Konzentrat wird aufgetaut, durch Filtration durch einen Filter von 0,45 &mgr;m geklärt, die Leitfähigkeit der Zubereitung auf ungefähr 250–360 mM NaCl eingestellt und einer DEAE-Chromatographie unterzogen. Die in der Chromatographie verwendeten Lösungen sind in Tabelle 1 aufgelistet.

In dem zweiten Schritt wird der ACN53-adenovirale Vektor durch Größenausschlußchromatographie auf einer SuperdexRTM-200-Säule aufgereinigt. Ausgewählte Fraktionen, die Virus enthalten, werden über A260 oder A280 identifiziert und vereint. Die vereinten Fraktionen stellen die aufgereinigte Hauptmasse des ACN53-adenoviralen Vektors dar, die dann durch einen Filter von 0,2 &mgr;m steril filtriert und bei ungefähr –20 °C gelagert wird.

Das Virus in dem DEAE-FractogelRTM-Pool kann wegen des Vorliegens einer hohen Salzkonzentration (ungefähr 420 mM NaCl) instabil sein. Es wird bevorzugt unmittelbar weiterverarbeitet oder für nicht mehr als ungefähr 24 Stunden bei 4–12 °C gelagert.

Die Fraktionen des Elutionsprofils, die den ACN53-adenoviralen Vektorpeak, wie durch A260 oder A280 bestimmt wurde, aufweisen, werden für die Weiterverarbeitung vereint. Der Größenausschluß-Pool wird durch einen Filter von 0,2 &mgr;m filtriert. Dieses Filtrat, die endaufgereinigte Hauptmenge des ACN53-adenoviralen Vektors wird dann in sterile Plastikflaschen (zum Beispiel Teflon) überführt und bei ungefähr –20 °C gelagert. Die prozessinternen Kontrollen für diesen Schritt werden in Tabelle III aufgelistet.

Die Zunahme der Reinheit des ACN53-adenoviralen Vektors bei jedem Schritt des Aufreinigungsverfahrens kann mittels Resource-HPLC verfolgt werden (siehe Huyghe et al., Human Gene Therapy, Band 6 (November 1995), Seiten 1403–1416 auf S. 1405). Die Qualität des Virus in dem ersten und dem zweiten chromatographischen Pool wird ebenfalls durch spektroskopische Verfahren überwacht. Das charakteristische Verhältnis von A260/A280 beträgt 1,23–1,31:1 für das endaufgereinigte Virus. Die Lichtstreuung, die von dem hohen Molekulargewicht des Virus herrührt, wird aus dem Verhältnis von A320/A260 nm abgeleitet und wird ebenfalls verwendet, um die chromatographischen Pools zu überwachen. Auf gereinigte, freie Viruspartikel zeigen ein Lichtstreuungsverhältnis von ungefähr 0,22–0,30:1.

Die folgenden Beispiele dienen der Veranschaulichung der vorliegenden Erfindung. Die ausgewählten Vektoren und Wirte und andere Materialien, die Kontzentration der Reagenzien, die Temperaturen und die Werte von anderen Variablen dienen nur der Veranschaulichung, wie die vorliegende Erfindung ausgeführt werden kann, und sollen nicht als ihre Grenzen aufgefaßt werden.

EXPERIMENTELLE BEISPIELE A. Aufreinigung von Adenovirus im kleinen Maßstab (1) Anionenaustauschchromatographie (DEAE-Fractogel)

Eine DEAE-EMD FractogelRTM 650 M-Säule (E. Merck) von 5 × 18 cm wurde mit 5 Bettvolumen (BV) von 0,5 M NaOH/1 M NaCl gefolgt von 6 BV 0,1 M HCl/1 M NaCl und dann mit 20 BV Puffer A (265 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 2 % (w/v) Saccharose, 50 mM Natriumphosphat bei pH 7,5) mit einer linearen Flußrate von 2 cm/min prä-äquilibriert. Die Beschickung für diese Säule wurde aus 2 Litern gefrorener, grober Viruslösung erhalten, die aufgetaut wurde, durch eine Membran von 0,45 &mgr; mikrofiltriert wurde und mit einer kleinen Menge 4 M NaCl auf eine Leitfähigkeit eingestellt wurde, die der von Puffer A entsprach. Die Beschickung wurde mit einer linearen Flussrate von 1 cm/min auf die Säule geladen. Die Säule wurde mit 4 BV von Puffer A gewaschen. Die Säule wurde dann mit 8 BV von 94 Puffer A/6 % Puffer B (identisch mit Puffer A abgesehen davon, dass das NaCl 600 mM ausmachte) gewaschen. Die Säule wurde mit 30 BV eines linearen Gradienten von 94 % Puffer A/6 % Puffer B hin zu 100 % Puffer B eluiert. Die Fraktionen, die reichlich Virus enthalten, wurden vereint, um die Beschickung ("DEAE-Pool") für die folgende Säule zu bilden.

(2) Isokratische Größenausschlußchromatographie (SuperdexRTM-200)

Die Größenausschlußchromatographie wurde auf einer SuperdexRTM-200-Säule (Pharmacia) von 5 × 73 cm durchgeführt, die mit 0, 5 BV 0,5 M NaOH, 1 BV H2O und 2 BV Puffer C (130 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 2 % (w/v) Saccharose, 50 mM Natriumphosphat bei pH 7,5) mit einer linearen Flußrate von 0,6 cm/min prääquilibriert wurde. Die Beschickung, die aus 220 ml des DEAE-Pools bestand, wurde auf die Säule geladen. Das ACN53 wurde mit Puffer C mit einer linearen Flußrate von 0,6 cm/min eluiert. Die Fraktionen, die reichlich Virus enthalten, wurden vereint, durch einen Mikrofilter von 0,2 &mgr; gegeben und gelagert. Das Viruskonzentrat kann bei niedriger Temperatur, zum Beispiel bei 0–10 °C, bevorzugt bei ungefähr 4 °C, oder wenn das Volumen gering, zum Beispiel weniger als ungefähr 50 ml beträgt, gefroren bei –80 °C gelagert werden.

(3) Größenausschlußchromatographie mit einem Salzgradienten (a) Salzverdünnungstest

Der DEAE-FractogelRTM-Pool (0,4 ml) wurde mit einem Puffer bestehend aus 50 mM Natriumphosphat, pH 7,5, 2 mM MgCl2, 2 Saccharose und keinem NaCl (0,8 ml) gemischt und sofort in eine Quarzküvette gegeben und die Absorption bei 260 und bei 320 nm in einem W-Spektrometer gemessen, das mit einem Photodiodenarray ausgestattet war Ohne die Probe aus der Küvette zu entnehmen, wurde die Ablesung über einen Zeitraum von 5 Minuten in Intervalen von 1–2 Minuten wiederholt. Wenn das Verhältnis von A320/A260 während des Zeitraums im Wesentlichen konstant war, dann war dieser DEAE-FractogelRTM-Pool entweder für isokratische Größenausschlußchromatographie oder für Größenausschlußchromatographie mit einem Salzgradienten geeignet. Wenn sich das Verhältnis von A320/A260 während dieses Zeitraums um mehr als ungefähr 4% erhöhte, dann erforderte dieser DEAE-FractogelRTM-Pool eine Größenausschlußchromatographie mit einem Salzgradienten, um die Ausbeute zu verbessern.

(b) Größenausschlußchromatographie mit einem Salzgradienten

Eine Chromatographie mit einem Salzgradienten wurde auf einer SuperdexRTM-200-Säule von 2,6 cm × 60 cm durchgeführt, die mit 0,5 BV 0,5 M NaOH, 1 BV H2O, und 2 BV Puffer C (20 mM Natriumphosphat, pH 8,0, 130 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 2 % Saccharose) prä-äquilibriert wurde. Unmittelbar vor dem Beladen mit dem DEAE-Pool wurde ein linearer Gradient von 100 % Puffer C hin zu 100 % Puffer D (20 mM Natriumphosphat, pH 8,0, 420 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 2 % Saccharose) von 0,15 BV (48ml) an die SuperdexRTM-200-Säule angelegt. Die Beschickung, die aus 20 ml eines DEAE-Pools bestand, die den oben beschriebenen Test nicht bestanden hatte, wurde dann auf die Säule geladen und mit Puffer D mit einer linearen Flußrate von 0,6 cm/min eluiert. Fraktionen mit reichlich Virus, die in oder nahe dem Durchflussvolumen eluierten, wurden vereint, durch einen sterilisierenden Filter gegeben und bei –80 °C gelagert. Die Ausbeute bei diesen Schritt betrug 60 % und das A230/A260-Verhältnis betrug 0,24:1.

B. Aufreinigung von Adenovirus im großen Maßstab (1) Anionenaustauschchromatographie

Das gefrorene Virenkonzentrat aus dem Fermentations- und Rückgewinnungsschritt wurde aufgetaut und durch eine hydrophile Durapore-Membran von 0,45 &mgr;m in eine Millipore 10° Opticap-Kapsel filtriert. Das Filtrat wurde in einem geschlossenen Tank gesammelt. Um Verluste zu minimieren, wurde die Filterkartusche mit ungefähr 1,5 1 von Puffer J-1 (50 mM Natriumphosphat pH 7,5, 265 mM Natriumchlorid, 2 mM Magnesiumchlorid, 2 % (w/v) Saccharose), der mit 5,4 % (w/w) von Lösung J-3 (4 M Natriumchlorid) ergänzt war, gewaschen. Die Salzkonzentration des Filtrats wurde durch Zugabe von 5,4 % (w/v) von Lösung J-3 (4 M Natriumchlorid) eingestellt. Diese Beschickungslösung wurde dann auf eine FractogelRTM-IMD DEAE-650 M-Säule (7 cm Durchmesser, 14,8 cm Betthöhe, 570 ml Bettvolumen) gegeben, die mit Puffer J-1 (50 mM Natriumphosphat pH 7,5, 265 mM Natriumchlorid, 2 mM Magnesiumchlorid, 2 % (w/v) Saccharose) prä-äquilibriert war. Das Adenovirus bindet an das Anionenaustauschharz, während der Großteil des Mediums und der Wirtszellverunreinigungen in dem verbrauchten Medium durch die Säule passiert. Die Säule wurde anfänglich mit 4 Bettvolumen von Puffer J-1 gewaschen, gefolgt von einer zweiten isokratischen Waschung mit 8 Bettvolumen von 94 % Puffer J-1 und 6 % Puffer J-2 (50 mM Natriumphosphat pH 7,5, 600 mM Natriumchlorid, 2 mM Magnesiumchlorid, 2 % (w/v) Saccharose), um zusätzliche Verunreinigungen zu entfernen. Das Virus wurde mit 30 Bettvolumen eines linearen Gradienten von 6 % bis 100 % Puffer J-2 aus der Säule eluiert. Der Adenoviruspeak des Elutionsprofils, wie er mittels A280 bestimmt wurde, wurde gesammelt und für die weitere Verarbeitung vereint. Die prozessinternen Kontrollen und Betriebsparameter für den Anionenaustauschchromatographie-Schritt sind in Tabelle V zusammengefaßt.

Tabelle V: Prozessinterne Kontroll- und Betriebsparameter für die Anionenaustauschchromatographie

(2) Größenausschlußchromatographie

Der DEAE-Pool wurde sofort auf eine SuperdexRTM-200-Größenausschlußsäule (14 cm Durchmesser, 77 cm Betthöhe, 11,9 l Bettvolumen) gegeben, die mit Puffer K-1 (20 mM Natriumphosphat pH 8,0, 100 mM Natriumchlorid, 2 mM Magnesiumchlorid, 2 % (w/v) Saccharose) prä-äquilibriert worden ist. Die Säule wurde mit Puffer K-1 eluiert. Der Adenoviruspeak des Elutionsprofils, wie es mittels A280 bestimmt wurde, wurde gesammelt und vereint. Dieser Chromatographieschritt erzielte einen Pufferwechsel und die Trennung von Verunreinigungen mit niedrigem Molekulargewicht von dem Adenovirusprodukt. Die prozessinternen Kontrollen und Betriebsparameter für den Größenausschlußchromatographieschritt sind in Tabelle VI zusammengefaßt.

Tabelle VI: Prozessinterne Kontroll- und Betriebsparameter für die Größenausschlußchromatographie

(3) Letzte 0,2 &mgr;m-Filtration

Der SuperdexRTM-200-Pool wurde bei 2 bis 15 °C durch eine hydrophile Durapore-Membran von 0,2 &mgr;m (Stericup, Millipore) filtriert. Dieser Schritt wurde unter sterilen Bedingungen in einer Biosicherheitszelle ("biosafety cabinet") durchgeführt. Da verschiedene Filtrationsgeräte verwendet wurden, wurden die einzelnen Filtrate vereint und dann in autoklavierte Behälter aliquotiert. Die Behälter mit der Hauptmasse der Arzneimittelsubstanz in Lösung wurden in einem Trockeneis/Ethanol-Bad gefroren und bei ungefähr –20 °C gelagert.

Modifikationen und Variationen dieser Erfindung werden für die Fachleute offensichtlich sein. Die hier beschriebenen spezifischen Ausführungsformen werden nur als Beispiel dargestellt und die Erfindung soll nicht als durch sie eingeschränkt ausgelegt werden.


Anspruch[de]
Verfahren zum Auf reinigen von Adenovirus aus einer Virusaufbereitung, das die folgenden aufeinanderfolgenden Schritte umfasst:

a) Unterwerfen der Virusaufbereitung einer Anionenaustauschchromatographie, wobei das Adenovirus aus einem Anionenaustauschchromatographie-Medium eluiert wird, und

b) Unterwerfen des Eluats aus Schritt a), welches das Adenovirus enthält, einer Größenausschlußchromatographie, wobei das Adenovirus aus einem Größenausschlußchromatographie-Medium eluiert wird,

wobei das Größenausschlußchromatographie-Medium ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus G6000PWXL, SB-806, SEPH-ACRYL S-400 HR, SEPHADEX G-200, SEPHAROSE CL-2B, SUPERDEX 200 mit Präparationsgüte, SUPEROSE 6 mit Präparationsgüte, TSK 6000PWXL und ULTRAHYDROGEL 2000.
Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem die Virusaufbereitung ein Zelllysat ist. Verfahren gemäß Anspruch 2, bei dem das Zelllysat vor Schritt a) gefiltert wird. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem das Adenovirus rekombinant ist. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem das Adenovirus ACN53 ist. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem das Anionenaustausch-Medium Dimethylaminoethylgruppen oder Diethylaminoethylgruppen auf einem kreuzvernetztem Agarose-, Cellulose-, Polyacrylamid- oder Polystyrengrundgerüst umfasst. Verfahren gemäß Anspruch 6, bei dem das Anionenaustausch-Medium Diethylaminoethyl-FRACTOGEL ist. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem das Größenausschluß-Medium SUPERDEX 200 mit Präparationsgüte ist. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem das Anionenaustauschchromatographie-Medium vor Schritt a) gründlich gewaschen wird. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem Schritt b) weiterhin das Eluieren des Adenovirus aus dem Größenausschlußchromatographie-Medium in einen Niedrigsalz-Puffer umfasst, wobei das Größenausschluß-Medium in einer Säule vorliegt, die einen Salzgradienten aufweist, dessen Ionenstärke von der Spitze der Säule zum Boden der Säule hin abnimmt. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem das Anionenaustauschchromatographie-Medium oder das Größenausschlußchromatographie-Medium mit einem Puffer in Kontakt gebracht wird, der Glycerin oder 2–16 % Saccharose umfasst. Verfahren gemäß Anspruch 11, bei dem Glycerin in allen Puffern vorliegt, die in dem Verfahren verwendet werden. Verfahren gemäß Anspruch 1, das ferner einen Schritt des Zugebens von Glycerin in eine vereinte Fraktion umfasst, welche das Adenovirus enthält.






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