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Dokumentenidentifikation DE69737455T2 06.12.2007
EP-Veröffentlichungsnummer 0000939797
Titel DEFINIERTE SYSTEME ZUR KULTIVIERUNG EPITHELIALER ZELLEN UND ANWENDUNG DERSELBEN
Anmelder Invitrogen Corp., Carlsbad, Calif., US
Erfinder JUDD, David A., Williamsville, NY 14221-7166, US;
BATTISTA, Paul J., Eggertsville, NY 14226, US
Vertreter Arth, H., Dipl.-Chem. Dr.rer.nat., Pat.-Anw., 82152 Planegg
DE-Aktenzeichen 69737455
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 09.10.1997
EP-Aktenzeichen 979100443
WO-Anmeldetag 09.10.1997
PCT-Aktenzeichen PCT/US97/18260
WO-Veröffentlichungsnummer 1998016629
WO-Veröffentlichungsdatum 23.04.1998
EP-Offenlegungsdatum 08.09.1999
EP date of grant 07.03.2007
Veröffentlichungstag im Patentblatt 06.12.2007
IPC-Hauptklasse C12N 5/06(2006.01)A, F, I, 20051017, B, H, EP
IPC-Nebenklasse C12N 5/08(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   C12N 5/10(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   

Beschreibung[de]
HINTERGRUND DER ERFINDUNG Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung bezieht sich allgemein auf Zellkulturmedium-Formulierungen. Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung Systeme bereit, die definierte Zellkulturmedium-Formulierungen umfassen und das in vitro-Kultivieren von Epithelzellen, insbesondere von Keratinozyten, ermöglichen. Die vorliegende Erfindung stellt auch Verfahren für das Kultivieren von tierischen Zellen unter Verwendung dieser Systeme bereit.

Stand der Technik Zellkulturmedien

Zellkulturmedien liefern die nötigen Nährstoffe, um Zellen in einer kontrollierten, künstlichen und in vitro-Umgebung bestehen und wachsen zu lassen. Die Eigenschaften und Zusammensetzungen der Zellkulturmedien variieren in Abhängigkeit der besonderen Anforderungen der Zellen. Wichtige Parameter schließen Osmolarität, pH-Wert und Nährstoff-Formulierungen ein.

Medien-Formulierungen wurden für das Kultivieren einer Anzahl von Zellarten, einschließlich tierischer, pflanzlicher und bakterieller Zellen, verwendet. In Kulturmedien kultivierte Zellen bauen verfügbare Nährstoffe ab und stellen nützliche biologische Stoffe wie monoklonale Antikörper, Hormone, Wachstumsfaktoren und dergleichen her. Solche Produkte sind therapeutisch anwendbar und mit Hilfe der entstehenden rekombinanten DNA-Technologie können Zellen gentechnisch so modifiziert werden, dass sie große Mengen dieser Produkte herzustellen. Somit ist die Fähigkeit zur in vitro-Kultivierung von Zellen nicht nur für Studien der Zellphysiologie von Bedeutung, sondern auch für die Herstellung von zweckmäßigen Stoffen, die ansonsten nicht mit kostengünstigen Mitteln erhalten werden können, von Nöten.

Zellkulturmedien-Formulierungen sind in der Literatur gut dokumentiert und eine Anzahl von Medien ist im Handel erhältlich. In frühen Arbeiten über Zellkulturen basierten Medien-Formulierungen auf den chemischen Zusammensetzungen und physiochemischen Eigenschaften von Blut (z.B. Osmolarität, pH-Wert, etc.) und wurden als „physiologische Lösungen" bezeichnet (Ringer, S., J. Physiol. 3:380–393 (1880); Waymouth, C., In: Cells and Tissues in Culture, Vol. 1, Academic Press, London, Seiten 99–142 (1965); Waymouth, C., In vitro 6:109–127 (1970)). Allerdings sind die Zellen in unterschiedlichen Geweben des Körpers von Säugetieren unterschiedlichen Mikroumgebungen bezüglich des Sauerstoff/Kohlendioxid-Partialdruckes und Konzentrationen an Nährstoffen, Vitaminen und Spurenelementen ausgesetzt; dementsprechend erfordert eine erfolgreiche in vitro-Kultur unterschiedlicher Zellarten oftmals die Verwendung unterschiedlicher Medien-Formulierungen. Übliche Komponenten von Zellkulturmedien schließen Aminosäuren, organische und anorganische Salze, Vitamine, Spurenmetalle, Zucker, Lipide und Nukleinsäuren ein, wobei die Arten und Mengen derselben in Abhängigkeit der besonderen Anforderungen einer bestimmten Zell- oder Gewebeart variieren.

Üblicherweise werden Zellkulturmedien-Formulierungen mit einer Reihe von Additiven ergänzt, einschließlich undefinierter Komponenten wie Fötales Rinderserum (FBS) (10–20% v/v) oder Extrakten aus tierischen Embryonen, Organen oder Drüsen (0,5–10% v/v). Obgleich FBS die am häufigsten angewandte Ergänzung in tierische Zellkulturmedien ist, werden üblicherweise auch andere Serumquellen verwendet, einschließlich neugeborener Kälber, Pferde und Menschen. Für die Herstellung von Extrakten für die Ergänzung von Kulturmedien verwendete Organe oder Drüsen schließen Unterkieferdrüse (Cohen, S., J. Biol. Chem. 237:1555–1565 (1961)), Hypophyse (Peehl, D.M., und Ham, R.G., In vitro 16:516–525 (1980); US-Patent Nr. 4673649), Hypothalamus (Maciag, T., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:56745678 (1979); Gilchrest, B.A., et al., J. Cell. Physiol.120:377–383 (1984)), Retina (Barretault, D., et al., Differentiation 18:29–42 (1981)) und Gehirn (Maciag, T., et al., Science 211:1452–1454 (1981)) ein. Diese Arten chemischer, undefinierter Ergänzungen dienen in Zellkulturmedien mehreren zweckmäßigen Funktionen (Lambert, K.J. et al., In: Animal Cell Biotechnology, Vol. 1, Spier, R.E. et al., Eds., Academic Press New York, Seite 85–122 (1985)). Beispielsweise liefern diese Ergänzungen Trägermittel oder Chelatoren für labile oder wasser-unlösliche Nährstoffe, sie binden und neutralisieren toxische Teile; sie liefern Hormone und Wachstumsfaktoren, Proteaseinhibitoren und essentielle, oft unidentifizierte oder undefinierte Nährstoffe mit niedrigem Molekulargewicht; und sie schützen die Zellen vor physikalischem Stress und physikalischer Beschädigung. Somit werden Serum oder Organ/Drüsen-Extrakt üblicherweise als relativ kostengünstige Ergänzungen für das Bereitstellen eines optimalen Kulturmediums für das Kultivieren von tierischen Zellen verwendet.

Unglücklicherweise hat die Verwendung von Serum oder Organ/Drüsen-Extrakten in Gewebekultur-Anwendungen mehrere Nachteile (Lambert, K.J. et al., In: Animal Cell Biotechnology, Vol 1, Spier, R.E. et al., Eds., Academic Pres New York, Seite 85–122 (1985)). Beispielsweise kann die chemische Zusammensetzung dieser Ergänzungen sogar bei einem einzigen Hersteller zwischen den einzelnen Posten variieren. Die Ergänzungen können auch mit infektiösen Wirkstoffen (z.B. Mykoplasma und Viren) kontaminiert sein, die die Gesundheit der kultivierten Zellen ernsthaft gefährden können, wenn diese kontaminierten Ergänzungen in Zellkulturmedien-Formulierungen verwendet werden. Die Zelloberflächenchemie, die für manche Zellarten ein entscheidender Bereich der in vitro-Mikroumgebung ist, kann durch Adsorption oder Inkorporation von Serum oder Extraktproteinen nachteilig verändert werden. Die Verwendung undefinierter Komponenten wie Serum oder Tierextrakten verhindert auch die Feststellung und Aufklärung der eigentlichen Nährstoff- und Hormonanforderungen der kultivierten Zellen und eliminieren somit die Möglichkeit, in einer kontrollierten Art und Weise die Wirkung spezifischer Wachstumsfaktoren oder Nährstoffe auf das Zellwachstum und die Differenzierung in Kultur zu untersuchen. Darüber hinaus hindern undefinierte Ergänzungen den Forscher daran, anormales Wachstum und anormale Differenzierung und die krankheitsbedingten Veränderungen in kultivierten Zellen zu untersuchen. Für die Verwendung von Zellkulturmedien in der industriellen Herstellung von biologischen Stoffen ist schlussendlich am wichtigsten, dass die Ergänzung von Kulturmedien durch Serum und Organ/Drüsen-Extrakt aufgrund unspezifischer Reinigung von Serum oder Extraktproteinen die Reinigung der gewünschten Stoffe der Kulturmedien komplizieren und die Kosten derselben erhöhen. Eine Anzahl von Kulturmedien wird in Pittelkow et al., J. Cell. Physiol. Vol 140, Nr. 3, Seite 565–576 und Yang et al., Endocrinology, Vol. 107, Nr. 1, Seite 35–41 beschrieben.

Definierte Medien

Um diese Nachteile der Verwendung von Serum oder Organ/Drüsen-Extrakten zu überwinden, wurde eine Anzahl sogenannter „definierter" Medien entwickelt. Diese oftmals für die Unterstützung der Kultur einer einzigen Zellart spezifisch formulierten Medien enthalten anstelle undefinierter Ergänzungen inkorporierte definierte Mengen gereinigter Wachstumsfaktoren, Proteine, Lipoproteine und weiterer Stoffe, die normalerweise die Serum- oder Extrakt-Ergänzung bereitstellt. Da die Komponenten (und Konzentrationen derselben) in solchen Kulturmedien genau bekannt sind, werden diese Medien normalerweise als „definierte Kulturmedien" bezeichnet. Die Begriffe „serumfreie Medien" oder „SFM" werden oftmals als Synonym für „definierte Kulturmedien" verwendet. Im Handel ist eine Anzahl von SFM-Formulierungen erhältlich, wie jene, die für das Unterstützen von Endothelialzellen-, Keratinozyten-, Monozyten-/Makrophagen-, Fibroblasten-, Chondrozyten- oder Hepatozytenkulturen konzipiert und bei GIBCO/LTI (Gaithersburg, Maryland) erhältlich sind. Allerdings besteht der Unterschied zwischen SFM und definierten Medien darin, dass SFM Medien ohne Serum, aber nicht zwingend ohne weitere undefinierte Komponenten wie Organ/Drüsen-Extrakte sind. Es wurde hingegen von mehreren SFM berichtet oder diese sind im Handel erhältlich, die solche undefinierte Komponenten enthalten, einschließlich mehrerer Formulierungen, die in vitro-Kulturen von Keratinozyten unterstützen (Boyce, S.T., und Ham, R.G., J. Invest. Dermatol. 81:33 (1983); Wille, J.J., et al., J Cell. Physiol. 121:31 (1984); Pittelkow, M.R., und Scott, R.E., Mayo Clin. Proc. 61:771 (1986); Pirisi, L., et al., J. Virol. 61:1061 (1987); Shipley, G.D., und Pittelkow, M.R., Arch. Dermatol. 123:1541 (1987); Shipley, G.D., et al., J. Cell. Physiol. 138:511–518 (1989); Daley, J.P., et al., FOCUS(GIBCO/LTI) 12:68 (1990); US-Patent Nr. 4,673,649 und 4,940,666). Laut der eigentlichen Begriffsdefinition können SFM somit nicht als definierte Medien angesehen werden.

Definierte Medien stellen dem Verwender im Allgemeinen mehrere unterschiedliche Vorteile bereit. Beispielsweise ermöglicht die Verwendung definierter Medien die Erforschung der Wirkung eines spezifischen Wachstumsfaktors oder weiteren Mediumkomponente auf die zelluläre Physiologie, die bei Kultivierung der Zellen in Serum oder Extrakt enthaltenden Medien verdeckt sein kann. Zusätzlich enthalten definierte Medien üblicherweise geringere Proteinmengen (definierte Medien werden deswegen oftmals als „proteinarme Medien" bezeichnet) als Serum oder Extrakt enthaltende Medien, wodurch die Reinigung von biologischen, in definierten Medien kultivierten Zellen hergestellten Stoffen wesentlich einfacher und kostengünstiger wird.

Einige extrem einfach definierte Medien, die im Wesentlichen aus Vitaminen, Aminosäuren, organischen und anorganischen Salzen und Puffern bestehen, wurden für die Zellkultur verwendet. Solchen Medien (oftmals als „Basalmedien" bezeichnet) fehlt es allerdings normalerweise stark an dem von den meisten tierischen Zellen benötigten Nährstoffgehalt. Dementsprechend inkorporieren die meisten definierten Medien zusätzliche Komponente in die Basalmedien, um die Medien bezüglich der Nährstoffe komplexer zu gestalten, jedoch den serumfreien und proteinarmen Inhalt der Medien zu erhalten. Beispiele solcher Komponenten schließen das Rinderserumalbumin (BSA) oder das Humane Serumalbumin (HSA); gewisse, aus natürlichen (Tier) oder rekombinanten Quellen wie EGF oder FGF gewonnene Wachstumsfaktoren; Lipide wie Fettsäuren, Sterole und Phospholipide; Lipidderivate und -komplexe wie Phosphoethanolamin, Ethanolamin und Lipoproteine; Protein- und Steroidhormone wie Insulin, Hydrocortison und Progesteron; Nukleotid-Prekursoren und gewisse Spurenelemente ein (vgl. Waymouth, C., in: Cell Culture Methods for Molecular and Cell Biology, Vol. 1: Methods for Preparation of Media, Supplements, and Substrata for Serum-Free Animal Cell Culture, Barnes, D.W., et al., eds., New York: Alan R. Liss, Inc., Seite 23–68 (1984), und Gospodarowicz, D., Id., Seite 69–86 (1984)).

Epithelzellen Übersicht

Das Epithel bedeckt die inneren und äußeren Organ- und Drüsenoberflächen höher entwickelter Organismen. Aufgrund dessen, dass es an der äußeren Schnittstelle zwischen der Umgebung und dem Organismus (z.B. der Haut) oder an der inneren Schnittstelle zwischen einem Organ und dem Zwischenraum (z.B. der Darmschleimhaut) zu finden ist, spielt das Epithel bei der Erhaltung der Homöostase eine wichtige Rolle. Das Epithel erfüllt diese Aufgabe beispielsweise durch die Regulierung von Transport und Permeabilität von Nähr- und Abfallstoffen (Freshney, R.I., in: Culture of Epithelial Cells, Freshney, R.I., ed., New York: Wiley-Liss, Seiten 1–23 (1992)).

Die Zellen, die das Epithel bilden, werden normalerweise als Epithelzellen bezeichnet. Diese Zellen können in Form einer Schicht wie in der Haut oder in Form mehrerer Schichten wie in den Lungenbläschen vorliegen. Erwartungsgemäß sind die Struktur, die Funktion und die Physiologie von Epithelzellen oftmals gewebespezifisch. Beispielsweise sind die epidermalen Epithelzellen der Haut als mehrschichtiges Plattenepithel aufgebaut und dienen in erster Linie der Bildung einer Schutzbarriere für den Organismus, während die sekretorischen Epithelzellen einiger Drüsen oftmals in einzelnen Schichten kubischer Zellen vorhanden sind, die bei der Herstellung von sekretorischen Proteinen und Glycoproteinen eine wichtige Rolle spielen. Üblicherweise sind Epithelzellen unabhängig von ihrer Position oder Funktion allerdings regenerativ. Das bedeutet, dass Epithelzellen unter normalen Bedingungen oder infolge einer Beschädigung oder weiterer aktivierender Stimuli die Fähigkeit haben, sich zu teilen oder zu wachsen. Diese regenerative Fähigkeit hat den Umgang mit Epithelzellen in vitro in einem solchen Maße erleichtert, dass eine Vielfalt primärer Epithelzellen und Zelllinien erfolgreich in vitro kultiviert wurde (Freshney, Id.).

Keratinozyten

Die spezialisierten, in der Hautepidermis vorhandenen Epithelzellen sind als Keratinozyten bekannt. In den oberen, verhornten Schichten der Haut (die der Umwelt ausgesetzt sind) wird das Cytoplasma der Keratinozyten vollständig durch Keratin ersetzt, und die Zellen sterben. Die in den unteren Schichten, insbesondere in der basalen Epidermis (Stratum basale), vorhandenen Keratinozyten allerdings teilen sich aktiv und migrieren schließlich durch die oberflächennäheren Schichten aufwärts, um jene Zellen, die sich an der externen Oberfläche ablösen, zu ersetzen.

Dementsprechend kann die Haut als dynamisches Organ angesehen werden, das Keratinozyten umfasst, die sich ständig teilen, reifen und schließlich sterben.

Kulturen menschlicher Keratinozyten werden vermehrt für Untersuchungen der Hautstruktur und Hautkrankheiten und als in vitro-Modelle für menschliche Haut in toxikologischen Studien verwendet (Boyce, S.T., und Ham, R.G., in: In vitro-Models for Cancer Research, vol. III, Webber, M.M., et al., eds., Boca Raton, FL: CRC Press, Inc., Seiten 245–274 (1985)). Erfolgreiche Keratinozytenkulturen haben allerdings bewiesen, dass dies in erster Linie schwierig ist, weil ihre hohen Nährstoffanforderungen erfüllt werden müssen (Gilchrest, B.A., et al., J Cell. Physiol. 120:377–383 (1984)). Beispielsweise wurden in den meisten frühen Studien, die herkömmliche, mit Serum ergänzte Kulturmedien verwendeten, die Keratinozyten aus Hautexplanaten rasch von leichter kultivierbaren und schneller wachsenden, ebenfalls in dem Gewebe vorhandenen Fibroblasten überwachsen (Freshney, Id.). Somit wurde beim Versuch, Kulturmedien zu formulieren, die die Selektion und das erfolgreiche in vitro-Kultivieren menschlicher Keratinozyten begünstigen, beachtliche Arbeit geleistet.

Systeme und Formulierungen von Keratinozyten-Kulturmedium

Für das Kultivieren menschlicher Keratinozyten wurde eine Vielfalt an Systemen entwickelt. Frühe Arbeiten auf diesem Gebiet verwendeten spezialisierte Kulturmedien wie das Medium 199 (Marcelo, C.L., et al., J. Cell Biol. 79:356 (1978)) und NCTC 168 (Price, F.M., et al., In vitro-16:147(1980)) mit Serumergänzung. Alternativ hat sich gezeigt, dass durch Ausplattieren von letal bestrahlten 3T3-Fibroblasten mit Zellen und durch Hinzufügen von Epidermalem Wachstumsfaktor (EGF) und Hydrocortison zu dem Medium das Keratinozytenwachstum und die Koloniebildung verbessert werden (Rheinwald, J.G., und Green, H., Cell 6:331 (1975)). Eine der ersten serumfreien für Keratinozytenkulturen verwendeten Medium-Formulierungen basierte auf Medium 199 und schloss einen Cocktail von Wachstumsfaktoren ein, der Rindergehirnextrakt umfasste (Gilchrest, B.A., et al., J. Cell. Physiol. 112:197 (1982)), und serumfreie Kulturen menschlicher Keratinozyten ohne Verwendung von 3T3 Fibroblasten-Feeder-Schichten (fibroblast feeder layers) wurden nach der Entwicklung eines spezialisierteren Basalmediums MCDB-153 weitgehend angenommen (Boyce, S.T., and Ham, R.G., J. Invest. Dermatol. 81:33 (1983); US-Patent Nr. 4,673,649 und 4,940,666). Serumfreies MCDB-153 schließt Spurenelemente, Ethanolamin, Phospoethanolamin, Hydrocortison, EGF und Rinderhypophysenextrakt (BPE) ein. Dieses Medium und mehrere verbesserte Versionen wurden weitgehend für das Kultivieren menschlicher Keratinozyten verwendet (Pittelkow, M.R:, und Scott, R.E., Mayo Clin. Proc. 61:771 (1986); Pirisi, L., et al., J. Virol.61:1061(1987); Shipley, G.D., und Pittelkow, M.R., Arch. Dermatol.123:1541 (1987); Daley, J.P., et al., FOCUS (GIBCO/LTI) 12:68 (1990)). Die Verwendung von BPE ist auch vielen im Handel erhältlichen Medien für das Kultivieren von Keratinozyten gemein, einschließlich KGM (Clonetics Corporation, San Diego, California), CS-2.0 Keratinozytenzellwachstums-Medium (Cell Systems, Inc.; Kirkland, Washington), M154 (Cascade Biologicals, Inc.; Portland, Oregon) und Keratinozyten-SFM (GIBCO/LTI; Gaithersburg, Maryland).

Allerdings hat serumfreies, BPE enthaltendes Medium als primäres Mitogen wie oben allgemein beschrieben mehrere Nachteile. Beispielsweise kompliziert die undefinierte BPE-Zusammensetzung experimentelle Modelle und Ergebnisinterpretationen und kann, abhängig von den Konzentrationen weiterer Bestandteile in dem Medium, das Wachstum oder die Differenzierung von Keratinozytenkulturen entweder stimulieren oder hemmen (Wille, J.J., et al., J. Cell. Physiol. 121:31 (1984)). Zusätzlich erfordert BPE in unterschiedlichen Zellsystemen Titration und seine Stabilität im Medium ist unter normalen Verwendungs- und Lagerbedingungen auf ungefähr vier Wochen beschränkt. Zumindest ein Bericht behandelte ein vollständig definiertes Medium für die Kultur von Epidermalzellen, wobei BPE durch den Epidermalen Wachstumsfaktor (EGF), den insulinähnlichen Wachstumsfaktor 1 (IGF-1) und erhöhte Mengen sechs spezieller Aminosäuren ersetzt wurde (US-Patent Nr. 5,292,655). Allerdings wurde dieses Medium für den speziellen Zweck einer in vitro-Herstellung eines Hautersatzes ausgestaltet, das differenzierte Keratinozyten umfasst und kann für das Unterstützen kontinuierlicher Kulturen von aktiv wachsenden Zellen nicht ideal sein.

Somit besteht auch weiterhin für das Kultivieren von tierischen Epithelzellen einschließlich Keratinozyten ein Bedarf an definierten Kulturmedien, die frei von Serum und Organ-/Drüsen-Extrakt sind. Solche Kulturmedien ermöglichen Studien über die Wirkung von Wachstumsfaktoren und anderer Stimuli auf die Zellphysiologie, ermöglichen einfachere und kostengünstigere Reinigung von biologischen, von kultivierten tierischen Zellen in der Biotechnologieindustrie hergestellten Stoffen und liefern bei Verfahren, die das Kultivieren von tierischen Epithelzellen verwenden, einheitlichere Ergebnisse. Die vorliegende Erfindung stellt solche definierte Medien bereit.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung stellt definierte Kulturmedien bereit, die BPE durch wachstumsfördernde Additive wie Insulin, EGF und weitere Additive ersetzen. In einer bevorzugten Ausführungsform stellt die Erfindung ein serumfreies Zellkulturmedium, das Heparin, Epidermalen Wachstumsfaktor (EGF), einen Fibroblasten Wachstumsfaktor (FGF) und einen Wirkstoff umfasst, der intrazelluläre Niveaus von zyklischem Adenosinmonophosphat (CAMP) erhöht, wobei der Wirkstoff aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einem &bgr;-Adrenorezeptoragonisten, Choleratoxin, Forskolin, Dibutyryl-cAMP, Isobutylmethylxanthin und Theophyllin besteht, bereit. In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung ein Zellkulturmedium bereit, das das in vitro-Kultivieren einer Tierepithelzelle unterstützen kann und Insulin, Heparin, EGF und zumindest zwei zusätzliche Additive aus der Gruppe bestehend aus FGF, einem Wirkstoff, der intrazelluläre Niveaus von zyklischem Adenosinmonophosphat (cAMP) erhöht, und Ascorbinsäure umfasst. Das von der vorliegenden Erfindung bereitgestellte Medium kann in einer 1X Formulierung oder in einer 10X oder einer höheren Formulierung konzentriert sein. Das Basalmedium der vorliegenden Erfindung umfasst eine Anzahl von Bestandteilen, einschließlich Aminosäuren, Vitaminen, organischen und anorganischen Säuren, Zuckern und weiteren Komponenten, wobei jeder Bestandteil in einer Menge vorhanden ist, die das in vitro-Kultivieren einer Tierepithelzelle unterstützt. Das Medium kann für das Kultivieren einer Vielfalt von tierischen Epithelzellen, einschließlich Primärzellen (z.B. Keratinozyten oder zervikalen Epithelzellen) und etablierten Zelllinien (z.B. HeLa-Zellen), verwendet werden. Durch das Medium der vorliegenden Erfindung unterstütze Zellen können aus jedem beliebigen Lebewesen, bevorzugt einem Säugetier und noch bevorzugter einem Menschen gewonnen werden. Die vorliegende Erfindung stellt auch Verfahren für das Kultivieren von tierischen Epithelzellen unter Verwendung der hierin offenbarten Kulturmedium-Formulierungen bereit, die die Schritte des (a) In-Kontakt-Bringens einer tierischen Zelle mit dem Zellkulturmedium gemäß der vorliegenden Erfindung; und des (b) Kultivierens der tierischen Zelle unter Bedingungen, die geeignet sind, die Kultivierung der Zelle in vitro zu unterstützen, umfassen. Die Erfindung stellt auch Kits für die Verwendung beim Kultivieren einer Tierepithelzelle bereit. Kits gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen ein Trägermittel, in dem fest eingeschlossen ein oder mehrere Behälter vorhanden ist/sind, wobei ein erster Behälter wie oben beschrieben ein basales Kulturmedium enthält, ein zweiter Behälter ein Insulin, ein dritter Behälter EGF, ein vierter Behälter FGF, ein fünfter Behälter zumindest einen Wirkstoff, der die intrazellulären Niveaus von cAMP erhöht, ein sechster Behälter Heparin und ein siebter Behälter Ascorbinsäure enthält. In einer bevorzugten Ausführungsform enthält der zweite Behälter der Kits Insulin, EGF, FGF, zumindest einen die intrazellulären Niveaus von cAMP erhöhenden Wirkstoff, Heparin und Ascorbinsäure gemeinsam in einer Mischung. Die Erfindung stellt ferner Zellkulturzusammensetzungen bereit, die die Kulturmedien der vorliegenden Erfindung und eine Tierepithelzelle umfassen. Die Erfindung stellt auch Zusammensetzungen bereit, die Heparin, EGF, FGF, zumindest einen die intrazellulären Niveaus von cAMP erhöhenden Wirkstoff und optional Ascorbinsäure umfasst, wobei die Zusammensetzungen für das Ersetzen von Organ- oder Drüsenextrakt in serumfreien tierischen Zellkulturmedien verwendet werden können. Die Kulturmedien der vorliegenden Erfindung sind für die Verwendung sowohl in der Isolierung und Initiierung von primären Epithelzellkulturen als auch in der Expansion von etablierten Epithelzellkulturen geeignet. Zusätzlich liefern die Medien der vorliegenden Erfindung besseres Wachstum und besseren Erhalt von morphologischen und physiologischen Kennzeichen primärer tierischer Epithelzellen.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

1. Mikroaufnahme einer Phasenkontrastmikroskopie menschlicher Keratinozyten. In dem definierten Keratinozyten-SFM gemäß der vorliegenden Erfindung (

) oder in einem BPE enthaltenden Keratinozyten-SFM (
) wurden Zellen kultiviert. Die Fotografien sind 100fach vergrößert.

2. Mikroaufnahme einer Fluoreszenzmikroskopie menschlicher Keratinozyten, die in dem definierten Keratinozyten-SFM der vorliegenden Erfindung kultiviert und mit gegen Keratin 14 gerichteten fluoreszenten Antikörpern gefärbt wurden.

3. Balkendiagramm, das das Wachstum primärer menschlicher Keratinozyten in dem definierten Keratinozyten-SFM der vorliegenden Erfindung („Definiertes Keratinozyten-SFM"), in einem BPE enthaltenden Keratinozyten-SFM („Keratinozyten-SFM") oder in einem von Hyclone Laboratories (Logan, Utah) erhaltenen Keratinozyten-SFM („Zulieferer A") veranschaulicht. Sechs Tage nach dem Aussäen wurde das Wachstum bestimmt und die Werte ergaben Mittelwerte von ± SEM, wobei n = 7.

4. Balkendiagramm, das das Wachstum sekundärer menschlicher Keratinozyten in dem definierten Keratinozyten-SFM der vorliegenden Erfindung („definiertes Keratinozyten-SFM"), in einem BPE enthaltenden Keratinozyten-SFM („Keratinozyten-SFM") oder in einem von Hyclone Laboratories (Logan, Utah) erhaltenen Keratinozyten-SFM („Zulieferer A") veranschaulicht. 72 Tage nach dem Aussäen wurde das Wachstum bestimmt und die Werte ergaben von Mittelwerte ± SEM, wobei n = 7.

5. Balkendiagramm, das eine wachstumskinetische Analyse menschlicher Keratinozyten veranschaulicht. In dem definierten Keratinozyten-SFM der vorliegenden Erfindung

oder in einem BPE enthaltenden Keratinozyten-SFM (☐) wurden Zellen kultiviert. Die Werte ergeben Mittel von ± SD, wobei n = 2.

6. Liniendiagramm, das eine Untersuchung der mittleren Lagerfähigkeit der primäre menschliche Keratinozyten verwendenden Medien veranschaulicht. In dem definierten Keratinozyten-SFM der vorliegenden Erfindung (durchgezogene Linie) oder in einem BPE enthaltenden Keratinozyten-SFM (gestrichelte Linie) wurden über einen 15-wöchigen Zeitraum Zellen kultiviert. Die Zellen wurden nach 6 Tagen in Medium, das über einen vorgegebenen Zeitraum hinweg gelagert worden war, gezählt und mit den in frischem Medium kultivierten Kontrollzellen verglichen.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG Definitionen

In der nachfolgenden Beschreibung wird eine Anzahl üblicherweise auf dem Gebiet der Zellkulturmedien eingesetzter Begriffe verwendet. Die folgenden Definitionen dienen dazu, ein eindeutiges und einheitliches Verständnis der Beschreibung und der Ansprüche und des Umfanges solcher Begriffe zu liefern.

Der Begriff „Bestandteil" bezieht sich auf jede beliebige Verbindung, ob chemischen oder biologischen Ursprungs, die in Zellkulturmedien für den Erhalt oder die Förderung des Zellwachstums oder der Zellproliferation verwendbar sind. Die Begriffe „Komponente", „Nährstoff" und „Bestandteil" sind jeweils Synonyme und beziehen sich allesamt auf solche Verbindungen. Übliche in Zellkulturmedien verwendete Bestandteile schließen Aminosäuren, Salze, Metalle, Zucker, Lipide, Nukleinsäuren, Hormone, Vitamine, Fettsäuren, Proteine und dergleichen ein. Weitere Bestandteile, die das ex vivo Kultivieren von Zellen fördern oder erhalten, können von Fachleuten gemäß dem speziellen Bedarf ausgewählt werden.

Unter „Zellkultur" oder „Kultur" ist der Erhalt von Zellen in einer künstlichen in vitro-Umgebung zu verstehen. Allerdings handelt es sich bei dem Begriff „Zellkultur" selbstredend um einen allgemeinen Begriff, der nicht nur verwendet werden kann, um das Kultivieren einzelner Zellen, sondern auch das Kultivieren von Geweben, Organen, Organsystemen oder ganzen Organismen einzufassen, wobei die Begriffe „Gewebekultur", „Organkultur", „Organsystemkultur" oder „organotypische Kultur" gegebenenfalls als Synonyme für den Begriff „Zellkultur" verwendet werden können.

Unter „Kultivieren" ist der Erhalt von Zellen unter in vitro-Bedingungen, die Wachstum, Differenzierung oder kontinuierliche Zellviabilität in einem aktiven oder passiven Stadium begünstigen, zu verstehen. In diesem Sinne kann „Kultivieren" als Synonym für „Zellkultur" oder für jedes beliebige der oben beschriebenen Synonyme verwendet werden.

Unter „Kulturgefäß" versteht man einen Glas-, Plastik- oder Metallbehälter, der eine aseptische Umgebung für das Kultivieren von Zellen bereitstellt.

Die Ausdrücke „Zellkulturmedium", „Kulturmedium" (in jedem Fall ist der Plural „Medien") und „Mediumformulierung" beziehen sich auf eine Nährstofflösung für das Kultivieren von Zellen und können als Synonyme verwendet werden.

Der Begriff „In-Kontakt-Bringen" bezieht sich darauf, dass in vitro zu kultivierende Zellen in ein Kulturgefäß mit dem Medium, in dem die Zellen kultiviert werden sollen, gegeben werden. Der Begriff „In-Kontakt-Bringen" fasst ein, dass Zellen mit Medium vermischt werden, dass Medium auf Zellen in einem Kulturgefäß pipettiert wird und dass Zellen in Kulturmedium eingetaucht werden.

Der Begriff „Kombinieren" bezieht sich auf das Mischen oder Beimischen von Bestandteilen in einer Zellkulturmedium-Formulierung.

Ein Zellkulturmedium setzt sich aus einer Anzahl von Bestandteilen zusammen und diese Bestandteile variieren von einem Kulturmedium zum anderen. Unter „1X-Formulierung" ist jegliche wässrige Lösung zu verstehen, die mehrere oder alle Bestandteile, die in Wirkungskonzentrationen in einem Zellkulturmedium vorhanden sind, enthält. Die „1X-Formulierung" kann beispielsweise das Zellkulturmedium oder jegliche Untergruppe von Bestandteilen für dieses Medium bezeichnen. Die Konzentration eines Bestandteils in einer 1X-Lösung ist in etwa gleich wie die Konzentration von dem Bestandteil, der in einer für den Erhalt oder das in vitro-Kultivieren verwendeten Zellkultur-Formulierung vorhanden ist. Ein für das in vitro-Kultivieren verwendetes Zellkulturmedium ist definitionsgemäß eine 1X-Formulierung. Bei Vorhandensein einer Anzahl von Bestandteilen weist jeder Bestandteil in einer 1X-Formulierung eine Konzentration auf, die ungefähr der Konzentration der Bestandteile in einem Zellkulturmedium entspricht. Beispielsweise enthält RPMI-1640 Kulturmedium neben anderen Bestandteilen 0,2 g/L L-Arginin, 0,05 g/L L-Asparagin und 0,02 g/L L-Asparaginsäure. Eine „1X-Formulierung" dieser Aminosäuren enthält in etwa dieselben Konzentrationen dieser Bestandteile in Lösung. Somit soll die Bezugnahme auf eine „1X-Formulierung" so verstanden werden, dass jeder Bestandteil in Lösung in derselben oder in etwa derselben Konzentration wie in dem beschriebenen Zellkulturmedium vorhanden ist. Die Konzentrationen von Bestandteilen in einer „1X-Formulierung" des Zellkulturmediums sind Fachleuten gut bekannt. Siehe „Methods For Preparation of Media, Supplements and Substrate For Serum-Free Animal Cell Culture" von Allen R. Liss, N.Y. (1984), durch Bezugnahme hierin in vollem Umfang eingegliedert. Allerdings können/kann die Osmolarität und/oder der pH-Wert in einer 1X-Formulierung im Vergleich zu dem Kulturmedium unterschiedlich sein, insbesondere wenn in der 1X-Formulierung weniger Bestandteile vorhanden sind.

Unter „10X-Formulierung" ist eine Lösung zu verstehen, in der jeder Bestandteil in dieser Lösung in etwa 10mal so hoch konzentriert ist wie derselbe Bestandteil in dem Zellkulturmedium. Beispielsweise enthält die 10X-Formulierung von RPMI-1640 Kulturmedium neben anderen Bestandteilen 2,0 g/L L-Arginin, 0,5 g/L L-Asparagin und 0,2 g/L L-Asparaginsäure (vgl. 1X-Formulierung oben). Eine „10X-Formulierung" kann eine Anzahl zusätzlicher Bestandteile in einer etwa 10mal höheren Konzentration als in dem 1X-Kulturmedium enthalten. Es ist leicht ersichtlich, dass „25X-Formulierung", „50X-Formulierung", „100X-Formulierung", „500X-Formulierung" und „1000X-Formulierung" Lösungen bezeichnen, die Bestandteile in jeweils etwa 25-, 50-, 100-, 500- oder 1000-facher Konzentration der Konzentration eines 1X-Zellkulturmediums enthalten. Es wird noch einmal erwähnt, dass die Osmolarität und der pH-Wert der Medium-Formulierung und der konzentrierten Lösung variieren können.

Formulierung von Kulturmedien Basalmedien

Die Zellkulturmedien der vorliegenden Erfindung basieren auf Wasser und umfassen für die Bildung von „Basalmedien" eine Anzahl von Bestandteilen in einer Lösung von entionisiertem, destilliertem Wasser. Bestandteile, die die Basalmedien der vorliegenden Erfindung einschließen können, sind Aminosäuren, Vitamine, anorganische Salze, Adenin, Ethanolamin, D-Glucose, Heparin, N-[2-Hydroxyethyl]-piperazin-N'-[2-ethansulfonsäure] (HEPES), Hydrocortison, Insulin, Liponsäure, Phenolrot, Phosphoethanolamin, Putrescin, Natriumpyruvat, Triiodothyronin (T3), Thymidin und Transferrin, Alternativ können Insulin und Transferrin durch Eisenzitrat oder Eisensulfatchelate ersetzt werden. Jeder dieser Bestandteile ist beispielsweise von Sigma (Saint Louis, Missouri) im Handel erhältlich.

Aminosäure-Bestandteile, die in den Medien der vorliegenden Erfindung eingeschlossen sein können, schließen L-Alanin, L-Arginin, L-Asparagin, L-Asparaginsäure, L-Cystein, L-Glutaminsäure, L-Glutamin, Glycin, L-Histidin, L-Isoleucin, L-Leucin, L-Lysin, L-Methionin, L-Phenylalanin, L-Prolin, L-Serin, L-Threonin, L-Tryptophan, L-Tyrosin und L-Valin ein. Diese Aminosäuren sind beispielsweise von Sigma (Saint Louis, Missouri) im Handel erhältlich.

Vitamin-Bestandteile, die in den Medien der vorliegenden Erfindung eingeschlossen sein können, schließen Biotin, Cholinchlorid, D-Ca2+-Pantothenat, Folsäure, i-Inositol, Niacinamid, Pyridoxin, Riboflavin, Thiamin und Vitamin B12 ein. Diese Vitamine sind beispielsweise von Sigma (Saint Louis, Missouri) im Handel erhältlich.

Anorganische Salz-Bestandteile, die in den Medien der vorliegenden Erfindung eingeschlossen sein können, schließen ein Calciumsalz (z.B. CaCl2), CuSO4, FeSO4, KCl, ein Magnesiumsalz (z.B. MgCl2), ein Mangansalz (MnCl2), Natriumacetat, NaCl, NaHCO3, Na2HPO4, Na2SO4 und Ionen der Spurenelemente Selen, Silizium Molybdän, Vanadium, Nickel, Zinn und Zink ein. Diese Spurenelemente werden in einer Vielfalt an Formen, bevorzugt in der Form von Salzen wie Na2SeO3, NA2SiO3, (NH4)6Mo7O24, NH4VO3, NiSO4, SnCl2 und ZnSO4 bereit gestellt. Diese anorganischen Salze und Spurenelemente sind beispielsweise von Sigma (Saint Louis, Missouri) im Handel erhältlich.

Tabelle 1 zeigt die spezielle Kombination der obigen Bestandteile, ihre Konzentrationsbereiche und die bevorzugten Konzentrationen in den Basalmedien.

TABELLE 1. KOMPONENTENKONZENTRATIONEN IN TIERISCHEM EPITHELZELLKULTURBASALMEDIUM

TABELLE 1 (FORTSETZUNG)

TABELLE 1 (FORTSETZUNG)

TABELLE 1 (FORTSETZUNG)

Komplettmedien

Die obigen Bestandteile bilden ein „Basalmedium", wenn sie gemeinsam einer Lösung beigemischt werden. Diesem Basalmedium werden für das Formulieren der kompletten Kulturmedien der vorliegenden Erfindung Heparin, Epidermaler Wachstumsfaktor (EGF), zumindest ein Wirkstoff, der die intrazellulären Niveaus von zyklischem Adenosinmonophosphat (cAMP) erhöht und zumindest ein Fibroblasten Wachstumsfaktor (FGF) hinzugefügt. Heparin, EGF, der/die cAMP-erhöhende/n Wirkstoff/e und FGF/s können frisch formuliertem Basalmedium hinzugefügt werden oder können wie in Beispiel 1 im Detail beschrieben in einer Lösung von Dulbecco phosphatgepufferter Salzlösung (DPBS) beigemischt und gefriergelagert werden, bevorzugt bei –20°C bis –70°C, ehe sie für die Formulierung des kompletten Mediums der vorliegenden Erfindung dem Basalmedium hinzugefügt werden. Diese Beimischung von Heparin, EGF, cAMP-erhöhendem/n Wirkstoff/en und FGF/s kann als Ersatz für BPE oder weitere Organ-/Drüsen-Extrakte in tierischen Zellkulturmedien verwendet werden. Die Beimischung kann auch als eine 1X-1000X-Formulierung hergestellt werden, am meisten bevorzugt als eine 1X, 100X, 500X oder 1000X-Formulierung, die anschließend sachgemäß in Kulturmedium aufgelöst wird, damit wie in Beispiel 1 beschrieben eine 1X-Formulierung in den kompletten Medien der vorliegenden Erfindung formuliert werden kann.

Heparin ist beispielsweise von Sigma (Saint Louis, Missouri) im Handel erhältlich und wird bevorzugt aus Schweineschleimhaut gewonnen. Heparin wird den vorliegenden Medien hinzugefügt, um in erster Linie die Aktivität der Wachstumsfaktorenkomponenten, insbesondere FGF, zu stabilisieren (Gospodarowicz, D., and Cheng, J., J. Cell.Plysiol. 128:475–484 (1986); EP 0 408 146). Für das Formulieren des Mediums der vorliegenden Erfindung wird Heparin dem in Tabelle 1 gezeigten Basalmedium in einer Konzentration von ungefähr 1–5000 USP-Einheiten/Liter, bevorzugt ungefähr 5–50 USP-Einheiten/Liter und am meisten bevorzugt ungefähr 10 USP-Einheiten/Liter hinzugefügt.

EGF kann natürlich oder rekombinant sein und kann entweder menschlich sein oder von einem Nagetier stammen. EGF ist im Handel erhältlich (z.B. von GIBCO/LTI, Gaithersburg, Maryland) oder kann aus natürlichen Quellen isoliert oder mit rekombinanten DNA-Techniken (US-Patent Nr. 4743679) gemäß den Methoden im Stand der Technik hergestellt werden. Für das Formulieren des Mediums der vorliegenden Erfindung wird EGF dem in Tabelle 1 gezeigten Basalmedium in einer Konzentration von 0,00001–10 mg/L, bevorzugt 0,0001–0,1 mg/L und am meisten bevorzugt 0,0002 mg/L hinzugefügt.

Eine Vielfalt an die intrazellulären cAMP-Niveaus erhöhenden Wirkstoffen können für das Formulieren der Medien der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Eingeschlossen sind Wirkstoffe, die eine direkte Erhöhung der intrazellulären cAMP-Niveaus herbeiführen (z.B. Dibutyryl cAMP), Wirkstoffe, die durch eine Wechselwirkung mit einem zellulären G-Protein eine Erhöhung der intrazellulären cAMP-Niveaus hervorrufen (z.B. Choleratoxin und Forskolin), Wirkstoffe, die durch ihre Wirkung als Agonist von &bgr;-adrenergen Rezeptoren eine Erhöhung der intrazellulären cAMP-Niveaus hervorrufen (z.B. Isoproterenol) und Wirkstoffe, die durch Hemmen der Aktivitäten von cAMP-Phosphodiesterasen eine Erhöhung der intrazellulären cAMP-Niveaus hervorrufen (z.B. Isobutylmethylxanthin (IBMX) und Theophyllin). Am meisten bevorzugt für die Formulierung von Medien der vorliegenden Erfindung wird Isoproterenol verwendet. Diese cAMP-erhöhenden Wirkstoffe sind z.B. von Sigma (Saint Louis, Missouri) im Handel erhältlich und werden in Konzentrationen verwendet, die den bei Green beschriebenen Konzentrationen in etwa entsprechen (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 15:801–811 (1978)). Beispielsweise wird Choleratoxin dem oben beschriebenen Basalmedium in einer Konzentration von 0,000005–1 mg/L, bevorzugt 0,0007–0,1 mg/L und am meisten bevorzugt ungefähr 0,08 mg/L hinzugefügt. Dibutyryl cAMP wird den Basalmedien in einer Konzentration von 25–750 mg/L, bevorzugt 45–500 mg/L und am meisten bevorzugt 148 mg/L hinzugefügt. IBMX wird den Basalmedien in einer Konzentration von 0,2–25 mg/L, bevorzugt 2–10 mg/L und am meisten bevorzugt ungefähr 7 mg/L hinzugefügt. Am meisten bevorzugt ist Isoproterenol der Wirkstoff, der für das Erhöhen der intrazellulären Niveaus von cAMP verwendet wird und in die Basalmedien in einer Konzentration von 0,01–10 mg/L, bevorzugt 0,1–5 mg/L und am meisten bevorzugt ungefähr 0,25 mg/L formuliert ist.

Der für das Formulieren der Medien der vorliegenden Erfindung verwendete FGF kann ein beliebiges Mitglied der FGF-Familie von Wachstumsfaktoren sein, einschließlich FGF-1 (saurer FGF oder aFGF), FGF-2 (basischer FGF oder bFGF), FGF-3 (int-2), FGF-4 (K-FGF), FGF-5 (hst-1), FGF-6 (hst-2) und FGF-7 (Keratinozytenwachstumsfaktor oder KGF). Bevorzugt sind aFGF, bFGF und KGF, am meisten bevorzugt ist aFGF. Es können natürliche oder rekombinante FGF verwendet werden, die menschlich sein oder von Rindern, Schweinen oder Nagetieren stammen können. Am meisten bevorzugt für das Formulieren der vorliegenden Medien verwendet wird ein rekombinanter menschlicher aFGF. aFGF, bFGF und KGF sind im Handel erhältlich (z.B. von GIBCO/LTI, Gaithersburg, Maryland und R&D Systems, Inc., Minneapolis, Minnesota) oder können aus natürlichen Quellen isoliert oder mit rekombinanten DNA-Techniken (EP 0 408 146 und US-Patent Nr. 5,395,756 für aFGF; US-Patent Nr. 5,189,148 für bFGF; WO 90/08771 und WO 95/01434 für KGF) gemäß den Methodologien im Stand der Technik hergestellt werden. Für das Formulieren des Mediums der vorliegenden Erfindung wird FGF dem in Tabelle 1 gezeigten Basalmedium in einer Konzentration von 0,0001–10 mg/L, bevorzugt 0,001–0,1 mg/L und am meisten bevorzugt ungefähr 0,005 mg/L hinzugefügt.

Das Basalmedium, Heparin, EGF, cAMP-erhöhender/erhöhende Wirkstoff/e und FGF/s formulieren zusammen Komplettkulturmedien gemäß der vorliegenden Erfindung. Wie oben im Detail beschrieben, sind diese kompletten Medien für die Verwendung für das Kultivieren einer Vielfalt an tierischen Epithelzellen geeignet. Es kann allerdings bevorzugt werden, den Nährstoffinhalt der kompletten Medien weiter anzureichern, um schnelleres Wachstum und verbesserte Produktion von Biologika durch die kultivierten Zellen zu unterstützen und ein geeigneteres Umfeld für das Kultivieren von schwer kultivierbaren tierischen Epithelzellen bereitzustellen. Um eine solche Anreicherung zu vervollständigen, kann den kompletten Medien Ascorbinsäure hinzugefügt werden. Ascorbinsäure ist in mehreren Formen im Handel erhältlich. Bevorzugt für die Verwendung für das Formulieren der vorliegenden Medien ist L-Ascorbinsäurephosphat, Magnesiumsalz, erhältlich von Wako Pure Chemical Industries, das den Medien in einer Konzentration von 0,001–10 mg/L, bevorzugt 0,01–5 mg/L und am meisten bevorzugt ungefähr 0,1 mg/L hinzugefügt wird.

Die Mediumbestandteile können in einem flüssigen Trägermittel aufgelöst oder in trockener Form erhalten werden. Sind sie in einem flüssigen Trägermittel bei in Tabelle 1 gezeigten bevorzugten Konzentrationen aufgelöst (z.B. eine „"1X-Formulierung"), sollte der pH-Wert des Mediums bei 7,0–7,6, bevorzugt 7,1–7,5 und am meisten bevorzugt 7,2–7,4 eingestellt werden. Die Osmolarität des Mediums sollte ebenfalls bei 275–350 mOsm, bevorzugt 285–325 mOsm und am meisten bevorzugt 280–310 mOsm eingestellt werden. Die Art des flüssigen Trägermittels und das zur Auflösung der Bestandteile in der Lösung verwendete Verfahren variieren und können von einem Durchschnittsfachmann, der lediglich über übliche Erfahrung verfügt, bestimmt werden. Üblicherweise können die Mediumbestandteile in jeder beliebigen Reihenfolge hinzugefügt werden.

Bevorzugt sind die Lösungen, die Bestandteile umfassen, höher konzentriert als die Konzentration derselben Bestandteile in einer 1X-Mediumformulierung. Die Bestandteile können 10-fach konzentrierter (10X-Formulierung), 25-fach konzentrierter (25X-Formulierung), 50-fach konzentrierter (50X-Formulierung) oder 100-fach konzentrierter (100X-Formulierung) sein. Es können höher konzentrierte Formulierungen gebildet werden, vorausgesetzt, die Bestandteile bleiben löslich und stabil. Siehe US-Patent Nr. 5,474,931, das auf Verfahren für das Lösen von Kulturmedienkomponenten bei hohen Konzentrationen gerichtet ist.

Wenn die Medienbestandteile als gesondert konzentrierte Lösungen hergestellt werden, wird für die Herstellung einer 1X-Formulierung eine angemessene (ausreichende) Menge jedes Konzentrates mit einem Verdünnungsmittel kombiniert. Normalerweise ist das verwendete Verdünnungsmittel Wasser, doch können gemäß der Erfindung andere Lösungen einschließlich wässriger Puffer, wässriger Salzlösung oder weiterer wässriger Lösungen verwendet werden.

Üblicherweise werden die Kulturmedien der vorliegenden Erfindung sterilisiert, um ungewollte Kontaminierung zu verhindern. Für die Herstellung von sterilem Kulturmedium kann die Sterilisierung beispielsweise durch Filtrieren durch einen proteinbindungsarmen Membranfilter mit 0,1–1,0 &mgr;m Porengröße (im Handel beispielsweise von Millipore, Bedford, Massachusetts erhältlich) nach Beimischen von konzentrierten Bestandteilen vervollständigt werden. Alternativ können konzentrierte Bestandteil-Untergruppen filtersterilisiert und als sterile Lösungen gelagert werden. Diese sterilen Konzentrate können dann unter aseptischen Bedingungen mit einem sterilen Verdünnungsmittel vermischt werden, um eine konzentrierte sterile 1X-Mediumformulierung herzustellen. Autoklavieren oder weitere Hochtemperatur-Sterilisierungsverfahren sind nicht bevorzugt, da mehrere der Bestandteile der vorliegenden Kulturmedien hitzelabil sind und bei Temperaturen wie jenen, die bei den meisten Hitzesterilisierungsverfahren erzielt werden, irreversibel abgebaut werden.

Tabelle 1 listet die optimalen Konzentrationsbereiche für Basalmediumbestandteile auf. Diese Bestandteile können für die Bildung von tierischen Zellenkulturbasalmedium kombiniert werden, das anschließend für die Formulierung der kompletten Medien der vorliegenden Erfindung wie oben beschrieben mit Heparin, EGF, zumindest einem Wirkstoff, der die intrazellulären cAMP-Niveaus erhöht, zumindest einem FGF und optional mit Ascorbinsäure ergänzt wird. Wie dem Durchschnittsfachmann leicht ersichtlich ist, kann die Konzentration eines bestimmten Bestandteiles außerhalb des offenbarten Bereiches erhöht oder reduziert werden und die Wirkung der erhöhten oder reduzierten Konzentration kann durch Verwendung von üblichen Experimenten bestimmt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Konzentrationen der Bestandteile des Mediums der vorliegenden Erfindung die in der äußeren rechten Spalte in Tabelle 1 aufgelisteten Konzentrationen, die wie oben beschrieben mit Heparin, EGF, aFGF, Isoproterenol und Ascorbinsäure ergänzt werden.

Es ist dem Durchschnittsfachmann leicht ersichtlich, dass jede dieser Komponenten des Kulturmediums mit einer oder mehreren anderen Komponenten in der Lösung reagieren kann. Somit steckt die vorliegende Erfindung sowohl die in Tabelle 1 offenbarten, wie oben beschrieben ergänzten Formulierungen als auch jegliche Reaktionmischung, die nach dem Kombinieren dieser Bestandteile gebildet wird, ab.

Die Optimierung der vorliegenden Medienformulierungen wurde unter Verwendung von Methoden, die von Ham (Ham, R.G., Methods for Preparation of Media, Supplements and Substrata for Serum-Free Animal Culture, Alan R. Liss, Inc., New York, Seite 3–21 (1984)) und Waymouth (Waymouth, C., Methods for Preparation of Media, Supplements and Substrata for Serum-Free Animal Culture, Alan R. Liss, Inc., New York, Seiten 23–68 (1984)) beschrieben wurden, ausgeführt. Die optimalen endgültigen Konzentrationen für Mediumbestandteile werden üblicherweise entweder durch empirische Studien, in Titrationsstudien von Einzelkomponenten, oder durch Interpretation von historischer und aktueller wissenschaftlicher Literatur identifiziert. In Titrationsstudien von Einzelkomponenten unter Verwendung von tierischen Zellen ist die Konzentration einer einzelnen Mediumkomponente unterschiedlich, während alle weiteren Elemente und Variablen konstant gehalten werden und die Wirkung der Einzelkomponente auf Viabilität, Wachstum oder kontinuierlicher Gesundheit der tierischen Zellen gemessen wird.

Verwendung von Kulturmedien

Zellen, die in dem Medium der vorliegenden Erfindung wachsen können, sind tierischen Ursprungs, einschließlich, aber nicht darauf beschränkt, Zellen, die von Säugetieren gewonnen werden. Säugetierzellen, die insbesondere für das Kultivieren in den vorliegenden Medien geeignet sind, schließen Zellen menschlichen Ursprungs ein, die aus einer Gewebeprobe gewonnene Primärzellen wie Keratinozyten, zervikale Epithelzellen, bronchiale Epithelzellen oder tracheale Epithelzellen oder transformierte Zellen oder etablierte Zelllinien (z.B. das menschliche Keratinozyt HCAT oder zervikale Epithelzelllinien HeLa) sein können. Diese Zellen können normale Zellen sein oder optional erkrankte oder genetisch veränderte Zellen. Weitere Säugetierzellen wie CHO-Zellen, COS-Zellen, VERO-Zellen, BHK-Zellen (einschließlich BHK-21-Zellen) und Derivate derselben sind ebenfalls für das Kultivieren in den vorliegenden Medien geeignet. Insbesondere bevorzugt sind primäre oder sekundäre menschliche Keratinozyten, die aus einer Probe von normaler oder anormaler menschlicher Haut gewonnen werden. Epithelgewebe, Organe und Organsysteme, die von Tieren gewonnen oder unter Verwendung von im Stand der Technik üblichen Verfahren in vitro oder in vivo gebildet werden, können gleichermaßen in den Kulturmedien der vorliegenden Erfindung kultiviert werden.

Isolierung von Zellen

Tierische Zellen für das Kultivieren durch die vorliegende Erfindung sind im Handel beispielsweise von ATCC (Rockville, Maryland), Cell Systems, Inc. (Kirkland, Washington), Clonetics Corporation (San Diego, California), BioWhittaker (Walkersville, Maryland) oder Cascade Biologicals (Portland, Oregon) erhältlich. Alternativ können Zellen direkt von Proben von Tiergewebe, das mittels Biopsie, Autopsie, Organspende oder anderer chirurgischer oder medizinischer Vorgänge erhalten wurde, isoliert werden.

Das Gewebe sollte unter Verwendung von standardmäßigen sterilen Techniken und einer Sicherheitswerkbank verarbeitet werden. Bei der Verwendung und Verarbeitung jedes menschlichen Gewebes sollten die Empfehlungen des U.S. Department of Health and Human Services (US-Ministerium für Gesundheit und Sozialdienste)/Centers for Disease Control and Prevention (Zentren für Krankheitsbekämpfung und -verhütung) (Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories, Richmond, J.Y. et al., Eds., U.S. Government Printing Office, Washington, D.C. 3rd Edition (1993)) befolgt werden. Das Gewebe sollte unter Verwendung steriler chirurgischer Instrumente in kleine Teile (z.B. 0,5 × 0,5 cm) geschnitten werden. Die kleinen Teile sollen zweimal in steriler Salzlösung, die wie oben mit Antibiotika ergänzt wird, gewaschen werden und können dann optional mit einer enzymatischen Lösung (z.B. Collagenase oder Trypsinlösungen, jeweils im Handel erhältlich, beispielsweise von GIBCO/LTI, Gaithersburg, Maryland) verarbeitet werden, um die Dissoziation von Zellen aus der Gewebematrix zu fördern.

Die Mischung von dissoziierten Zellen und Matrixmolekülen wird zweimal mit einer geeigneten physiologischen Salzlösung oder Gewebekulturmedium gewaschen (z.B. Dulbecco phosphatgepufferte Salzlösung ohne Kalzium und Magnesium). Zwischen den Waschvorgängen werden die Zellen zentrifugiert (z.B. bei 200 × g) und dann wieder in serumfreien Gewebekulturmedium suspendiert. Aliquoten werden unter Verwendung eines elektronischen Zellenzählers (wie ein Coulter-Zähler) gezählt. Alternativ können die Zellen manuell unter Verwendung eines Hämozytometers gezählt werden.

Ausplattieren von Zellen

Die isolierten Zellen können gemäß den experimentellen, vom Forscher festgelegten Bedingungen ausplattiert werden. Die nachfolgenden Beispiele veranschaulichen zumindest einen funktionelle Reihe Kulturbedingungen, die für das Kultivieren von bestimmten Säugetierzellen zweckmäßig sind. Allerdings kann ein Durchschnittsfachmann unter Verwendung üblicher Experimente die optimalen Ausplattierungs- und Kulturbedingungen für eine vorgegebene tierische Zellenart festlegen. Bei üblichen Kulturbedingungen und unter Verwendung der vorliegenden Erfindung können Zellen auf der Oberfläche von Kulturgefäßen ohne Anhaftungsfaktoren ausplattiert werden. Alternativ können die Gefäße mit natürlichen, rekombinanten oder synthetischen Anhaftungsfaktoren oder Peptidfragmenten vorbeschichtet werden (z.B. Collagen oder Fibronektin oder natürliche oder synthetische Fragmente derselben). Isolierte Zellen können auch in oder auf ein natürliches oder synthetisches dreidimensionales Trägergerüst wie einem vorgeformten Collagengel oder einem synthetischen biopolymeren Stoff ausgesät werden. Die Verwendung von Anhaftungsfaktoren oder einem Trägergerüst mit dem Medium der vorliegenden Erfindung wird das Kultivieren von einigen bindungsabhängigen Zellen in Abwesenheit von der Serumergänzung verbessern.

Die Aussaatzelldichten bei jeder Experimentalbedingung können für die speziellen zu verwendenden Kulturbedingungen optimiert werden. Für das übliche Kultivieren in Plastikkulturgefäßen ist eine erste Aussaatdichte von 1–5 × 106 Zellen pro cm2 bevorzugt.

Säugetierzellen werden bei etwa 37°C in einem Zellinkubator kultiviert. Die Inkubatoratmosphäre sollte feucht sein und 3–10 % Kohlendioxid in der Luft enthalten, obwohl das Kultivieren bestimmter Zelllinien für optimale Ergebnisse 20 Kohlendioxid in der Luft erfordert. Der pH-Wert des Kulturmediums sollte im Bereich von 7,1–7,6, bevorzugt 7,1–7,4 und am meisten bevorzugt 7,1–7,3 liegen.

Zellen in geschlossener Kultur oder Batch-Kultur sollten alle 1–2 Tage oder mehr oder weniger so häufig, wie für die spezielle Zellenart erforderlich, einen kompletten Mediumaustausch durchlaufen (z.B. Ersetzen der verbrauchten Medien durch frische Medien). Zellen in Perfusionskulturen (z.B. in Bioreaktoren oder Fermentern) erhalten auf einer kontinuierlich umlaufenden Basis frische Medien.

Zellkulturzusammensetzungen

Die Zellkulturmedien der vorliegenden Erfindung können auch für die Herstellung von Zellkulturzusammensetzungen, die die vorliegenden Medien und eine tierische Epithelzelle umfassen, verwendet werden. Tierische Epithelzellen, die für das Formulieren der Zellkulturzusammensetzungen der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind Zellen tierischen Ursprungs, einschließlich, aber nicht darauf beschränkt, Zellen, die aus Säugetieren gewonnen werden. Insbesondere Säugetierzellen, die für das Kultivieren der vorliegenden Zellkulturzusammensetzungen geeignet sind, schließen Epithelzellen menschlichen Ursprungs ein, die primäre, aus einer Gewebeprobe gewonnene Zellen wie Keratinozyten, zervikale Epithelzellen, bronchiale Epithelzellen oder tracheale Epithelzellen oder transformierte Zellen oder etablierte Zelllinien (z.B. das menschliche Keratinozyt HCAT oder zervikale Epithelzelllinien HeLa) oder Derivate derselben sein können. Diese Zellen können normale Zellen sein oder optional erkrankte oder genetisch veränderte Zellen. Weitere Säugetierzellen wie CHO-Zellen, COS-Zellen, VERO-Zellen, BHK-Zellen (einschließlich BHK-21-Zellen) und Derivate derselben sind ebenfalls für das Formulieren der vorliegenden Zellkulturzusammensetzungen geeignet. Insbesondere bevorzugt sind primäre oder sekundäre menschliche Keratinozyten, die aus einer Probe von normaler oder anormaler menschlicher Haut gewonnen werden. Epithelgewebe, Organe und Organsysteme, die aus Tieren gewonnen oder in vitro oder in vivo mit Hilfe von Verfahren, die im Stand der Technik üblich sind, gebildet werden, können gleichermaßen für das Formulieren von Zellkulturzusammensetzungen der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Diese Zellkulturzusammensetzungen können in einer Vielfalt an medizinischen (einschließlich diagnostischen und therapeutischen), industriellen, forensischen und forschungstechnischen Anwendungen verwendet werden, die gebrauchsfertige Kulturen tierischer Epithelzellen in serumfreien Medien erfordern.

Nachdem hierin die vorliegende Erfindung im Detail beschrieben wurde, wird dieselbe unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele verständlicher, die lediglich zum Zwecke der Veranschaulichung eingeschlossen sind und die Erfindung nicht einschränken sollen.

Beispiele Materialien und Methoden

In jedem der folgenden Beispiele werden allgemein die folgenden Materialien und Methoden verwendet.

Isolieren und Kultivieren menschlicher Keratinozyten

Falls nicht anders angegeben stammen alle Medien und Reagenzien von GIBCO/LTI (Gaithersburg, Maryland). Humane neonatale Präputia wurden in serumfreies 5 &mgr;g/ml Gentamicin enthaltendes Medium (SFM) ohne Wachstumsfaktoren gegeben und bei 4°C gelagert. Präputia können auf diese Art und Weise für ungefähr fünf Tage ohne wesentlichen Verlust der Zellviabilität gelagert werden. Die Präputia wurden kurz in 70%igem Isopropanol gespült und dann für 60 Minuten in 20 &mgr;g/ml Gentamicin enthaltende Dulbecco phosphatgepufferte Salzlösung (DPBS) ohne Ca2+ und MG2+ gegeben. Die Präputia wurden dann abhängig von der Gewebegröße in Hälften oder Viertel geschnitten und die Teile wurden mit der Hautseite nach unten in eine 25 Einheiten/ml Dispase enthaltende Petrischale übertragen und bei 40°C 18–24 Stunden inkubiert. Mit Pinzetten wurden die epidermalen Schichten von den darunterliegenden Hautschichten abgetrennt, in 60 mm Kulturscheiben, die 5–7 ml 0,05%iges Trypsin/0,53 mM EDTA enthalten, vereinigt und bei 37°C für 15–20 Minuten durch leichtes Pipettieren für das Unterstützen der Gewebedissoziation inkubiert. Das Vereinigen der Gewebeproben wird vorgenommen, um die Wirkung der Donor-zu-Donor Wachstumsvariation zu reduzieren. Trypsin wurde durch Hinzufügen von Sojabohnentrypsininhibitor (10 mg/ml in DPBS) vervollständigt. Jegliche verbleibenden Teile der epidermalen Schichten wurden sorgfältig entfernt und verworfen. Die Zellsuspension wurde in ein steriles Zentrifugenglas übertragen und die Zellen wurden durch Zentrifugieren bei 40 × g über 5 Minuten bei 22°C pelletiert und einmal mit SFM gewaschen. Der Überstand wurde verworfen, der Zellpellet in einem geeigneten Medium resuspendiert und die Zelldichten wurden unter Verwendung eines Hämozytometers bestimmt. Die Zellen wurden in Kulturkolben oder -schalen ausplattiert.

Sekundärkulturen wurden durch Entfernen des verbrauchten Mediums, kurzem Waschen der Zelleinzelschicht mit Versen (Verdünnung 1:5000) und Hinzufügen eines geeigneten Volumens von 0,05%igem Trypsin/0,53 mM EDTA etabliert. Die Zellen wurden bei 37°C inkubiert, bis sie eine runde Form annahmen (ungefähr 5 Minuten), Trypsin wurde entfernt und die Zellen wurden bei 37°C inkubiert, bis sie sich durch leichtes Abklopfen von der Kulturoberfläche lösten (ungefähr 5 Minuten). Trypsin wurde durch das Hinzufügen von 10 mg/ml Sojabohnentrypsininhibitorlösung inaktiviert, die Zellen wurden durch Zentrifugieren bei 40 × g über 5 Minuten bei 22°C pelletiert, einmal mit SFM gewaschen und in einem geeigneten Medium resuspendiert. Sekundäre Zellkulturen wurden auch aus primären Keratinozyten von Cell Systems Corporation (Kirkland, Washington) etabliert, wobei die Ergebnisse mit jenen, die bei aus neonatalem Präputium etablierten Kulturen erzielt wurden, vergleichbar waren.

Die Trypsinisationszeiten sind für die Leistung eines beliebigen Keratinozyten-Mediums ausschlaggebend. Menschliche Keratinozyten, die zu lange in Trypsin verbleiben, weisen geringere Ausplattierungswirkung auf und können zur Differenzierung angeregt werden.

Die Kulturen wurden bei 37°C in einer feuchten Atmosphäre, die zu 5% aus CO2 und zu 95% aus Luft besteht, inkubiert. Bei einem Teilungsverhältnis von 1:2 bis 1:3 wurden Stammkulturen erhalten und bei 70 bis 80% Konfluenz subkultiviert. Für die experimentelle Untersuchung wurden Keratinozyten bei den Durchlässen 0 bis 4 verwendet.

Morphologie- und Wachstums-Assays

In einem Glaskulturobjektträger mit 8 Kammern wurden morphologische Analysen und Immunfärbung von Zellen vorgenommen. Keratinozyten wurden bei 2 × 104 Zellen/cm2 in einem Gesamtvolumen von 400 &mgr;l/0,8 cm2 Kammer ausplattiert. Die Zellen wurden für 24 Stunden inkubiert, danach mit 3,7%igem Formaldehyd fixiert, mit 0,5%igem TRITON X-100 in DPBS durchlässig gemacht und konnten mit Hase-anti-Cytokeratin-14-Antikörpern (Verdünnung 1:200) reagieren. Die mit Antikörpern markierten Zellen wurden durch Verwendung von FITC F(ab')2-konjugierten Ziege-anti-Hase (Verdünnung 1:50) sichtbar gemacht.

Assays bezüglich des Wachstums menschlicher Keratinozyten wurden in 24-Well Kulturschalen (2 cm2 Wachstumgebiet) unter Verwendung einer Saatdichte von 1 × 104 Zellen/cm2 vorgenommen. 6 Tage nach dem Aussäen von Primärzellen und 72 Stunden nach dem Aussäen von Sekundärzellen wurden Endpunkt-Wachstums-Assays ausgewertet. Über 96 Stunden hinweg wurden ohne Medienaustausch wachstumskinetische Assays in 24-Stunden-Intervallen gezählt. Einzelzellklonierungs-Assays wurden in gewebskulturbehandelten 96-Well-Platten durch Reihenverdünnung von Zellsuspensionen auf 5 Zellen/ml in dem geeigneten Medium und einer Ausplattierung von 100 &mgr;l/Well durchgeführt. Vor der Beobachtung wurden die Platten 5 Tage inkubiert. In Vergleichs-Assays wurden die Medien der vorliegenden Erfindung auf ihre wachstumsfördernden Fähigkeiten bezüglich einem definierten menschlichen Keratinozyten-Medium, das von Zulieferer A stammt, und einer BPE enthaltenden Formulierung (Keratinozyten-SFM; GIBCO/LTI, Gaithersburg, Maryland) hin untersucht.

Beispiel 1 Formulierung von Komplettmedium

Formulierung von Zellkulturbasalmedium. Destilliertes, entionisiertes Wasser (nachfolgend „ddH2O") wurde auf 80% des gewünschten Gesamtvolumens abgemessen. Unter vorsichtigem Rühren mit einem Magnetrührer wurde folgendes hinzugefügt: L-Alanin (9,00 mg/L), L-Arginin·HCl (421,40 mg/L), L-Asparagin·HCl (12,20 mg/L), L-Asparginsäure (4,00 mg/L), L-Cystein·HCl·H2O (42,00 mg/L), L-Glutaminsäure (14,80 mg/L), L-Glutamin (1020,00 mg/L), Glycin (7,60 mg/L), L-Histidin·HCl·H2O (50,40 mg/L), L-Isoleucin (6,00 mg/L), L-Leucin (131,20 mg/L), Lysin·HCl (54,90 mg/L), L-Methionin (13,50 mg/L), L-Phenylalanin (10,03 mg/L), L-Prolin (34,60mg/L), L-Serin (126,20 mg/L), L-Threonin (23,80 mg/L), L-Tryptophan (9,30 mg/L), L-Tyrosin-Dinatriumsalz (11,68 mg/L), L-Valin (70,20 mg/L), Biotin (0,02 mg/L), D-Ca2+-Pantothenat (0,30 mg/L), Cholinchlorid (14,00 mg/L), Folsäure (0,8 mg/L), i-Inositol (18,00 mg/L), Niacinamid (0,04 mg/L), Pyridoxin·HCl (0,06 mg/L), Riboflavin (0,04 mg/L), Thiamin·HCl (0,30 mg/L), Vitamin B12 (0,50 mg/L), Putrescin·2HCl (0,20 mg/L), D-Glucose (1500,0 mg/L), KCl (112,0 mg/L), NaCl (6790,0 mg/L), Thymidin (0,73 mg/L), Adenin (24,00 mg/L), HEPES (3336,20 mg/L), Liponsäure (0,20 mg/L), Phenolrot (1,20 mg/L), Natriumpyruvat (55,0 g), Natriumacetat (301,00 mg/L), Na2HPO4 (284,00 mg/L), Na2SO4 (3,39 mg/L), humanes Insulin (5,00 mg/L) und humanes Transferrin (11,11 mg/L).

Eine Stammlösung von Ethanolamin·HCl wurde in ddH2O bei 976,00 mg/L/L hergestellt und 0,615 ml/L dieses Stammes wurden der Mediumlösung hinzugefügt, um eine endgültige Konzentration von 0,60 mg/L an Ethanolamin·HCl zu erhalten.

Eine Stammlösung von Phophoethanolamin wurde in ddH2O bei 1408,00 mg/L/L hergestellt und 0,1001 ml/L dieses Stammes wurden der Mediumlösung hinzugefügt, um eine endgültige Konzentration von 0,141 mg/L an Phosphoethanolamin zu erhalten.

Eine Stammlösung von FeSO4·7H2O (41,70 mg/L), MgCl2·6H2O (18890 mg/L) und CaCl2·2H2O (1344 mg/L) wurde in 0,5 ml/L konzentrierten HCl enthaltendem Wasser hergestellt und 9,660 ml dieser Stammlösung wurden der Mediumlösung hinzugefügt, um endgültige Konzentrationen von 0,403 mg/L an FeSO4·7H2O, von 182,48 mg/L an MgCl2·6H2O und von 12,98 mg/L an CaCl2·2H2O zu erhalten.

Eine Stammlösung von ZnSO4·7H2O (137,68 mg/L) wurde in Wasser hergestellt und 0,9660 ml dieser Lösung wurden der Mediumlösung hinzugefügt, um eine endgültige Konzentration von 0,133 mg/L an ZnSO4·7H2O zu erhalten.

Eine Stammlösung, die Na2SeO3 (0,513 mg/L), (NH4)6Mo7O24·4H2O (0,124 mg/L), NaSiO3·9H2O (14,2 mg/L), NiSO4·6H2O (0,013 mg/L), MnCl2·4H2O (0,002 mg/L), SnCl2·2H2O (0,011 mg/L) und NH4VO3 (0,059 mg/L) enthielt, wurde in Wasser mit 0,5 ml/L konzentriertem HCl hergestellt und 9,660 ml dieser Stammlösung wurden der Mediumlösung hinzugefügt, um endgültige Konzentrationen von 0,00496 mg/L an Na2SeO3, 0,00120 mg/L (NH4)6Mo7O24·4H2O, 0,137 mg/L NaSiO3·9H2O, 0,00013 mg/L NiSO4·6H2O, 0,00002 mg/L MnCl2·4H2O, 0,00011 mg/L SnCl2·2H2O und 0,00057 mg/L NH4VO3 zu erhalten.

Eine Stammlösung von Hydrocortison wurde mit 370 mg/L in 95%igem Ethanol hergestellt und 0,2 ml dieses Stammes wurden der Mediumlösung hinzugefügt, um eine endgültige Konzentration von 0,074 mg/L an Hydrocortison zu erhalten.

Eine Stammlösung von Triiodothyronin-Lösung (T3) wurde bei 67,00 mg/L in 70%igem Ethanol hergestellt und 0,1 ml dieses Stammes wurden der Mediumlösung hinzugefügt, um eine endgültige Konzentration von 0,0067 mg/L an T3 zu erhalten.

NaHCO3 (1160 mg/L) wurde der Mediumlösung hinzugefügt und der pH-Wert der Lösung wurde anschließend mit HCl auf 7,2 ± 0,05 eingestellt und das Volumen wurde mit ddH2O an das gewünschte Gesamtvolumen angepasst. Die Osmolarität wurde bei 290 ± 15 mOsm festgelegt.

Diese Basalmediumformulierung wurde anschließend durch einen proteinbindungsarmen Filter gefiltert, in Flaschen gefüllt und bei gedämpften Lichtbedingungen bei 4°C bis zur Verwendung gelagert.

Formulierung der Wachstumsergänzung. Unter vorsichtigem Rühren wurde einer Dulbecco phosphatgepufferten Salzlösung (DPBS) folgendes hinzugefügt: Ascorbinsäurephosphat, Magnesiumsalz (50 mg/L), aFGF (2,5 mg/L), Heparin (5000 Einheiten/L) und EGF (0,1 mg/L).

Eine Stammlösung von Isoproterenol (100.000 mg/L) wurde in 50 mg/L Ascorbinsäure enthaltender DPBS hergestellt und 1,25 ml/L dieser Lösung wurden der obigen hinzugefügt, um eine 500X-Formulierung der Wachstumsergänzung zu bilden.

Diese 500X-Lösung wurde anschließend durch einen proteinbindungsarmen Filter gefiltert und dem Basalmedium hinzugefügt oder gleich aufgeteilt und bei –20 bis –80°C bis zur Verwendung in Epithelzellkulturmedium als Ersatz für ein Organ- oder Drüsenextrakt wie BPE gelagert.

Herstellung des Komplettmediums. 1 ml der Wachstumsergänzung wurde 500 ml des Basalmediums hinzugefügt und das Komplettmedium wurde umgehend verwendet oder bis zur Verwendung bei 4°C unter gedämpften Lichtbedingungen gelagert.

Beispiel 2 Wirkung von aFGF

Um die Zweckmäßigkeit des Basalmediums bei der Unterstützung des Wachstums menschlicher Keratinozyten zu untersuchen und die Wirkung von FGF zu bestimmen, wurden primäre menschliche Keratinozyten wie oben beschrieben isoliert und in dem Basalmedium aus Beispiel 1, das mit 10 USP-Einheiten/L Heparin und 0,0002 mg/L EGF ergänzt wurde, oder in dem Basalmedium, das 10 USP-Einheiten/L Heparin, 0,0002 mg/L EGF und 0,005 mg/L aFGF enthielt, kultiviert. Tabelle 2 zeigt repräsentative Ergebnisse von fünf einzelnen Experimenten, wobei das Wachstum in dem Basalmedium mit und ohne aFGF mit dem Wachstum in einem BPE enthaltenden Keratinozyten-SFM („Kontrolle") verglichen wird.

TABELLE 2. WIRKUNG VON aFGF (ZELLEN/ML × 105).

Diese Ergebnisse zeigen an, dass das Basalmedium das Wachstum primärer Keratinozyten unterstützt, obgleich für gewöhnlich in einem geringeren Umfang als das BPE enthaltende Kontrollmedium. Weiterhin zeigen die Ergebnisse an, dass das Hinzufügen von aFGF zu dem Basalmedium seine Fähigkeit, das Wachstum von Keratinozyten zu fördern, verbessert.

Beispiel 3 Wirkung von Isoproterenol

Um festzustellen, ob die Leistung von dem definierten Kulturmedium durch Einschluss eines die intrazellulären cAMP-Niveaus erhöhenden Wirkstoffes weiter verbessert werden könnte, wurde das Heparin, EGF und aFGF enthaltende Basalmedium aus Beispiel 2 mit und ohne Hinzufügen von 0,25 mg/L Isoproterenol untersucht. Primäre menschliche Keratinozyten wurden isoliert und wie in Beispiel 2 beschrieben kultiviert. Tabelle 3 zeigt repräsentative Ergebnisse von fünf einzelnen Experimenten, wobei das Wachstum in dem Medium mit und ohne Isoproterenol mit dem Wachstum in einem BPE enthaltenden Keratinozyten-SFM ("Kontrolle") verglichen wird.

TABELLE 3. WIRKUNG VON ISOPROTERENOL (ZELLEN/ML × 105).

Diese Ergebnisse veranschaulichen, dass das Hinzufügen von Isoproterenol zu einem aFGF enthaltenden Basalmedium der vorliegenden Erfindung seine Fähigkeit, das Keratinozyten-Wachstum zu fördern, weiter verbessert. Tatsächlich hat das aFGF und Isoproterenol enthaltende Medium das Wachstum primärer menschlicher Keratinozyten stärker gefördert als die BPE enthaltende Kontrolle. Somit zeigen diese Ergebnisse an, dass ein definiertes Medium, das das Basalmedium, Heparin, EGF, aFGF und Isoproterenol umfasst, eine optimale Formulierung für ein vollständig definiertes BPE-freies SFM ist, das die Kultivierung unterstützt und das Wachstum menschlicher Keratinozyten fördert. Zusätzlich verdeutlichen diese Ergebnisse, dass eine Zusammensetzung, die Heparin, EGF, FGF und einen cAMP-aktivierenden Wirkstoff wie Isoproterenol umfasst, als Ersatz für ein Organ- oder Drüsenextrakt wie BPE in SFM für die Kultur von Epithelzellen wie Keratinozyten verwendet werden kann.

Beispiel 4 Wirkung von Ascorbinsäure

Da einige für das Keratinozyten-Kulturen verwendete Basalmedien Ascorbinsäure enthalten (Gilchrest, B.A., et al., J. Cell. Physiol. 120:377–383 (1984)), wurde die Wirkung bei Hinzufügen von 50,0 mg/L zu dem EGF/aFGF/Isoptoterenol enthaltenden Medium aus Beispiel 3 untersucht. Primäre menschliche Keratinozyten wurden isoliert und wie in Beispiel 2 beschrieben kultiviert. Tabelle 4 zeigt repräsentative Ergebnisse von vier einzelnen Experimenten, wobei das Wachstum in dem Medium mit und ohne Ascorbinsäure mit dem Wachstum in einem BPE enthaltenden Keratinozyten-SFM („Kontrolle") verglichen wird.

TABELLE 4. WIRKUNG VON ASCORBINSÄURE (ZELLEN/ML × 105).

Diese Ergebnisse veranschaulichen, dass das Hinzufügen von Ascorbinsäure zu einem aFGF/Isoproterenol enthaltenden Medium der vorliegenden Erfindung seine Fähigkeit, das Keratinozyten-Wachstum zu fördern, weiter verbessert. Die Wirkung von Ascorbinsäure allerdings war nicht so drastisch wie die bei Hinzufügen entweder von aFGF (Beispiel 2) oder von Isoproterenol (Beispiel 3) beobachtete Wirkung; das Ascorbinsäure enthaltende definierte Medium wirkte nur geringfügig besser als das Medium ohne Ascorbinsäure, wodurch vorgeschlagen wurde, dass der Einschluss von Ascorbinsäure in das definierte Medium der vorliegenden Erfindung optional sein kann. Allerdings übertrafen beide definierten Medien deutlich das Kontrollmedium und bestätigten die in Beispiel 3 erhaltenen Ergebnisse. Gemeinsam zeigen die Ergebnisse der Beispiele 2–4 an, dass ein definiertes Medium, das das Basalmedium, Heparin, EGF, aFGF und Isoproterenol umfasst und optional Ascorbinsäure einschließt, eine optimale Formulierung für ein vollständig definiertes BPE-freies SFM ist, das die Kultivierung unterstützt und das Wachstum menschlicher Keratinozyten fördert. Zusätzlich veranschaulichen diese Ergebnisse, dass eine Lösung, die Heparin, EGF, FGF, einen cAMP-erhöhenden Wirkstoff wie Isoproterenol und Ascorbinsäure umfasst, als Ersatz für ein Organ- oder Drüsenextrakt wie BPE in SFM für die Kultur von Epithelzellen wie Keratinozyten verwendet werden kann.

Beispiel 5 Wachstum primärer menschlicher Keratinozyten in definiertem SFM

Primäre menschliche Keratinozyten wurden wie oben beschrieben isoliert und entweder in dem definierten SFM der vorliegenden Erfindung, wie in Beispiel 4, das EGF, aFGF, Isoproterenol und Ascorbinsäure enthält („Definiertes Keratinozyten-SFM"), oder in einem BPE enthaltenden Keratinozytn-SFM („Keratinozyten-SFM") kultiviert. Nach mehreren Passagen wurden die Kulturen isoliert, ausplattiert und für 24 Stunden kultiviert und die Zellen wurden anschließend durch Phasenkontrastmikroskopie auf ihre Morphologie (1) hin untersucht oder mit Keratin-14-Antikörpern gefärbt und durch Fluoreszenzmikroskopie auf die Expression des standardmäßigen Kennzeichens basaler menschlicher Keratinozyten hin untersucht (2).

Wie in 1 gezeigt, besaßen menschliche, in dem definierten Medium der vorliegenden Erfindung kultivierte Keratinozyten (1A) dasselbe kontaktgehemmte, morphologisches „Crazy-Paving" Muster, das für kultivierte primäre Keratinozyten üblich ist (Daniels, J.T., et al., Exp. Dermatol.4:183 (1995)), wobei dieselbe bei kultivierten Zellen in den BPE enthaltenden Medien beobachtet wurde (1B). Einzelschichtkulturen wiesen in beiden Medien unterschiedliche Grenzen und markante Zellkerne auf, was darauf hinwies, dass die Kulturen allgemein gesund waren. Wie in 2 veranschaulicht, färbten sich bei Keratin 14 die Zellen in dem definierten Keratinozyten-Medium der vorliegenden Erfindung positiv, was darauf hinwies, dass das Medium der vorliegenden Erfindung die Retention von keratinozytenspezifischen Markern durch kultivierte Primärzellen ermöglicht. Bei in BPE enthaltendem Medium kultivierten Zellen wurden ähnliche Ergebnisse erzielt.

Um die Zweckmäßigkeit der Medien bei der Unterstützung des Wachstums primärer Keratinozyten zu untersuchen, wurden Zellen 6 Tage lang in dem Medium der vorliegenden Erfindung („Definiertes Keratinozyten-SFM"), in einem BPE enthaltenden Keratinozyten-SFM („Keratinozyten-SFM") oder in einem definierten Keratinozyten-Medium von Hyclone Laboratories („Zulieferer A") inkubiert. Wie aus 3 ersichtlich, zeigten menschliche, in dem Medium der vorliegenden Erfindung kultivierte primäre Keratinozyten im Vergleich mit den weiteren Keratinozyten-Medien ein maßgeblich verbessertes Wachstum (p ≤ 0,05). Die Verdopplungszeiten der Population der einzelnen Medien lagen bei: Definiertes Keratinozyten-SFM: 46,3 ± 5,9 Stunden; Keratinozyten-SFM: 66,6 ± 12,8 Stunden und Zulieferer A: 83,5 ± 19,1 Stunden.

Gemeinsam zeigen diese Ergebnisse an, dass das definierte serumfreie Medium der vorliegenden Erfindung das Wachstum primärer menschlicher Keratinozyten unterstützt und sogar undefinierte, üblicherweise verwendete BPE enthaltende Medien übertrifft.

Beispiel 6 Wachstum von sekundären menschlichen Keratinozyten in definiertem SFM

Um die Zweckmäßigkeit der Medien der vorliegenden Erfindung, die auch Sekundärkulturen von Keratinozyten einschlossen, für das Wachstum sekundärer menschlicher Keratinozyten in definiertem SFM zu bestimmen, wurden Zellen, die aus aktiv wachsenden Kulturen gewonnen wurden, oder im Handel erhältliche Isolate in den drei in Beispiel 5 beschriebenen Medien kultiviert und auf ihre Wachstumsrate hin untersucht. Wie in 4 veranschaulicht, war das Wachstum von Sekundärkulturen in dem Medium der vorliegenden Erfindung und in dem BPE enthaltenden Medium ähnlich. Allerdings wurde in dem vorliegenden Medium ein wesentlich besseres Zellwachstum (p < 0,05) erzielt als in dem Medium von Zulieferer A. Die Verdopplungszeiten der Population in diesen sekundären Keratinozyten lagen bei: Definiertes Keratinozyten-SFM: 25,0 ± 1,1 Stunden; Keratinozyten-SFM: 29,0 ± 1,6 Stunden; und Zulieferer A: 35,4 ± 4,1 Stunden.

Tägliche wachstumskinetische Experimente, die Sekundärkulturen von Keratinozyten verwendeten, bestätigten, dass in dem Medium der vorliegenden Erfindung kultivierte Zellen sich bei einer mit der von BPE enthaltenden Medien vergleichbaren Geschwindigkeit vermehrten (5). Weiterhin konnten bei menschlichen, in dem Medium der vorliegenden Erfindung kultivierten Keratinozyten in Einzelzellklonierungsexperimenten Klonierungswirkungsgrade von ungefähr 40% erzielt werden, vergleichbar mit jenen, die mit in BPE enthaltenden Medien gewachsenen Zellen erhalten wurden (Daten nicht aufgeführt). In den Medien der vorliegenden Erfindung können zweimal pro Woche Sekundärkulturen für zumindest sechs Passagen mit Teilungsverhältnissen von ungefähr 1:2 erhalten werden.

Gemeinsam mit den Ergebnissen aus Beispiel 5 zeigen diese Ergebnisse an, dass das definierte serumfreie Medium der vorliegenden Erfindung das Wachstum primärer und sekundärer menschlicher Keratinozyten unterstützt und beide BPE enthaltenden undefinierten Medien und zumindest ein weiteres derzeit im Handel erhältliches Medium übertrifft.

Beispiel 7 Stabilität von definiertem SFM

Um die Lagerfähigkeit des Mediums der vorliegenden Erfindung zu untersuchen, wurden primäre menschliche Keratinozyten sechs Tage lang in den vorliegenden Medien (Definiertes Keratinozyten-SFM) oder in BPE enthaltendenen Medien (Keratinozyten-SFM) kultiviert. Nach der Formulierung wurden die Medien über einen Lagerzeitraum von 15 Wochen einmal pro Woche untersucht und die Zellzählungen jedes Zeitpunktes wurden mit jenen von frisch hergestellten Medien verglichen.

Wie in 6 gezeigt, wies das vollständig ergänzte definierte SFM der vorliegenden Erfindung eine Lagerfähigkeit von mehr als 14 Wochen auf, was deutlich über der Lagerfähigkeit des BPE enthaltenden Mediums lag. Diese Ergebnisse zeigen an, dass das Medium der vorliegenden Erfindung bei sachgemäßer oben beschriebener Lagerung im Vergleich zu üblicher verwendeten BPE enthaltenden Medien eine erhöhte Lagerfähigkeit aufweist.

Allgemeine Erläuterung

Kultursysteme, die für die Vermehrung menschlicher Keratinozyten gestaltet wurden, wurden entwickelt, um die undefinierten Komponenten zu reduzieren und die Lagerfähigkeit der Kultur und die Zellenerträge zu erhöhen. Die Ergebnisse der obigen Beispiele veranschaulichen, dass BPE in SFM durch eine Lösung, die Heparin, EGF, zumindest einen FGF, zumindest einen die intrazellulären Niveaus von cAMP erhöhenden Wirkstoff und umfassend optional Ascorbinsäure enthält, ersetzt werden kann. Weiterhin kann dieses Ersetzen von BPE ohne gegenteilige Wirkung auf die Zellproliferationsgeschwindigkeit und die allgemeine Physiologie menschlicher Keratinozyten durchgeführt werden. Das Entfernen von BPE als einer Mediumkomponente bei gleichzeitigem Erhalt der Mediumleistung stellt beim Kultivieren menschlicher Keratinozyten einen Schritt nach vorne dar, indem eine standardisiertere und kontrolliertere Kulturumgebung bereitgestellt wird, die wie gezeigt bei weiteren häufig verwendeten primären Zellkulturen fehlen (Watson, C.A., et al., Science 268:447–448 (1995)).

Somit zeigen die Ergebnisse der Beispiele 1–6 bei gemeinsamer Betrachtung an, dass die in Tabelle 1 gezeigte Basalmediumformulierung eine optimale Kulturmediumformulierung für das Unterstützen der Kultivierung von tierischen Zellen, die zu 5–10 mg/Liter mit EGF, zu ungefähr 5 mg/Liter mit aFGF, zu ungefähr 0,3 mg/Liter mit Isoproterenol und zu ungefähr 50 mg/Liter mit Ascorbinsäure (obwohl Ascorbinsäure bereits durch eine geringe Reduzierung der Wachstumsförderung eliminiert werden kann) ergänzt sind, ist.


Anspruch[de]
Ein serumfreies Zellkulturmedium, das Heparin, Epidermalen Wachstumsfaktor (EGF), einen Fibroblasten Wachstumsfaktor (FGF) und einen Wirkstoff umfasst, der intrazelluläre Niveaus von zyklischem Adenosinmonophosphat (cAMP) erhöht, wobei der Wirkstoff aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einem &bgr;-Adrenorezeptoragonisten, Choleratoxin, Forskolin, Dibutyryl-cAMP, Isobutylmethylxanthin und Theophyllin besteht. Das Medium gemäß Anspruch 1, wobei der FGF aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus FGF-1 (aFGF), FGF-2 (bFGF) und FGF-7 (KGF) besteht. Das Medium gemäß Anspruch 2, wobei der FGF aFGF ist. Das Medium gemäß Anspruch 1, wobei der intrazelluläre Niveaus von cAMP erhöhende Wirkstoff ein &bgr;-Adrenorezeptoragonist ist. Das Medium gemäß Anspruch 1, wobei der intrazelluläre Niveaus von cAMP erhöhende Wirkstoff Choleratoxin ist. Das Medium gemäß Anspruch 1, wobei der intrazelluläre Niveaus von cAMP erhöhende Wirkstoff Forskolin ist. Das Medium gemäß Anspruch 1, wobei der intrazelluläre Niveaus von cAMP erhöhende Wirkstoff Dibutyryl-cAMP ist. Das Medium gemäß Anspruch 1, wobei der intrazelluläre Niveaus von cAMP erhöhende Wirkstoff Isobutylmethylxanthin ist. Das Medium gemäß Anspruch 1, wobei der intrazelluläre Niveaus von cAMP erhöhende Wirkstoff Theophyllin ist. Das Medium gemäß Anspruch 1, wobei der intrazelluläre Niveaus von cAMP erhöhende Wirkstoff Isoproterenol ist. Das Medium gemäß Anspruch 1, wobei das Medium ferner Ascorbinsäure umfasst. Das Medium gemäß Anspruch 1, wobei das Medium eine 1X Medium-Formulierung ist. Das Medium gemäß Anspruch 1, wobei das Medium eine 10X konzentrierte Medium-Formulierung ist. Das Medium gemäß Anspruch 1, wobei das Medium ferner einen oder mehr Bestandteile aufweist, die aus der Gruppe der Bestandteile ausgewählt sind, die aus einer Aminosäure, einem Vitamin, einem anorganischen Salz, Adenin, Ethanolamin, D-Glucose, N-[2-Hydroxyethyl]-piperazin-N'-[2-ethansulfonsäure] (HEPES), Hydrocortison, Insulin, Liponsäure, Phenolrot, Phosphoethanolamin, Putrescin, Natriumpyruvat, T3, Thymidin und Transferrin besteht. Das Medium gemäß Anspruch 14, wobei das Medium ferner Ascorbinsäure umfasst. Das Medium gemäß Anspruch 14, wobei der Aminosäure-Bestandteil einen oder mehr Aminosäuren umfasst, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus L-Alanin, L-Arginin, L-Asparagin, L-Asparaginsäure, L-Cystein, L-Glutaminsäure, L-Glutamin, Glycin, L-Histidin, L-Isoleucin, L-Leucin, L-Lysin, L-Methionin, L-Phenylalanin, L-Prolin, L-Serin, L-Threonin, L-Tryptophan, L-Tyrosin und L-Valin besteht. Das Medium gemäß Anspruch 14, wobei der Vitamin-Bestandteil einen oder mehr Vitamine umfasst, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Biotin, Cholinchlorid, D-Ca2+-Pantothenat, Folsäure, i-Inositol, Niacinamid, Pyridoxin, Riboflavin, Thiamin und Vitamin B12 besteht. Das Medium gemäß Anspruch 14, wobei der anorganische Salz-Bestandteil einen oder mehr anorganische Salze umfasst, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Calciumsalz, CuSO4, FeSO4, KCl, einem Magnesiumsalz, einem Mangansalz, Natriumacetat, NaCl, NaHCO3, NaHPO4, Na2SO4, einem Selensalz, einem Siliziumsalz, einem Molybdänsalz, einem Vanadiumsalz, einem Nickelsalz, einem Zinnsalz und einem Zinksalz besteht. Das Medium gemäß Anspruch 1, wobei das Medium einen zusätzlichen Bestandteil oder mehrere zusätzliche Bestandteile umfasst, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Adenin, Ethanolamin, D-Glucose, N-[2-hydroxyethyl]-piperazin-N'-[ethansulfonsäure] (HEPES), Hydrocortison, Insulin, Liponsäure, Phenolrot, Phosphoethanolamin, Putrescin, Natriumpyruvat, T3, Thymidin, Transferrin, L-Alanin, L-Arginin, L-Asparagin, L-Asparaginsäure, L-Cystein, L-Glutaminsäure, L-Glutamin, Glycin, L-Histidin, L-Isoleucin, L-Leucin, L-Lysin, L-Methionin, L-Phenylalanin, L-Prolin, L-Serin, L-Threonin, L-Tryptophan, L-Tyrosin, L-Valin, Biotin, Cholinchlorid, D-Ca2+-Pantothenat, Folsäure, i-Inositol, Niacinamid, Pyridoxin, Riboflavin, Thiamin, Vitamin B12, einem Calciumsalz, CuSO4, FeSO4, KCl, einem Magnesiumsalz, einem Mangansalz, Natriumacetat, NaCl, NaHCO3, Na2HPO4, Na2SO4, einem Selensalz, einem Siliziumsalz, einem Molybdänsalz, einem Vanadiumsalz, einem Nickelsalz, einem Zinnsalz und einem Zinksalz besteht. Das Medium gemäß Anspruch 1, wobei das Medium die Bestandteile Adenin, Ethanolamin, D-Glucose, N-[2-hydroxyethyl]-piperazin-N'-[ethansulfonsäure] (HEPES), Hydrocortison, Insulin, Liponsäure, Phenolrot, Phosphoethanolamin, Putrescin, Natriumpyruvat, T3, Thymidin, Transferrin, L-Alanin, L-Arginin, L-Asparagin, L-Asparaginsäure, L-Cystein, L-Glutaminsäure, L-Glutamin, Glycin, L-Histidin, L-Isoleucin, L-Leucin, L-Lysin, L-Methionin, L-Phenylalanin, L-Prolin, L-Serin, L-Threonin, L-Tryptophan, L-Tyrosin, L-Valin, Biotin, Cholinchlorid, D-Ca2+-Pantothenat, Folsäure, i-Inositol, Niacinamid, Pyridoxin, Riboflavin, Thiamin, Vitamin B12, ein Calciumsalz, CuSO4, FeSO4, KCl, ein Magnesiumsalz, ein Mangansalz, Natriumacetat, NaCl, NaHCO3, Na2HPO4, Na2SO4, ein Selensalz, ein Siliziumsalz, ein Molybdänsalz, ein Vanadiumsalz, ein Nickelsalz, ein Zinnsalz und ein Zinksalz umfasst. Das Medium gemäß Anspruch 20, wobei das Medium ferner Ascorbinsäure umfasst. Eine Zusammensetzung, die Heparin, EGF, einen Fibroblasten Wachstumsfaktor (FGF) und einen intrazelluläre Niveaus von zyklischem Adenosinmonophosphat (cAMP) erhöhenden Wirkstoff umfasst, wobei der Wirkstoff aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einem &bgr;-Adrenorezeptoragonisten, Choleratoxin, Forskolin, Dibutyryl-cAMP, Isobutylmethylxanthin und Theophyllin besteht und wobei die Zusammensetzung als Ersatz für einen Organ- oder Drüsenextrakt in einem Tierzellen-Kulturmedium dient. Die Zusammensetzung gemäß Anspruch 22, die ferner Ascorbinsäure enthält. Die Zusammensetzung gemäß Anspruch 22, wobei der FGF aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus FGF-1 (aFGF), FGF-2 (bFGF) und FGF-7 (KGF) besteht. Die Zusammensetzung gemäß Anspruch 24, wobei der FGF aFGF ist. Die Zusammensetzung gemäß Anspruch 22, wobei der intrazelluläre Niveaus von cAMP erhöhende Wirkstoff ein &bgr;-Adrenorezeptoragonist ist. Die Zusammensetzung gemäß Anspruch 22, wobei der intrazelluläre Niveaus von cAMP erhöhende Wirkstoff Choleratoxin ist. Die Zusammensetzung gemäß Anspruch 22, wobei der intrazelluläre Niveaus von cAMP erhöhende Wirkstoff Forskolin ist. Die Zusammensetzung gemäß Anspruch 22, wobei der intrazelluläre Niveaus von cAMP erhöhende Wirkstoff Dibutyryl-cAMP ist Die Zusammensetzung gemäß Anspruch 22, wobei der intrazelluläre Niveaus von cAMP erhöhende Wirkstoff Isobutylmethylxanthin ist. Die Zusammensetzung gemäß Anspruch 22, wobei der intrazelluläre Niveaus von cAMP erhöhende Wirkstoff Theophyllin ist. Die Zusammensetzung gemäß Anspruch 26, wobei der intrazelluläre Niveaus von cAMP erhöhende Wirkstoff Isoproterenol ist. Die Zusammensetzung gemäß Anspruch 22, wobei die Zusammensetzung eine 1X-1000X konzentrierte Formulierung ist. Die Zusammensetzung gemäß Anspruch 22, wobei die Zusammensetzung eine 1X konzentrierte Formulierung ist. Die Zusammensetzung gemäß Anspruch 22, wobei die Zusammensetzung eine 100X konzentrierte Formulierung ist. Die Zusammensetzung gemäß Anspruch 22, wobei die Zusammensetzung eine 500X konzentrierte Formulierung ist. Die Zusammensetzung gemäß Anspruch 22, wobei die Zusammensetzung eine 1000X konzentrierte Formulierung ist. Eine Zusammensetzung, die das Kulturmedium gemäß einem der Ansprüche 1–21 und eine tierische Epithelzelle umfasst. Die Zusammensetzung gemäß Anspruch 38, wobei die tierische Epithelzelle aus der Gruppe der tierischen Epithelzellen ausgewählt ist, die aus einem Keratinozyten, einer zervikalen Epithelzelle, einer bronchialen Epithelzelle und einer trachealen Epithelzelle besteht. Die Zusammensetzung gemäß Anspruch 38, wobei die Zelle eine menschliche Zelle ist. Die Zusammensetzung gemäß Anspruch 38, wobei die Zelle eine normale Zelle ist. Die Zusammensetzung gemäß Anspruch 38, wobei die Zelle eine anormale Zelle ist. Die Zusammensetzung gemäß Anspruch 42, wobei die anormale Zelle eine transformierte Zelle, eine etablierte Zelle oder eine aus einer Probe eines erkrankten Gewebes gewonnene Zelle ist. Ein Zellkulturmedium, das durch das Kombinieren des Mediums gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 20 mit Ascorbinsäure gewonnen wird. Ein Verfahren für das Kultivieren einer tierischen Epithelzelle, das die folgenden Schritte umfasst:

(a) In-Kontakt-Bringen der Zelle mit dem Zellkulturmedium gemäß einem der Ansprüche 1–21; und

(b) Kultivieren der Zelle unter Bedingungen, die geeignet sind, die Kultivierung der Zelle zu unterstützen.
Das Verfahren gemäß Anspruch 45, wobei die tierische Epithelzelle aus der Gruppe der tierischen Epithelzellen ausgewählt ist, die aus einem Keratinozyten, einer zervikalen Epithelzelle, einer bronchialen Epithelzelle und einer trachealen Epithelzelle besteht. Das Verfahren gemäß Anspruch 45, wobei die Zelle eine menschliche Zelle ist. Das Verfahren gemäß Anspruch 45, wobei die Zelle eine normale Zelle ist. Das Verfahren gemäß Anspruch 45, wobei die Zelle eine anormale Zelle ist. Das Verfahren gemäß Anspruch 49, wobei die anormale Zelle eine transformierte Zelle, eine etablierte Zelle oder eine aus einer Probe eines erkrankten Gewebes gewonnene Zelle ist. Ein Kit für das Kultivieren einer tierischen Epithelzelle, wobei das Kit ein Trägermittel umfasst, in dem fest eingeschlossen ein Behälter oder mehrere Behälter vorhanden ist/sind, wobei ein erster Behälter das Kulturmedium gemäß einem der Ansprüche 1–21 enthält. Ein Kit für das Kultivieren einer tierischen Epithelzelle, wobei das Kit ein Trägermittel umfasst, in dem fest eingeschlossen ein Behälter oder mehrere Behälter vorhanden ist/sind, wobei ein erster Behälter das Kulturmedium gemäß Anspruch 44 enthält. Ein Kit für das Kultivieren einer tierischen Epithelzelle, wobei das Kit ein Trägermittel umfasst, in dem fest eingeschlossen ein Behälter oder mehrere Behälter vorhanden ist/sind, wobei ein erster Behälter ein Zellkulturmedium enthält, das die Bestandteile Adenin, Ethanolamin, D-Glucose, N-[2-hydroxyethyl]-piperazin-N'-[ethansulfonsäure] (HEPES), Hydrocortison, Insulin, Liponsäure, Phenolrot, Phosphoethanolamin, Putrescin, Natriumpyruvat, T3, Thymidin, Transferrin, L-Alanin, L-Arginin, L-Asparagin, L-Asparaginsäure, L-Cystein, L-Glutaminsäure, L-Glutamin, Glycin, L-Histidin, L-Isoleucin, L-Leucin, L-Lysin, L-Methionin, L-Phenylalanin, L-Prolin, L-Serin, L-Threonin, L-Tryptophan, L-Tyrosin, L-Valin, Biotin, Cholinchlorid, D-Ca2+-Pantothenat, Folsäure, i-Inositol, Niacinamid, Pyridoxin, Riboflavin, Thiamin, Vitamin B12, ein Calciumsalz, CuSO4, FeSO4, KCl, ein Magnesiumsalz, ein Mangansalz, Natriumacetat, NaCl, NaHCO3, Na2HPO4, Na2SO4, ein Selensalz, ein Siliziumsalz, ein Molybdänsalz, ein Vanadiumsalz, ein Nickelsalz, ein Zinnsalz und ein Zinksalz enthält; und ein zweites Trägermittel Heparin, Epidermalen Wachstumsfaktor (EGF), Fibroblasten Wachstumsfaktor (FGF), einen intrazelluläre Niveaus von zyklischem Adenosinmonophosphat (cAMP) erhöhenden Wirkstoff enthält, wobei der Wirkstoff aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einem &bgr;-Adrenorezeptoragonisten, Choleratoxin, Forskolin, Dibutyryl-cAMP, Isobutylmethylxanthin und Theophyllin sowie Ascorbinsäure besteht.






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