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Dokumentenidentifikation DE60034033T2 06.12.2007
EP-Veröffentlichungsnummer 0001181548
Titel VORRICHTUNG ZUM SCREENING VON KRISTALLISIERUNGSBEDINGUNGEN IN LÖSUNGEN ZUR KRISTALLZÜCHTUNG
Anmelder University of Alabama, Birmingham Research Foundation, Birmingham, Ala., US
Erfinder DELUCAS, Lawrence J., Birmingham, AL 35243, US;
BRAY, Terry L., Birmingham, AL 35216, US
Vertreter MÜLLER FOTTNER STEINECKE Rechtsanwälte Patentanwälte, 80335 München
DE-Aktenzeichen 60034033
Vertragsstaaten AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 05.04.2000
EP-Aktenzeichen 009216904
WO-Anmeldetag 05.04.2000
PCT-Aktenzeichen PCT/US00/08977
WO-Veröffentlichungsnummer 2000060345
WO-Veröffentlichungsdatum 12.10.2000
EP-Offenlegungsdatum 27.02.2002
EP date of grant 21.03.2007
Veröffentlichungstag im Patentblatt 06.12.2007
IPC-Hauptklasse G01N 31/00(2006.01)A, F, I, 20051017, B, H, EP
IPC-Nebenklasse G01N 33/00(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   C30B 7/00(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   

Beschreibung[de]
Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft die Kristallisation von Proteinen in oder aus Proteinlösungen. Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere ein Verfahren zum Screening einer großen Anzahl von Proteinkristallwachstumsbedingungen, welche förderlich für die Proteinkristallisation sein können. Noch spezifischer betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren, welches eine oder mehrere optimale Proteinkristallwachstumsbedingungen identifiziert, während gleichzeitig wesentlich weniger Proteinlösung verwendet wird.

Hintergrund der Erfindung

Die Kristallisation von Proteinen für Studien zur Strukturfunktion und für das strukturbasierte Wirkstoffdesign stellt mittlerweile einen zunehmend an Bedeutung gewinnenden Teil der biotechnologischen Forschung dar. Wird das Kristallwachstum für ein neues Protein versucht, so sind die geeigneten chemischen Bedingungen (d.h. die Proteinkonzentration in Lösung, Art und Konzentration des Präzipitats, pH-Wert sowie Wachstumstemperatur) unbekannt und wurden bisher typischerweise mittels der Methode von Versuch und Irrtum experimentell bestimmt.

Typischerweise werden 1.000 oder mehr verschiedene Sets von Kristallwachstumsbedingungen durchgemustert, um für die Kristallisation förderliche Bedingungen zu bestimmen. Das Screening beinhaltet sich wiederholende Arbeitsabläufe, welche extrem arbeits- und zeitaufwendig sind. Mit der derzeitigen Laborausstattung für das Proteinkristallwachstum wird für jede Kristallisationskammer etwa ein Mikroliter Proteinlösung benötigt. Die Proteinlösungen weisen typischerweise Konzentrationen im Bereich zwischen 10 und 25 Mikrogramm pro Mikroliter auf, um das Kristallwachstum zu ermöglichen. Daher sind für das Screening von 1.000 Proben typischerweise zwischen 10 und 25 Milligramm Protein erforderlich. Dies ist eine beträchtliche und auch kostspielige Menge, insbesondere bei Proteinen, die schwer zu isolieren oder allgemein zu exprimieren sind. Ein hoher Prozentsatz (etwa 50%) der Proteine kann nicht ohne weiteres in einer Größenordnung von Milligramm exprimiert werden.

Es wäre daher wünschenswert, Verfahren zum Screening von Proteinkristallwachstumsbedingungen bereitzustellen, für welche Proteinmengen in einer Größenordnung von Pikogramm oder Mikrogramm für jede Screeningbedingung erforderlich sind. Vorzugsweise wären für solche Verfahren lediglich Proteinmengen in einer Größenordnung von Pikogramm oder Nanogramm in Volumina von Pikolitern oder Nanolitern in jeder Screeningbedingungsprobe erforderlich.

Des Weiteren wäre es wünschenswert, Screeningverfahren mit hohem Durchsatz zum Screening von Proteinkristallwachstumsbedingungen in einer großen Anzahl von Proben in einer kleineren Größenordnung als Mikrogramm bereitzustellen. Diese Verfahren würden einen Mikroarray als Plattform für das Proteinkristallwachstum verwenden. Die Verfahren würden ebenfalls eine automatische Dispension von Lösungen sowie Bewertung des Kristallwachstums verwenden.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung ist ein Verfahren zum Screening von Proteinkristallwachstumsbedingungen unter Verwendung einer minimalen Menge an Protein, vorzugsweise in einer Größenordnung zwischen Pikogramm und Mikrogramm. Jede Screeningprobe weist Proteinmengen in einer Größenordnung zwischen Pikogramm und Mikrogramm in einem Volumen zwischen Pikolitern und Nanolitern auf. Vorbestimmte Proteinkristallwachstumsbedingungen werden aufrecht erhalten und das Kristallwachstum wird unter Anwendung sowohl qualitativer als auch quantitativer Kriterien analysiert.

Es wird ein Mikroarray zur Verwendung in Verfahren zum Screening des Proteinkristallwachstums bereitgestellt. Vorzugsweise weist der Mikroarray eine Vielzahl von in dem Mikroarray angeordneten Mikrokammmern auf. Die Mikrokammern können passiv oder eine Kombination aus passiven Mikrokammern sein, die mit miniaturisierten aktiven Steuerelementen so wie, jedoch nicht beschränkt auf, Ventile, Pumpen und Elektroden verbunden sind. Eine Proteinlösung wird automatisch in die Mikrokammern dispensiert. Die Proteinkristallwachstumsbedingungen einer jeden der Mikrokammern werden so eingestellt, dass sich die Proteinkristallwachstumsbedingungen von mindestens zwei der Mikrokammern voneinander unterscheiden. Das Proteinkristallwachstum in den Mikrokammern wird dann auf der Basis von sowohl dem qualitativen Ausmaß der Kristallisation als auch der Qualität der gebildeten Kristalle analysiert.

Zusätzliche Gegenstände, Vorteile und Merkmale der vorliegenden Erfindung werden aus der nachfolgenden Beschreibung und den angehängten Ansprüchen in Verbindung mit den beigefügten Zeichnungen hervorgehen.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Die verschiedenen Vorteile der vorliegenden Erfindung werden dem Fachmann beim Lesen der nachfolgenden Spezifikation und den angehängten Ansprüchen sowie unter Bezugnahme auf die nachfolgenden Zeichnungen deutlich werden, in welchen:

1 eine schematische Darstellung einer Zwei-Well-Konstruktion in einem Mikroarray ist;

2A eine schematische Darstellung einer Draufsicht der Einbringung von Protein- und Präzipitatlösungen in eine Ein-Well-Konstruktion ist;

2B eine schematische Darstellung einer Seitenansicht der Einbringung von Protein- und Präzipitatlösungen in ein Well ist;

2C eine schematische Darstellung einer Seitenansicht einer alternativen Einbringung von Protein- und Präzipitatlösungen in ein Well ist;

2D eine schematische Darstellung einer Seitenansicht der Einbringung von Protein- und Präzipitatlösungen in zwei Wells ist;

2E eine schematische Darstellung einer Draufsicht der Einbringung von Protein- und Präzipitatlösungen in eine Zwei-Well-Konstruktion ist;

3 eine Fotografie von einem Mikroarray ist; und

4 eine Fotografie von einem Proteinkristall ist, der mit Proteinmengen in einer Größenordnung von Nanogramm in Volumina von Nanolitern erhalten wurde.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Das Verfahren der vorliegenden Erfindung ist vorgesehen zum Screening von Proteinkristallwachstumsbedingungen in Proteinlösungen unter Verwendung einer minimalen Menge von Protein in einem minimalen Volumen, vorzugsweise in einer Größenordnung im Piko-, Nano- oder Mesobereich. Wie hierin verwendet, umfasst eine Größenordnung im Piko-, Nano- oder Mesobereich vorzugsweise (durchschnittliche) Proteinmengen in einem Bereich von Pikogramm (pg), Nanogramm (ng) oder Mikrogramm (&mgr;g) in Volumina im Bereich von Pikolitern (pl) oder Nanolitern (nl). Vorzugsweise liegt die Menge an Protein in jeder Screeningprobe unter etwa 5 &mgr;g. Mehr bevorzugt wird die Menge an Protein in einer Screeningprobe unter etwa 1 &mgr;g liegen. Das Volumen der Proteinlösung in einer Screeningprobe liegt zwischen etwa 0,001 nl und etwa 250 nl und bevorzugt zwischen etwa 0,01 nl und etwa 10 nl. Der Fachmann wird erkennen, dass die für jedes spezifische Protein tatsächlich verwendeten Volumina eine Funktion (ohne Einschränkung) des Targetproteins und dessen Konzentration in der Proteinlösung sein werden.

Die Proteinlösung enthält eines oder mehrere erwünschte Proteine zur Kristallisation. Wie hierin verwendet, soll der Begriff "Protein" alle natürlich vorkommenden und synthetischen Peptide, Polypeptide, Proteine und Proteinkomplexe einschließen. In einer bevorzugten Ausführungsform beträgt die Konzentration an Protein in der Lösung zwischen etwa 0,1 &mgr;g/&mgr;l und etwa 50 &mgr;g/&mgr;l, mehr bevorzugt zwischen etwa 0,1 &mgr;g/&mgr;l und etwa 10 &mgr;g/&mgr;l und noch mehr bevorzugt zwischen etwa 0,1 &mgr;g/&mgr;l und etwa 1,0 &mgr;g/&mgr;l. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird die Lösung auf einen pH-Wert zwischen etwa 2,0 und etwa 10,0 gepuffert, mehr bevorzugt zwischen etwa 3,0 und 8,5. Sofern dies gewünscht wird, kann die Proteinlösung optional Agenzien enthalten, die bei der gewünschten Proteinkonzentration oder den gewünschten Bedingungen den Aufschluss des Proteins unterstützen. Handelt es sich bei dem Protein z. B. um ein Membranprotein, so kann die Proteinlösung optional eine oder mehrere oberflächenaktive Substanzen enthalten, so wie ein Reinigungsgemisch. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Proteinlösung ebenfalls Komponenten, welche die Kristallisation unterstützen. Als nicht einschränkendes Beispiel wird die Proteinlösung eine wässrige Salzlösung, Polyethylenglykol oder einen Alkohol umfassen. Solche Komponenten, ebenso wie deren Auswahl, Bereiche, Gegenindikationen und dergleichen, sind dem Fachmann wohlbekannt. Siehe z. B. Gilliland, G.L. et al., Acta Crystallogr. D50:408–413 (1994); McPherson, A., Crystallization of Biological Molecules, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, USA, pp. 487–524 (1999).

Die Proteinlösung wird auf einer Plattform dispensiert. Bei der Plattform handelt es sich um einen Mikroarray. Die Lösung wird vorzugsweise unter Verwendung einer Vorrichtung mit einer Genauigkeit im Bereich von Pikolitern oder Nanolitern dispensiert. Vorzugsweise weist die Dispenservorrichtung eine Genauigkeit von wenigstens 90% in einem Bereich von Pikolitern oder Nanolitern auf. Die Proteinlösung kann manuell dispensiert werden, z. B. unter Verwendung einer Spritze. In einer in höchstem Maße bevorzugten Ausführungsform werden automatische Dispenservorrichtungen verwendet, um die Proteinlösung zu dispensieren.

Es wird eine zweite Lösung, die Reservoir- oder Präzipitatlösung, bereitgestellt. Bei der Präzipitatlösung handelt es sich um eine Lösung, die die Herbeiführung der Proteinkristallisation unterstützt. Sie kann z. B. eine Salzlösung, einen Alkohol oder ein Polyethylenglykol umfassen. Die zweite Lösung wird entweder vor, nach oder gleichzeitig mit der Proteinlösung bereitgestellt. Das Volumen der Präzipitatlösung ist typischerweise gleich oder größer als das Volumen der Proteinlösung. Die Zugabe der zweiten Lösung steht in Fluidkommunikation mit der ersten Lösung. Bei der Fluidkommunikation handelt es sich um eine Flüssigkeit-Flüssigkeit-Kommunikation. Im Allgemeinen ist für die Fluidkommunikation ein Kanal vorgesehen. Ein Kanal wird hierin allgemein als ein Raum definiert, der das Auftreten der Fluidkommunikation ermöglicht. Die Proteinlösung und die Präzipitatlösung kontaktieren sich an einer Berührungsstelle.

In einer alternativen Ausführungsform kann ebenfalls eine einzelne Quelle oder ein einzelnes Reservoir der zweiten Lösung verwendet werden. In einer weiteren alternativen Ausführungsform kann anstelle der zweiten Lösung eine Trockenmittelquelle oder ein trockenes gasförmiges Reservoir verwendet werden. Spezifische Bedingungen und Variationen in diesen Verfahren sind dem Fachmann wohlbekannt.

Das Proteinkristallwachstum wird periodisch überwacht, und zwar entweder qualitativ oder quantitativ oder beides. Dies kann mittels manueller Inspektion unter Verwendung von hochauflösender Mikroskopie oder Elektronenmikroskopie geschehen. Das Proteinkristallwachstum kann vorzugsweise automatisch überwacht werden, z. B. mittels eines hochauflösenden optischen Mittels, welches das Kristallwachstum automatisch detektiert, z. B. auf der Basis der Edge-Analyse. Wird in einer Probe wünschenswertes Kristallwachstum beobachtet, so können die Proteinkristallwachstumsbedingungen dieser Probe in einem Makromaßstab reproduziert werden, um einen Proteinkristall zur weiteren Analyse herzustellen. Wird ein Präzipitat oder eine klare Probe beobachtet, so können diese Bedingungen alternativ dazu verwendet werden, um die Bedingungen für ein zusätzliches Screening zu optimieren. Es ist klar, dass die Plattform mindestens einen Weg aufweisen muss, der visuell und/oder optisch durchlässig für das Verfahren zur Detektion ist.

Das Verfahren der vorliegenden Erfindung zum Screening von Proteinkristallwachstum verwendet einen Mikroarray mit einer Vielzahl an Wells oder Reservoirs, welche die Plattform bilden. Ein Mikroarray kann z. B. ähnlich wie ein mikroelektromechanischer Chip konstruiert werden. Der Mikroarray weist vorzugsweise eine plane Form auf sowie eine Größe und Dicke, die mit manuellen oder automatischen Plattengreifern kompatibel sind. Der Mikroarray kann aus verschiedenen Materialien und mittels verschiedener dem Fachmann bekannter Techniken hergestellt werden. Das Material des Mikroarrays, einschließend die Wells oder Reservoirs, ist vorzugsweise minimal wasserabsorbierend und ist ansonsten ausreichend unreaktiv gegenüber den Komponenten der Lösung. Es kann z. B. als ein Laminat oder eine Beschichtung bereitgestellt werden. Alternativ dazu kann ein Material, das Wasser in einem prognostizierbaren Ausmaß absorbiert, ebenfalls dazu verwendet werden, die Wells oder Reservoirs zu konstruieren. Die Volumina der Protein- und Präzipitatlösungen können dann so eingestellt werden, dass sie die Wasserabsorption des Materials ausgleichen. Bevorzugte Materialien schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf, Glas, geschmolzenes Silizium, Quarz, einen Siliziumwafer, ein Polymer oder ein Polysulfon. Alternativ dazu kann der Mikroarray aus einem Material gefertigt werden, das mit einem hydrophoben Material beschichtet ist, so wie Polysulfon, um die Wasserabsorption in den Mikroarray zu beschränken. Alternativ dazu umfasst der Mikroarray mehr als ein Material. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Mikroarray um eine Verbundstruktur mit einem Boden aus einer dünnen Glasplatte, welche fest verbunden ist mit Plastik, Glas, Silikonkautschuk oder anderen Materialien, in denen Wells hergestellt werden können, wobei wenigstens eine Seite einen optischen Weg bereitstellt, der für die angewandte Detektionstechnik akzeptabel ist.

In einer alternativen Ausführungsform sind die Oberflächen der Wells hydrophob. Das Material des Mikroarrays kann z. B. eine hydrophobe Oberfläche aufweisen. Alternativ dazu können die Oberflächen der Wells mit einer hydrophoben Beschichtung versehen sein. Auch wenn dies nicht notwendig ist, hindern die hydrophoben Oberflächen der Wells die Tropfen der Lösungen daran, sich auszubreiten.

Der Mikroarray schließt eine Vielzahl von Wells in Mikrongröße auf der Oberfläche des Chips ein. Der Begriff "Wells" umfasst Wells, Mikrokammern sowie jede Vertiefung, die ausreichend ist, um ein gewünschtes Volumen von zwischen etwa 0,001 nl und etwa 500 nl, bevorzugt zwischen etwa 0,01 nl und etwa 20 nl, zu halten oder aufzunehmen. Die Wells sind in regelmäßigen Abständen zueinander auf der Oberfläche angeordnet. Die exakte Anzahl von Wells auf der Oberfläche des Mikroarrays kann variieren und die gesamte Anzahl von Wells auf der Oberfläche hängt von der Auswahl des Benutzers ab.

Jeder der Wells weist ein Volumen auf, das ausreichend ist, um eine zur Züchtung eines Proteinkristalls geeignete Menge an Proteinlösung aufzunehmen. Jeder der Wells weist ein Volumen zwischen etwa 0,001 nl und etwa 250 nl auf, bevorzugt zwischen etwa 0,01 nl und etwa 10 nl.

Die Wells des Mikroarrays werden hergestellt, indem man ein Ätzmittel so wie Hydrogenfluorid verwendet, oder mittels anderer bekannter Ätz- bzw. Fabrikationstechniken.

Die Wells können bekannte Mittel zur einzelnen oder kollektiven Regulierung von Bedingungen einschließen, so wie Druck, Erhitzen oder Abkühlen der Wells, Feuchtewerte in den Wells, ebenso wie bekannte Mittel zum Bewegen der Materialien, mit denen die Wells beladen wurden.

In einer Anordnung sind die Wells des Mikroarrays nicht miteinander verbunden, sondern voneinander getrennt. In einer alternativen Anordnung sind nebeneinander liegende Wells des Mikroarrays durch einen oder mehrere Kanäle miteinander verbunden, welche eine Fluidkommunikation zwischen den nebeneinander liegenden Wells bereitstellen (1 und 2D2E). Vorzugsweise werden die Verbindungskanäle Querschnittsdimensionen sowie Längen aufweisen, welche eine Regulierung der Geschwindigkeit des Transports von Fluid, Dampf, Puffer oder Fällungs- oder Kristallisationsmitteln durch die Kanäle ermöglichen. In einer Ausführungsform reguliert eine Veränderung der Dimensionen der Kanäle die Proteinkristallwachstumsbedingung. In einer alternativen Ausführungsform werden die Proteinkristallwachstumsbedingungen mittels der Einbringung eines Materials in die Mikrokanäle reguliert, welches die Fluidkommunikation zwischen den Wells reguliert. Als nicht einschränkende Beispiele sind Membranen, Acrylamide oder Agarose zu nennen. Die verbindenden Mikrokanäle weisen z. B. eine Breite von etwa 0,0001 bis etwa 0,2 Mikron sowie eine Tiefe von etwa 0,00005 bis etwa 0,1 Mikron auf. Alternativ dazu weisen die Mikrokanäle eine Breite von etwa 0,0001 Mikron bis etwa 2,0 Mikron sowie eine Tiefe von etwa 0,00005 bis etwa 0,5 Mikron auf. Die Mikrokanäle werden in dem Mikroarraychip mittels der bekannten Ätztechniken ausgebildet.

Ein Beispiel für zwei Wells in einem Mikroarray (10), die durch einen Mikrokanal miteinander verbunden sind, ist in 1 dargestellt. Der die Proteinlösung enthaltende Well 12 ist durch einen Mikrokanal 16 mit dem die Präzipitatlösung enthaltenden Well 14 verbunden. Die Dimensionen eines jeden Wells sind so konzipiert, dass sie die gewünschte Menge an Lösung aufnehmen, und können die gleichen oder unterschiedliche Dimensionen aufweisen. Zu Beginn wird die Proteinprobe bis zu einer anfänglichen Füllhöhe 18 in den Well 12 und die Präzipitatlösung mit der Füllhöhe 20 in den Well 14 gegeben. Die Wells und der Mikrokanal werden an der Oberfläche mittels einer optisch durchlässigen Abdeckung 22 abgedichtet.

Die Konzentration der Proteinlösung in Well 12 führt die Proteinkristallbildung herbei.

Der Mikroarray kann ebenfalls bekannte Mittel zur Weiterleitung eines Fluids oder eines Gases von einer externen Quelle in die Wells des Mikroarrays einschließen. Es kann z. B. ein externes mechanisches Pumpsystem verwendet werden, welches von Watson-Marlowe, Inc., unter der Handelsbezeichnung "205U" vertrieben wird. Bei dem Pumpsystem handelt es sich um eine Multikanalkassette, welche Fluid oder Gas in reproduzierbaren und exakt regulierten Mengen zuführt.

Optional sind in den Wells und Mikrokanälen Mikroventile vorgesehen, um den Fluss von Fluid oder Dampf zwischen den Wells und durch die Mikrokanäle in einer bekannten Art und Weise zu regulieren.

Es wird ebenfalls eine automatische Dispenservorrichtung bereitgestellt, welche dazu in der Lage ist, Volumina im Bereich von Pikolitern und/oder Nanolitern exakt und/oder mehrmals zu dispensieren. Vorzugsweise weist die automatische Dispenservorrichtung eine Genauigkeit von wenigstens etwa 90% auf. Bei den automatischen Dispenservorrichtungen handelt es sich vorzugsweise um Piezo-basierte oder dauermagnetische Dispenservorrichtungen. Mehr bevorzugt handelt es sich bei der Dispenservorrichtung um eine dauermagnetische Dispenservorrichtung. Der Dispenser weist eine große Anzahl von parallelen Kapillaren auf. Die Kapillaren stehen mit einer Proteinlösungsquelle, einer Präzipitatlösungsquelle sowie einer Pufferlösungsquelle in Fluidkommunikation. Die Dispension kann durch Ultraschallsignalgeber ausgelöst werden, welche in den die Lösung enthaltenden Kapillaren auf wirksame Art und Weise eine Druckwelle erzeugen. Der Dispenser funktioniert analog zu den Tintenstrahldruckerköpfen eines Computerdruckers, nur dass das Fluid nicht aufgeheizt wird, um somit die Lösungen nicht zu beeinträchtigen.

Die Proteinlösung umfasst vorzugsweise eine wässrige Proteinlösung bei einer Konzentration von zwischen etwa 0,1 &mgr;g/&mgr;l und etwa 50 &mgr;g/&mgr;l. Bevorzugt liegt die Konzentration zwischen etwa 0,1 &mgr;g/&mgr;l und etwa 10 &mgr;g/&mgr;l, mehr bevorzugt zwischen etwa 0,1 &mgr;g/&mgr;l und etwa 1,0 &mgr;g/&mgr;l. Vorzugsweise umfasst die Proteinlösung bei der Kristallisation von Membranproteinen ein Reinigungsgemisch. Die Präzipitatlösung umfasst vorzugsweise eine konzentrierte wässrige Salzlösung oder Polyethylenglykol als Präzipitationsmittel. Die Pufferlösung weist vorzugsweise einen pH-Wert zwischen etwa 2 und etwa 10 auf.

Die automatische Dispenservorrichtung dispensiert jeweils ein Anfangsvolumen der Proteinlösung, ein Anfangsvolumen der Präzipitatlösung sowie ein Anfangsvolumen der Pufferlösung aus der Quelle der Proteinlösung, der Quelle der Präzipitatlösung und der Quelle der Pufferlösung in vorbestimmte Wells oder Verbindungskanäle des Mikroarrays.

Die Einbringung des Anfangsvolumens der Proteinlösung, des Anfangsvolumens der Präzipitatlösung und des Anfangsvolumens der Pufferlösung in die vorbestimmten Wells oder Kanäle des Mikroarrays hängt von dem Verfahren ab, das angewandt wird, um die Kristallisation des Proteins in der Proteinlösung zu bewirken.

Bei dem Flüssigkeit-Flüssigkeit-Diffusionsverfahren wird das Anfangsvolumen der Proteinlösung in ein Set vorbestimmter Wells eingebracht und das Anfangsvolumen der Präzipitatlösung wird in ein separates oder unterschiedliches Set von Wells eingebracht. Die die Proteinlösung enthaltenden Wells sind durch Mikrokanäle mit den die Präzipitatlösung enthaltenden Wells verbunden. Das Anfangsvolumen der Pufferlösung kann in die Mikrokanäle eingebracht oder alternativ dazu direkt zu dem Anfangsvolumen der Proteinlösung und/oder der Präzipitatlösung zugegeben werden.

Bei der Konzentration, den Mengen, der Art des Präzipitats sowie dem pH-Wert der Anfangsvolumina der Proteinlösung, Präzipitatlösung und der Pufferlösung handelt es sich um primäre Bedingungen, welche das Proteinkristallwachstum in einer Proteinlösung bestimmen. Bei der Herstellung der Anfangslösungen und bei der Platzierung der automatischen Dispenservorrichtung werden diese Bedingungen sowie die Probeneinbringung in Übereinstimmung mit einem vorbestimmten Programm variiert.

Es wird eine Abdeckplatte auf dem Mikroarray befestigt, um die Wells in Mikrokammern und die Mikrokanäle in eine kapillare Röhrenstruktur umzuwandeln. Die Abdeckplatte kann aus dem gleichen oder aus einem unterschiedlichen Material bestehen wie der Mikroarray; die Abdeckplatte (oder ein gewisser Teil des Wells oder der Kammer) muss transparent sein, um die optische Analyse der Proteinlösungen in den Kammern des Mikroarrays zu gestatten. Vorzugsweise wird die Abdeckplatte aus Glas oder einem anderen Material bestehen, das visuell oder optisch durchlässig ist, so wie ein optisch durchlässiges Band.

Alternativ dazu kann das den Mikroarray umgebende Milieu so reguliert werden, dass die Verdampfung der Lösungen begrenzt wird. Unter kontrollierten Bedingungen für beispielsweise Temperatur und Feuchte kann sich ein Abdecken der Proben als unnötig erweisen.

Das Kristallisationsmittel in der Präzipitatlösung, in ausgewählten Mikrokammern, diffundiert über die verbindenden Kapillaren in ausgewählte Mikrokammern, welche Proteinlösung enthalten.

Das Proteinkristallwachstum in den unterschiedlichen Kammern wird dann mittels eines hochauflösenden oder eines anderen optischen Mittels überwacht, welches Kristallwachstum automatisch auf der Basis der wohlbekannten Edge-Analyse detektiert. Alternativ dazu kann das Proteinkristallwachstum mittels manueller Inspektion unter Verwendung hochauflösender Mikroskopie oder Elektronenmikroskopie überwacht werden. Vorzugsweise wird das Proteinkristallwachstum in den Kammern durch ein hochauflösendes optisches Mittel überwacht, welches das Kristallwachstum auf der Basis der Edge-Analyse automatisch detektiert.

Wurde das Kristallwachstum in einer Kammer detektiert, so können die Proteinkristallwachstumsbedingungen dieser Kammer in einem Makromaßstab reproduziert werden, um einen Proteinkristall herzustellen, der mittels Röntgenkristallographie analysiert werden kann. In dem Fall, dass ein Präzipitat oder eine klare Probe zu beobachten ist, können alternativ dazu die Bedingungen in diesen Proben dazu verwendet werden, die Bedingungen für ein zusätzliches Screening zu optimieren.

Sofern dies gewünscht wird, kann den Mikrokammern Fluid oder Gas in reproduzierbaren und exakt regulierten Mengen mittels des zuvor beschriebenen Pumpsystems von einer externen Quelle zugeführt werden. Gas kann ebenfalls mittels des Drucks zugeführt werden, der von einer standardisierten Glasflasche oder einem Tank erzeugt wird. Das den Mikrokammern zugeführte Fluid oder Gas kann mittels der Mikroventile reguliert werden. Das Fluid oder Gas kann dazu verwendet werden, die Kristallwachstumsbedingungen der Mikrokammer weiter zu verändern und die Größe des gezüchteten Proteinkristalls zu erhöhen. Diese Proteinkristalle können dann geerntet und mittels Röntgenkristallographie oder nuklearmagnetischer Spektroskopie oder anderer geeigneter Techniken untersucht werden.

Die Vorteile der vorliegenden Erfindung sollten nunmehr auf der Hand liegen. Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Screening von Proteinkristallwachstumsbedingungen in einem Nano- oder Mesomaßstab bereit. Das Verfahren stellt ein Mittel zum Screening von Proteinkristallwachstumsbedingungen sowohl für Proteine bereit, die nicht in Mengen von Milligramm exprimiert werden können, als auch für solche, die in größeren Mengen exprimiert werden können. Darüber hinaus reduziert die substantielle Verringerung der Menge an Protein, die für die vorliegende Erfindung benötigt wird, die mit dem Screening von Proteinkristallwachstumsbedingungen verbundenen Kosten.

Es wird ebenfalls ein Gerät zum Screening von Kristallwachstumsbedingungen bereitgestellt. Dieses Gerät umfasst einen Mikroarray für die Protein- und Präzipitatlösungen, eine automatische Dispenservorrichtung zur Dispension der Lösungen sowie ein automatisches Mittel zur Analyse des Kristallwachstums.

Die gewünschten Lösungen, nämlich Protein-, Präzipitat- und eine Pufferlösung, werden vorzugsweise von einer automatischen Dispenservorrichtung in einem vorgegebenen Volumen im Bereich von Pikolitern oder Nanolitern automatisch in den Mikroarray dispensiert. Die automatische Dispenservorrichtung dispensiert vorzugsweise diskrete Tropfen. Die Screeningbedingungen, so wie die Art des Puffers und der pH-Wert, können mittels Programmierung des automatischen Dispensers von Probe zu Probe variiert werden. So könnten z. B. beliebige Screens mit unterschiedlichen pH-Werten programmiert werden, indem man unter Verwendung unterschiedlicher Tropfenzahlen von unterschiedlichen Vorratslösungen mit verschiedenen pH-Werten die geeigneten Verhältnisse mischt. Ein pH-Bereich zwischen 2,0 und 10,0 wird dann in Schritten von 0,2–0,5 pH-Einheiten durchgemustert. Andere Bedingungen, so wie Kristallisationsmittel und Salzkonzentration, werden ebenfalls in einer ähnlichen Weise reguliert.

Das Mischen der Reagenzien kann entweder vor der Dispension erfolgen oder nachdem die Lösungen in den Mikroarray dispensiert wurden. Das Mischen im Mikroarray kann beispielsweise mittels Ultraschallmischung, Hochgeschwindigkeitsdispension von Pikoliter-Tropfen, schneller Temperaturfluktuation oder mittels statischer Diffusion erfolgen.

Nach dem Mischen werden die Wells des Mikroarrays vorzugsweise abgedichtet, um das Mikromilieu in den Wells zu regulieren und ein Verdampfen der Lösungen bis hin zur Austrocknung zu vermeiden. Mehr bevorzugt werden die Wells mit einem optisch transparenten Band abgedichtet. Das Abdichten des Mikroarrays schließt einen Arm ein, welcher auf einem in YZ-Richtung quer verlaufenden Mechanismus montiert ist. Die X-Richtung verläuft parallel zur Richtung des Plattentransports. Der Arm, der eine Rolle transparenten Bandes hält, bewegt sich über den letzten Well in der Reihe hinaus, senkt sich zur Ausübung eines positiven vertikalen (Z-Achse) Drucks ab und beginnt dann, sich wieder in der negativen Y-Richtung zurückzubewegen, während er gleichzeitig die Bandrolle rotiert. Verlässt das Band den Bereich der Platte, so wird es von einem Querschneidemechanismus gekappt. Die Platte bewegt sich dann in X-Richtung über die nächste Reihe und der Dispensionsprozess wird erneut initialisiert. Die automatische Bandumwicklung wird in vielen Industriezweigen betriebssicher durchgeführt.

Das Proteinkristallwachstum in den unterschiedlichen Wells wird mittels eines hochauflösenden optischen Mittels überwacht, welches auf der Basis der wohlbekannten Edge-Analyse das Kristallwachstum automatisch detektiert. Solche Systeme zur Bilderfassung sind im Handel erhältlich.

Die vorangegangenen sowie weitere Aspekte der vorliegenden Erfindung können in Verbindung mit dem nachfolgenden Beispiel besser verstanden werden, welches zum Zweck der Veranschaulichung dargelegt wird und nicht als einschränkend zu verstehen ist.

BEISPIEL 1

Es wurden Nanoliter-Proteintröpfchen zur Dampfdiffusion sowie zum stapelweisen und flüssigen Diffusions-Kristallisations-Screening verwendet. Die Proteinlösungen von entweder Lysozym, Thaumatin oder NAD-Synthetase wurden unter Verwendung einer fünf Mikroliter fassenden Hamilton-Spritze aufgebracht. Um eine vollständige Benetzung der Experimentierkammer mit dem kleinen Tröpfchen sicherzustellen, wurde die Spitze der Hamilton-Spritze mit der Wand einer jeden Experimentierkammer in Kontakt gebracht. Es wurde eine Vielzahl von Mikroarrays konstruiert, um Proteinlösungströpfchen mit Volumina im Bereich von 5 bis 20 Nanolitern und Präzipitatvolumina von 100 bis 200 Nanolitern aufzunehmen. Der Arrayaufbau wurde unter Verwendung von MicroScope-Objektträgern mit einer permanenten Dichtung aus Neoprendichtringen unterschiedlicher Dicke (0,1 mm bis 0,5 mm) durchgeführt. Sobald alle Lösungen in eine einzelne Experimentierkammer innerhalb des Mikroskopobjektträgers eingebracht waren, wurde das Experiment abgedichtet (mit Öl oder Schmiere), indem ein Glasslide zur Abdeckung auf der Oberseite des Dichtringes platziert wurde. 3 stellt eine Fotografie einer typischen Konstruktion für einen Array-Prototypen mit 60 Kammern dar (Dicke der Dichtringe = 0,1 mm) und 4 stellt eine Fotografie von Kristallen dar, welche unter Verwendung eines ähnlichen Mikroarray-Slides zu Proteintröpfchen von 10 Nanolitern gezüchtet worden waren.

Es wurde ein System aus kartesischen Dispensierrobotern verwendet, um Kristallisationslösungen in einem experimentellen 6 × 10 Array zu präparieren. Es wurden fünf Nanoliter Protein plus fünf Nanoliter Präzipitationsmittel in einer Vertiefung der Experimentierkammer (3) in ein vermischtes Tröpfchen gegeben und 50 Nanoliter Präzipitationsmittel plus 50 Nanoliter Puffer wurden in der angeschlossenen Vertiefung in einem Tröpfchen vermischt. Es wurden also für jedes Experiment vier Lösungen zugegeben und 6 × 10 × 4 = 240 insgesamt für den gesamten 6 × 10 Array. Das kartesische Gerät war dazu in der Lage, alle Lösungen innerhalb von weniger als 20 Minuten zu dispensieren. Bei allen angewandten externen Bedingungen handelte es sich um bekannte Kristallisationsbedingungen für die spezifischen getesteten Proteine. Das Experiment wurde manuell versiegelt und bei 22°C für einen Tag inkubiert. In siebzig Prozent der Tröpfchen wurden Kristalle beobachtet. Ohne an eine Theorie gebunden sein zu wollen, wird angenommen, dass die Tatsache, dass in 30% der Wells keine Kristalle beobachtet wurden, auf eine ungenaue Dispension der Protein und Präzipitationsmittel enthaltenden Tropfen der Größe von fünf Nanolitern zurückzuführen ist, da die Piezospitze die Tropfen wohl nicht zusammen positioniert hat.


Anspruch[de]
Verfahren zum Durchmustern von Proteinkristallwachstumsbedingungen in einer Vielzahl von Screeningproben, verwendend Pikogramm-, Nanogramm- oder Mikrogramminengen von Protein, wobei jede dieser Screeningproben ein Volumen von 0,001 nl bis 250 nl einer Proteinlösung aufweist, das Verfahren umfassend die Schritte von:

Dispensieren dieser Screeningproben in eine Vielzahl von Wells oder Mikrokammern eines Mikroarrays;

Kontrollieren der Proteinkristallwachstumsbedingungen von jedem dieser Wells oder Mikrokammern durch Zugabe einer Präzipitatlösung zu dem Mikroarray, der sich in Fluidkommunikation mit dieser Proteinlösung befindet, so dass die Proteinkristallwachstumsbedingungen in mindestens zwei dieser Wells oder Mikrokammern differieren; und

Überwachen der Proteinkristallisation oder Proteinpräzipitation in diesen Wells oder Mikrokammern:

wobei diese Fluidkommunikation durch Flüssigkeits-Flüssigkeits-Diffusion dieser Präzipitatlösung und dieser Proteinlösung erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei diese Proteinlösung eine Komponente ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Puffern, oberflächenaktiven Agenzien, Salzen, Alkoholen, Polyethylenglycol und Mischungen davon umfasst. Verfahren nach Anspruch 1, wobei diese Proteinlösung gepuffert ist. Verfahren nach Anspruch 1, wobei diese Präzipitatlösung und diese Proteinlösung sich in verschiedenen Wells oder Mikrokammern in diesem Mikroarray befinden und dieser Mikroarray Kanäle für die Fluidkommunikation zwischen einem eine Proteinlösung umfassenden Well oder Mikrokammer und einem eine Präzipitatlösung umfassenden Well oder Mikrokammer aufweist. Verfahren nach Anspruch 4, wobei das Kontrollieren des Proteinkristallwachstums weiterhin die Verwendung variierender Dimensionen der Kanäle umfasst. Verfahren nach Anspruch 4, wobei sich diese Präzipitatlösung und diese Proteinlösung in Fluidkommunikation via Mikrokanälen befinden. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Präzipitatlösung ein Volumen von etwa 0,001 nl bis 250 nl aufweist. Verfahren nach Anspruch 1, wobei Proteinkristallisation und Proteinpräzipitation durch Mikroskopie überwacht wird. Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Mikroskopie differentielle Interferenzkontrastmikroskopie ist. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Proteinlösung in diese Wells oder Mikrokammern durch schnelles Solenoid-Dispensieren dispensiert wird. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Mikroarray eine Vielzahl von Wells aufweist, in welche die Proteinlösung dispensiert wird. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Mikroarray eine Vielzahl von Mikrokammern aufweist, in welche die Proteinlösung dispensiert wird. Verfahren nach Anspruch 11, wobei eine Deckplatte auf dem Mikroarray angebracht ist, um die Wells oder Mikrokammern zu konvertieren, und wobei die Deckplatte gegebenenfalls aus Glas oder optisch-durchsichtigem Isolierband ist. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei die Umgebung, die den Mikroarray umgibt, kontrolliert wird, um Verdunstung der Lösungen einzuschränken. Mikroarray (10) zum Durchmustern von Proteinkristallwachstum, in Nanogramm- oder Pikogrammproteinmengen, umfassend eine Vielzahl von Wells oder Mikrokammern, wobei jedes dieser Wells oder Mikrokammern zum Halten von Volumen an Proteinlösung (12) von etwa 0,001 nl bis etwa 250 nl angepasst ist, der Mikroarray weiterhin umfassend eine Vielzahl von Wells oder Mikrokammern zum Halten einer Präzipitatlösung (14) und wobei dieser Mikroarray Kanäle (16) für die Fluidkommunikation durch Flüssigkeits-Flüssigkeits-Diffusion zwischen Proteinlösung haltenden Wells oder Mikrokammern und Präzipitatlösung haltenden Wells oder Mikrokammern aufweist. Mikroarray nach Anspruch 15, wobei diese Wells oder Mikrokammern ein Material umfassen, das geringfügig wasseradsorbierend ist. Mikroarray nach Anspruch 15, weiterhin umfassend einen optisch durchsichtigen Pfad von diesen Wells oder Mikrokammern. Mikroarray nach Anspruch 15, wobei diese Wells oder Mikrokammern ein Material umfassen, das im Wesentlichen hydrophob ist. Mikroarray nach Anspruch 15, wobei mindestens zwei Kanäle unterschiedliche Dimensionen aufweisen. Mikroarray nach Anspruch 15, wobei diese Wells oder Mikrokammern in diesem Mikroarray versiegelt werden können, um Verdunstung aus diesen Wells oder Mikrokammern zu verhindern.






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