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Dokumentenidentifikation DE69837211T2 06.12.2007
EP-Veröffentlichungsnummer 0001025209
Titel EIN AN VERO-ZELLEN ANGEPASSTES ABGESCHWÄCHTES JAPANISCHE ENZEPHALITIS VIRUS UND EIN IMPFSTOFF GEGEN JAPANISCHE ENZEPHALITIS
Anmelder Cheil Jedang Corp., Seoul/Soul, KR;
Walter Reed Army Institute of Research, Washington, D.C., US
Erfinder KIM, Hyun Su, Seoul 134-766, KR;
YOO, Wang Don, Seoul 156-020, KR;
KIM, Soo Ok, Seoul 138-160, KR;
LEE, Sung Hee, Kyungkwido 442-372, KR;
MOON, Sang Bum, Kyungkwido 467-810, KR;
HONG, Sun Pyo, Kyungkwido 449-840, KR;
SHIN, Yong Cheol, Seoul 137-761, KR;
CHUNG, Yong Ju, Seoul 156-011, KR;
ECKELS, Kenneth H., Washington, DC 20307-5100, US;
INNIS, Bruce, Washington, DC 20307-5100, US;
PUTNAK, Joseph R., Washington, DC 20307-5100, US;
BINN, Leonard N., Washington, DC 20307-5100, US;
SRIVASTAVA, Ashok K., Washington, DC 20307-5100, US;
DUBOIS, Doria R., Washington, DC 20307-5100, US
Vertreter Grünecker, Kinkeldey, Stockmair & Schwanhäusser, 80538 München
DE-Aktenzeichen 69837211
Vertragsstaaten BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, IT, LI, NL
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 25.08.1998
EP-Aktenzeichen 989418850
WO-Anmeldetag 25.08.1998
PCT-Aktenzeichen PCT/KR98/00259
WO-Veröffentlichungsnummer 1999011762
WO-Veröffentlichungsdatum 11.03.1999
EP-Offenlegungsdatum 09.08.2000
EP date of grant 28.02.2007
Veröffentlichungstag im Patentblatt 06.12.2007
IPC-Hauptklasse C12N 7/00(2006.01)A, F, I, 20051017, B, H, EP
IPC-Nebenklasse C12N 7/08(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   A61K 39/12(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   

Beschreibung[de]
Hintergrund der Erfindung Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein attenuiertes Japanische-Enzephalitis-Virus, das durch Passagen auf Vero-Zellen an die Vero-Zellen adaptiert ist und einen Japanische-Enzephalitis-Impfstoff, der das besagte attenuierte Virus umfasst.

Beschreibung des Stands der Technik

Japanische Enzephalitis (JE) ist eine von Mücken übertragene Arbovirus-Erkrankung mit einer bedeutenden Tragweite für die Volksgesundheit in Asien. Es wird über mehr als 35.000 Fälle und 10.000 Todesfälle jährlich auf diesem Kontinent berichtet, aber offizielle Berichte unterschätzen zweifellos die tatsächliche Zahl der Fälle (Okuno, T. World Health Stat Q. 3: 120-31, 1978; Umenei, T. et al. Bull World Health Org. 63: 625-31, 1985). Die Krankheit kann sich in einem fieberhaften Kopfschmerzsyndrom, aseptischer Meningitis oder Enzephalitis manifestieren und etwa die Hälfte der Überlebenden neigt dazu, dauerhafte neurologische und psychiatrische Folgeerkrankungen zu haben (Burke, D.S. et al. The Arbovirus: Epidemiology and Ecology 3:63-92, 1988; Monath, T.P. Virology 763-814, 1990).

Beim JE-Virus handelt es sich um eine von 66 Familien von Flaviviren, behüllte, einzelsträngige RNA-Viren positiver Polarität, die größtenteils Vektor-übertragen sind (Chambers, T.J. et al. Ann. Rev. Microbiol. 44: 649-88, 1990). Flaviviren sind morphologisch sphärisch, haben einen Durchmesser von ungefähr 40 nm und bestehen aus einer Lipid-Doppelschicht, die ein Nukleokapsid, das ein Genom von 11 kb, das mit einem Kapsid (C) Protein einen Komplex bildet, enthält, umgibt (Rice, C.M. et al. Science 229: 726-33, 1985). Oberflächenvorsprünge auf der Membran bestehen aus glycosylierten Hüllen- (E-, „envelope") und Membranproteinen (M). Ein Vorläufer des M-Glycoproteins, der in intrazellulären, im Entstehen begriffenen Virionen vorkommt, wird zu dem M-Protein geschnitten, das sich in reifen extrazellulären Virionen findet. Mit dem E-Protein von 53 kd sind wichtige physiologische Aktivitäten einschließlich der Hämagglutination, der Neutralisierung von Viren, des Bindens von Virionen, der Membranfusion und des Bindens von Viren an zelluläre Rezeptoren verbunden (Koshini, E. et al. Virol. 188:714-20, 1992).

Es gibt drei JE-Impfstoffe für Menschen (Tsai, T. et al. Vaccines 671-713, 1993). Von diesen drei ist nur inaktivierter JE-Impfstoff, der in Gehirnen von Mäusen hergestellt wird, international erhältlich. Ein Hersteller, die Research Foundation for Microbial Diseases of Osaka University (Biken) stellt den größten Teil des inaktivierten JE-Impfstoffs, der international abgesetzt wird, her; dieser Impfstoff wurde 1992 in den USA, wo er von den Connaught Laboratories, Inc. als JE-VAXTM vertrieben wird, zugelassen. Inaktivierter und lebend-attenuierter JE-Impfstoff, der in primären Hamsternierenzellen (PHK) hergestellt wird, wird lediglich in China vertrieben.

Inaktivierter JE-Impfstoff, der in Gehirnen von Mäusen hergestellt wird, wurde in Japan 1954 zugelassen. Weil er durch zerebrale Injektion in Babymäuse hergestellt wird, ist er aufwändig herzustellen und es wurden Bedenken bezüglich der Möglichkeit von neurologischen Nebenwirkungen, die mit dem Impfstoff in Verbindung stehen, erhoben. Obwohl fortlaufende Verbesserungen beim Herstellungsprozess seine Reinheit und Wirksamkeit (Oya, A. Vaccination Theory and Practice 69-82, 1975; Oya, A. Acta Pediatr Jpn. 30:175-84, 1988; Takaku, K. Biken J. 11:25-39, 1968) gesteigert haben, wurde bis vor kurzem über eine mäßige Häufigkeit von lokalen und leichten systemischen Reaktionen berichtet (Hoke, C.H. et al. New Engl J Med. 319:608-14, 1988; Poland, J.D. et al. J Infect Dis. 161:878-82, 1990; Sanchez, J.L. et al. Lancet 335:972-73, 1990). Bei 20 der Impfstoffe treten lokale Spannung, Rötung und/oder Schwellung an der Injektionsstelle auf. Über leichte systemische Symptome, hauptsächlich Kopfschmerz, niedriges Fieber, Myalgien, Unwohlsein und gastrointestinale Symptome wird bei 10 bis 30 % der Impfstoffe berichtet. Seit 1989 wurde über ein anscheinend neues Muster von Nebenwirkungen einschließlich Urtikaria, Angioödem, Atemnot, Erythema multiforme, Erythema nodosum und schweren neurologischen Störungen, vorwiegend bei Reisenden, die in Australien, Europa und Nordamerika geimpft wurden, berichtet (Anderson, M.M. et al. Lancet 337:1044, 1991; Ruff, T.A. et al. Lancet 228:881-2, 1991). Darüber hinaus berichtete Ohtaki 1992 und 1995 über sieben Kinder mit akuter disseminierter Enzephalomyelitis (ADEM) mit Veränderungen in den Magnetresonanzbildern (MRI) nach JE-Impfung (Ohtaki, E. et al. Pediatr Neurol. 8:137-9, 1992; Ohtaki, E. et al. J Neurol Neurosurg Psychiatry 59:316-7, 1995). Von Interesse ist auch, dass eine Impfung mit tierischem Hirngewebe, das Tollwutimpfstoff enthielt, zu schweren neurologischen Komplikationen führte (Plotkin, S.A. et al. Vaccines 661-2, 1994). Aus diesem Grund hat die WHO der Entwicklung eines JE-Impfstoffes eine hohe Priorität zuerkannt.

Vor kürzerer Zeit stellte sich heraus, dass der inaktivierte und lebend-attenuierte JE-Impfstoff von China wirksam ist, hohe Titer virusneutralisierender Antikörper hervorbringt und sicheren Schutz gewährt (Tsai, T. el al. Vaccines 671-713, 1993). PHK-Zellen, in denen der chinesische Impfstoff hergestellt wurde, sind jedoch von der Weltgesundheitsorganisation (WHO) nicht für die Herstellung von viralem Impfstoff zugelassen oder von den entwickelten Ländern für die Verwendung an Menschen zugelassen. Der wesentliche Nachteil bei der Verwendung primärer Hamsterzellen für die Herstellung von Impfstoffen ist die Unsicherheit im Hinblick auf die Qualität des Impfstoffs. Auch wenn spezielle, von Krankheitserregern freie Hamster verwendet werden, können die Tiere unerwartet infiziert werden, was für die Herstellung des Impfstoffs problematisch ist. Gelegentlich könnte eine Infektion dieser Art über einen langen Zeitraum unentdeckt bleiben. Mit diesen Kritikpunkten ist es erforderlich, dass weitere kontrollierte Studien der Sicherheit des Impfstoffs Vertrauen im Hinblick auf seinen verbreiteten Gebrauch ermöglichen. Ein weiterer Nachteil der Herstellung von Impfstoff aus primären Zellen besteht in der geringen Ausbeute des Virus und den hohen Kosten, wobei keine Massenproduktion ermöglicht wird.

In Anbetracht des Obigen besteht ein Bedarf nach einem neuen JE-Impfstoff, der in Standardzelllinien wie zum Beispiel in Vero- oder in humanen diploiden Zellen, die als humane Impfstoffsubstrate anerkannt worden sind, hergestellt wird, mit einer guten Kostenrentabilität. Vero-Zellen sind transformierte, aber nicht tumorerzeugende Zellen, die aus Niere vom Affen stammen. Die Vero-Zelllinie ist insofern, als Vero-Zellen leichter an groß angelegte Zellkulturen angepasst werden können und als transformierte Zellen eine unbegrenzte Lebensdauer haben, vorteilhafter als jede anderer Zelllinie.

Es wurde nun festgestellt, dass das JE-Virus in einer Vero-Zellkultur gezüchtet werden kann. Es wurden erhebliche Anstrengungen auf dem Gebiet des JE-Impfstoffs unternommen, um Impfstoff in Standardzellen, die effektive Zellkulturen in großem Umfang ermöglichen, herzustellen. Dennoch hat die Charakterisierung des Virus einschließlich der genetischen Stabilität, der Ausbeute und des für den kommerziellen Einsatz notwendigen Prozesses durch Kultivierung mit Vero-Zellen niemals die Erfordernisse für einen Impfstoff für den Menschen erfüllt. Infolge dieser Tatsachen und der Schwierigkeiten, Kenntnisse, die an anderen Viruskulturen gewonnen wurden, auf das JE-Virus zu übertragen, konnte auf dem bisherigen Stand der Technik kein Erfolg bei der Entwicklung eines Impfstoffs gegen das JE-Virus, der genetisch stabil ist und eine hoch immunogene Eigenschaft besitzt, aus kontinuierlichen Zelllinien heraus erzielt werden. Unter all diesen Untersuchungen hat bis zum jetzigen Zeitpunkt keine zur Herstellung eines neuen Impfstoffs, der die erwähnten Kriterien vor diesem Hintergrund erfüllt, geführt.

Die vorliegende Erfindung schlägt eine Entwicklung und Vermehrung von JE-Viren in einer kontinuierlichen Zelllinie, Vero-Zellen, zur Herstellung eines Impfstoffs, der die früheren Probleme von JE-Virus, das in Gehirn von der Maus oder in primären Zelllinien produziert wurde, bewältigt, vor. Die vorliegende Erfindung zeigt auch eine Methodik, die zum Kultivieren des JE-Virus entwickelt wurde, und ein nachgeschaltetes Verfahren zur kostengünstigen Herstellung von Impfstoff auf.

Darüber hinaus zeigt die vorliegende Erfindung eine Methodik, die gegenüber den früher kommerziell verwerteten JE-Impfstoffen auf die folgenden Arten und Weisen verbessert ist, auf.

  • 1. Sicherheit: Das erfundene Virus erlangte während der Vero-Zellkultivierung keine Virulenz, was die Risiken der Herstellung verminderte und für die Empfänger ein zusätzliches Sicherheitsniveau über das, das durch strenge Kontrolle über den Prozess der Virusinaktivierung bereitgestellt wurde, hinaus bot. Dieser Vorteil wurde von den vorher kommerziell verwerteten JE-Impfstoffen niemals geboten.
  • 2. Gesteigertes Angebot an sichererem Substrat für die Herstellung: Der JE-Impfstoff der vorliegenden Erfindung wird in Abwesenheit von Rinderserum hergestellt, was zu hohen Ausbeuten und zu billiger und skalierbarer Produktion, die mit den früher kommerziell verwerteten JE-Impfstoffen nicht erreicht wurden, führt.
  • 3. Geringeres Hervorrufen von Reaktionen: In den JE-Impfstoff der vorliegenden Erfindung wird kein Gelatine-Stabilisator eingearbeitet, was das Risiko von Impfreaktionen wie denen, die man mit dem vorhandenen Impfstoff sieht (Saskaguchi M. et al. Vaccines 68-69, 1998), vermindert. Darüber hinaus sind unerwünschte, vom Rind stammende Bestandteile, die in den vorhandenen JE-Impfstoffen enthalten sind, in wirksamer Weise eliminiert. Schlüssigerweise wurde dieser Grad an Sicherheit der vorliegenden Erfindung niemals vom früheren JE-Impfstoff bereitgestellt.
  • 4. Gesteigerte Wirksamkeit: Der Erfolg skalierbarer Herstellung mit Vero-Zellen und die Abwesenheit von Zusätzen für die Herstellung und auch die wirkungsvolle Reinigung erlauben die erste Verwendung von starken Hilfsstoffen beim Formulieren des JE-Impfstoffs. Obwohl die Verwendung von Hilfsstoffen in der Formulierung von Impfstoffen bei anderen Impfstoffen eingesetzt wurde, war es schwierig, dieses Wissen auf den JE-Impfstoff zu übertragen, da keiner der vorhandenen JE-Impfstoffe seine sichere Herstellung sicherstellt.

Schließlich führte bis zur jetzigen Zeit keiner der Versuche zu einem neuen Impfstoff, der die oben erwähnten Vorteile bei der Kommerzialisierung von JE-Impfstoff bietet.

Daher ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, einen sicheren und wirksamen JE-Impfstoff, der einem Standardzellsubstrat hergestellt wird, bereitzustellen, um seine Akzeptanz in vielen Ländern zu erhöhen. Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, ein wirksames Verfahren zum Herstellen eines hochgradig gereinigten, stabilen Impfstoffs und zum Formulieren eines Impfstoffs, der mit einer kleinen Antigenmenge hoch immunogene Eigenschaften besitzt, bereitzustellen.

Zusammenfassung der Erfindung

In einem Aspekt stellt die vorliegende Erfindung wie in Anspruch 1 beschrieben ein attenuiertes Japanische-Enzephalitis-Virus, das durch Passagen auf Vero-Zellen an die Vero-Zellen adaptiert ist, bereit. Das attenuierte Japanische-Enzephalitis-Virus der vorliegenden Erfindung, das hier als CJ50003 bezeichnet wird, wurde am 20. April 1998 unter dem Budapester Vertrag über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren in der permanenten Sammlung des Korean Culture Center of Microorganisms, Seoul, Korea hinterlegt und eine Subkultur davon kann unter der Zugangsnummer KCCM-10125 erhalten werden.

In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung einen Impfstoff gegen Japanische Enzephalitis, der ein attenuiertes Japanische-Enzephalitis-Virus, das durch Passagen auf Vero-Zellen an die Vero-Zellen adaptiert ist, umfasst, bereit.

Kurze Beschreibung der Abbildungen

Diese und andere Eigenschaften, Aspekte und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden unter Berücksichtigung der folgenden Beschreibung, der angefügten Ansprüche und der beiliegenden Abbildungen besser verstanden, wie folgt:

1 zeigt Passagen und Adaptation des JE-Virus SA14-14-2(PDK) in Vero-Zellen. Passage 1 des Virus wurde 5 Tage nach der Beimpfung einer Einzelschicht von Vero-Zellen mit einer MOI von 0,1 mit dem Stamm SA14-14-2(PDK) gewonnen. Der Titer des JE-Virus wurde mittels Plaque-Assay auf Einzelschichten von Vero-Zellen gemessen. Es wurden nachfolgende, fortlaufende Passagen bis zu 30 Passagen mit den Viren aus der Viruspassage 1 als Ausgangsmaterial mittels aufeinanderfolgender Virusinfektion und Titration wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt.

2 zeigt die Gewinnung von JE-Virus CJ50003 zu multiplen Zeitpunkten in einer Rollerflasche jeden zweiten Tag von den Tagen 3 bis 17 nach Infektion. Eine Einzelschicht von Vero-Zellen wurde mit einer MOI von 0,01 plaquebildenden Einheiten (PBE) pro Zelle infiziert. Man ließ das Virus 2 Stunden lang bei 35°C adsorbieren, dann wurden die Zellen dreimal mit PBS gewaschen, mit 100 ml serumfreiem EMEM ernährt und bei 35°C inkubiert. Alle 48 Stunden von Tag 3 bis Tag 17 nach der Beimpfung wurden die Überstände der Kulturen mit frischem, von Serum freiem EMEM ersetzt. Titrationen der Infektiosität der Viren in den gewonnenen Materialien wurden durchgeführt, indem Plaque-Untersuchungen auf Einzelschichten von Vero-Zellen vorgenommen wurden.

3 zeigt eine Untersuchung des mit Saccharosegradienten-Ultrazentrifugation gereinigten Virus CJ50003 mittels SDS-PAGE und Western Blotting. Sechzig ml von konzentriertem Kulturüberstand wurden auf 40 ml eines Saccharosegradienten von 15–60 % aufgetragen und in einem 45 Ti Rotor bei 22.000 Upm 18 Stunden bei 12°C zentrifugiert. Proben von zwei ml wurden vom Boden der Röhrchen genommen und einer SDS-PAGE mit einem Gradienten von 4–20 % unterzogen und die aufgetrennten Proteine wurden auf Nitrocellulosemembranen übertragen. Die Proteine wurden durch Färben mit Coomassie-Brillant-Blau (Feld A) oder Silbernitrat (Feld B) sichtbar gemacht und Antigene wurden durch Reaktion mit einem monoklonalen Antikörper, der mit E-Protein von JE-Virus reagiert, sichtbar gemacht (Feld C). Bahn 1: vorgefärbte Proteinstandards (Novex SeeblueTM), die von oben Molekulargewichte von 250, 98, 64, 50, 36, 30, 16 und 6 kDa darstellen; Bahnen 2-10: Fraktionen Nr. 3-11 vom Boden nach Ultrazentrifugation; E: Hüllenprotein; C: Kapsidprotein; M: Membranprotein.

4 zeigt Kinetiken der Formaldehyd-Inaktivierung von gereinigtem JE-Virus CJ50003. Gereinigte Zubereitungen von JE-Virus wurden bei 4°C oder bei 22°C mit 0,018 % Formaldehyd inaktiviert. Proben, die zu den angegebenen Zeiten genommen worden waren, wurden durch direkte Plaque-Untersuchungen auf Einzelschichten von Vero-Zellen auf verbleibendes, infektiöses Virus titriert. Zusätzlich wurde ein Amplifikationstest wie folgt vorgenommen, um niedrige Virusspiegel nachzuweisen: Doppelte Kolben, die Einzelschichten von Vero-Zellen enthielten, wurden mit Proben von den Zeitpunkten der Viren-Inaktivierung beimpft. Nach einer Adsorptionsperiode von 2 Stunden bei 35°C wurden die Zellen erneut ernährt und bei 35°C inkubiert. Die Zellen wurden 7 Tage und 14 Tage nach der Infektion erneut ernährt. Die Kulturmedien wurden gewonnen und Plaque-Untersuchungen unterzogen, um infektiöses Virus nachzuweisen. Es werden die Zeitpunkte der Inaktivierung aus zwei getrennten Experimenten gezeigt: 4°C (ausgefüllte Rechtecke), 22°C (ausgefüllte Kreise). Gleichzeitig wurden thermale (ohne Formaldehyd) Inaktivierungskontrollen (offene Rechtecke für 4°C und offene Kreise für 22°C) durchgeführt.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft einen JE-Virusstamm, der wünschenswerte Eigenschaften für die Herstellung des JE-Impfstoffs besitzt. Besagtes Virus ist ein attenuiertes Virus und kann sich in der kontinuierlichen Zelllinie Vero, die von der WHO als Zellsubstrat zur Herstellung von Impfstoff für Menschen zugelassen ist, vermehren. Somit wird erwartet, dass besagtes Virus für Herstellung von inaktivierten und lebenden JE-Impfstoffen, die sicherer als die derzeitigen Impfstoffe sind, verwendet werden kann.

Die vorliegende Erfindung stellt einen Impfstoff, der den gegenwärtigen Bedarf befriedigt, bereit. Ein JE-Virus wurde an Vero-Zellen durch aufeinandertolgende Passagen bei höchstens 35°C adaptiert. Fortgesetzte Passagen in Vero-Zellen führten zu einer Steigerung beim Virustiter über 107 PBE pro ml Kulturüberstand und verringerten die Zeit in der Kultur, bis sich ein Gipfel des Virustiters zeigte. Die Erfindung betrifft die Entwicklung eines Verfahrens zum Gewinnen von Material zu mehreren Zeitpunkten, das ohne Erfordernis von Serum als Ergänzung zu einem hohen Gewinn an Virusproduktivität führte, was kommerziell realisierbare Eigenschaften für die kostengünstige Produktion des besagten Impfstoffs in großem Maßstab bedeutet. Gemäß der Erfindung ist das Verfahren der mehrfachen Gewinnung von Material bei der Kultivierung des Virus für den verminderten Grad des zytopathischen Effekts (CPE) der infizierten Zellen verantwortlich. Der JE-Impfstoff der vorliegenden Erfindung enthält infolge des verminderten Grades des CPE eine extrem kleine Menge von restlichen Bestandteilen, die von den Zellen stammen. Darüber hinaus wird erwartet, dass der JE-Impfstoff der vorliegenden Erfindung eine verbesserte Immunogenität und größeren Schutz gegen die Erkrankung als gegenwärtige JE-Impfstoffe bietet. Der gereinigte JE-Impfstoff der vorliegenden Erfindung weist gegenüber gegenwärtigen Impfstoffen einen wesentlichen Vorteil dahingehend auf, dass die gereinigten Viren aus den kultivierten Vero-Zellen den Anforderungen an die Entwicklung eines Impfstoffes für Menschen genügen.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verfahren zur Herstellung des besagten Impfstoffs. Die Verfahren können eine hohe Produktivität, Reinheit und Wirksamkeit des besagten Wirkstoffs bieten. Man erhält das JE-Virus CJ50003, indem man JE-Virus SA-14-14-2(PDK) 4 oder mehr Passagen zur Adaptation in Vero-Gewebekulturzellen bei Temperaturen von höchstens 35°C unterzieht und das kultivierte Virus selektiert, während man die Vermehrung des Virus basierend auf der Zahl der Herde, die in Vero- und/oder LLC-MK2-Zellen gebildet wurden, überwacht. Das Virus, das man aus dieser Adaptation erhält, weist in Vero-Zellkultur einen Gipfeltiter von mindestens 1×107 PBE/ml Kulturüberstand und eine verkürzte Inkubationsperiode zum Gewinnen von Material auf. Das JE-Virus SA-14-14-2(PDK) ist ein attenuierter Stamm, der durch Adaptieren eines Wildtyp-JE-Virus SA14 aus der Mücke in der primären Gewebekulturzelle aus Niere vom Hamster (PHK) und der primären Gewebekulturzelle aus Niere vom Hund (PDK) gewonnen wird (Kenneth H. Eckels, et al. Vaccine 6 513-518, 1988). Aber die PHK- und PDK-Zellen sind von der WHO nicht zugelassen, somit sind sie zur Herstellung von Impfstoffen, die an Menschen angewendet werden können, nicht geeignet. Die Vero-Zelle ist von der WHO zur Verwendung beim Menschen zugelassen, somit ist der an Vero adaptierte JE-Virusstamm CJ50003 eine gute Basis für die Herstellung eines Impfstoffs für Menschen.

Es ist bekannt, dass das SA-14-14-2(PDK)-Virus zu den Flaviviren gehört und die folgenden physikochemischen Eigenschaften besitzt: einzelsträngig, RNA-Genom positiver Polarität mit einem methylierten 5'-Ende und einem 3'-Ende ohne poly-A-Struktur. Die Größe des RNA-Genoms beträgt etwa 11 kb und das Genom liegt kombiniert mit dem Nukleokapsidprotein (C) von 13.500 Da vor. Das Virus umfasst zusätzlich das Membranprotein (M) von 8.700 Da, das Hüllenprotein (E) von 53.000 Da und die nicht strukturellen Proteine NS1, 2a, 2b, 3, 4a, 5 und Ähnliches.

Der an Vero adaptierte JE-Virusstamm CJ50003 wurde über mehr als 30 Passagen in Vero-Zellen vermehrt. Der Virustiter und die Morphologie der Plaques änderten sich während der Passagen nicht, was darauf hindeutet, dass das Virus eine stabile phänotypische Beschaffenheit aufweist.

Um einen Einblick in die molekularen Grundlagen der biologischen Charakteristika des JE-Virus CJ50003 zu erhalten, wurden die physikochemischen Eigenschaften des Virus untersucht. Die Basensequenz des Virusgenoms wurde mittels Klonierung und Sequenzierung der cDNA bestimmt. Als Ergebnis wurde festgestellt, dass drei Adeninbasen an den Positionen 1032, 1506 und 1704 und eine Guaninbase an der Position 1769 des Gens für das E-Protein des JE-Virus SA14-14-2(PDK) durch drei Guanine beziehungsweise ein Thymin im JE-Virus CJ50003 ersetzt wurden. Dementsprechend wurde die Aminosäuresequenz des E-Proteins von Threonin an Position 19, Threonin an Position 177, Lysin an Position 243 und Glutamin an Position 264 zu Alanin, Alanin, Glutamat beziehungsweise Histidin abgeändert. Die Aminosäureaustausche im E-Protein blieben während der Passagen in Vero-Zellen erhalten, solange unsere Untersuchung dauerte.

Das Virus CJ50003 tötete Mäuse nicht, wenn die Viren, die eine unterschiedliche Zahl von Passagen auf Vero-Zellen aufwiesen, jungen Mäusen intracerebral injiziert wurden. Folglich kann festgestellt werden, dass das Vero-adaptierte JE-Virus CJ50003 ein attenuierter und stabiler Virusstamm, der keine oder eine geringe Neurovirulenz aufweist, ist. Es ist einer der kritischen Punkte, um besagtes Virus als Lebend-JE-Virus-Impfstoff und/oder als inaktivierten Impfstoff zu verwenden.

Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zum Reinigen des Virus aus der Zellkultur ohne Einfrieren der rohen oder zwischengereinigten Materialien bereit. Das besagte Verfahren umfasst die Schritte des Entfernens von Zellfragmenten, des Konzentrierens des Virus, des Reinigens des Virus durch Präzipitation der Materialien zellulärer Herkunft und Saccharosegradienten-Ultrazentrifugation, des Fraktionierens der Gradienten und des Untersuchens der Fraktionen auf Virus. Genauer stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von gereinigtem JE-Virus durch Vermehren des Virus auf hohe Titer in kontinuierlichen Zelllinien in Gegenwart oder Abwesenheit von Zusätzen von Serumprotein, durch Reinigen des Virus durch Ultrazentrifugation und durch Zusammenfassen der viruspositiven Fraktionen bereit.

Das besagte Virus wird in Vero-Gewebekulturzellen vermehrt. Die in Rollerflaschen konfluent gewachsenen Vero-Zellen werden mit dem Virus CJ50003 infiziert und inkubiert. Die Gewinnung des Virus kann durch das Verfahren der multiplen Gewinnung durchgeführt werden. Die Entnahme des Kulturüberstands wurde zum Zeitpunkt von 2 oder 3 Tagen nach der Infektion entsprechend der MOI der Infektion begonnen und die Kultur wurde erneut mit frischem Medium versorgt. Nach einer Inkubation der erneut mit Nährlösung versorgten Kultur von 2 Tagen wurde der Kulturüberstand wieder abgenommen. Die Gewinnung kann bis zu 4-mal in 8 oder 9 Tagen nach der Infektion wiederholt weiden, wobei der Virustiter über 107 PBE/ml Kulturüberstand blieb. Das Verfahren der multiplen Gewinnung ergab eine hohe Virusausbeute pro Einheit einer Rollerflasche, somit macht sie diese Erfindung mit den Gesetzen des Marktes verträglicher. Weiterhin ist das Verfahren für den verminderten Grad des CPE der infizierten Zellen verantwortlich. Der verminderte Grad des CPE trägt zum extrem niedrigen Spiegel von restlichen, von Zellen stammenden Bestandteilen im JE-Impfstoff der vorliegenden Erfindung bei. Die gewonnenen Kulturüberstände konnten bei 4°C aufbewahrt werden, bis die Reinigung begann. Die Klärung der gewonnenen Kulturüberstände kann durch gebräuchliche Verfahren, die im Fachgebiet bekannt sind, einschließlich einer Zentrifugation mit niedriger Geschwindigkeit, zum Beispiel 10 Minuten lang bei 1500 g und/oder durch Filtration durch einen Filter mit einer Porengröße von 0,45 bewerkstelligt werden. Die gewonnene Kulturflüssigkeit wird bis zur Konzentration bei 4°C aufbewahrt. Zur Konzentration des Virus wird die Kulturflüssigkeit ultrafiltriert und das Retentat wird gesammelt. In einem anderen Verfahren zur Konzentration wird Polyethylenglycol (PEG) 8000 in der Kulturflüssigkeit bis zu 10 % gelöst und das Präzipitat wird in einem geeigneten Puffer, zum Beispiel in phosphatgepufterter Salzlösung (PBS, pH 7,0) gelöst. Zum Entfernen von DNA und anderen Materialien, die von den Zellen stammen, wird die Protaminsulfatfällung durchgeführt, was durch Zugabe von Protaminsulfat zur konzentrierten Viruslösung und Zentrifugation mit hoher Geschwindigkeit, zum Beispiel 5 Minuten lang bei 12.000 g, bewerkstelligt werden kann. Zur weiteren Reinigung des Virus wird eine Dichtegradientenultrazentrifugation auf kontinuierlichen Saccharosegradienten von 15–60 % oder auf diskontinuierlichen Saccharosegradienten durchgeführt. Der Saccharosegradient wird fraktioniert und die Fraktionen werden auf das Virus untersucht. Verfahren zum Untersuchen auf viruspositive Fraktionen beinhalten Plaque-Assay, Hämagglutinationsuntersuchung, Polyacrylamidgel-Elektrophorese und Antigenuntersuchungen wie zum Beispiel Immunoassays. Die Fraktionen zur weiteren Verarbeitung werden basierend auf hohem Virustiter und geringem Maß an anderen Verunreinigungen vereinigt. Die Reinheit von vereinigtem und gereinigtem Virus wurde mittels Untersuchung auf chromosomale DNA und Protein, das von Vero-Zellen stammte, bewertet. Die Ergebnisse zeigten, dass der Gehalt an zellulärer Wirts-DNA und Protein nur 2,5 pg beziehungsweise 2 ng pro 5 &mgr;g gereinigten JE-Virus beträgt, was zeigte, dass die oben beschriebenen Reinigungsverfahren andere Verunreinigungen aus dem viralen Antigen wirksam entfernten. Die Ausbeute von JE-Virus aus 1 l infizierter Kulturflüssigkeit wird auf etwa 2,3 Milligramm veranschlagt.

Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zum Inaktivieren von JE-Virus bereit, um seine Infektiosität zu zerstören, während seine Antigenität erhalten bleibt. Das besagte Verfahren umfasst das Zugeben einer wirksamen Menge von Formaldehyd und das Inkubieren des besagten Virus mit dem besagten Agens unter bestimmten Umständen, so dass das besagte Virus inaktiviert wird. Genau dargestellt wurden die vereinigten Fraktionen mit einem geeigneten Puffer wie zum Beispiel PBS auf eine geeignete Proteinkonzentration verdünnt und Formaldehyd wurde zu der verdünnten Vereinigung der Fraktionen gegeben. Die Inkubation mit Formaldehyd wurde bei 22°C oder bei 4°C vorgenommen. Es wurden mindestens 4 oder 46 Tage bei 22°C beziehungsweise 4°C benötigt, um die virale Infektiosität ohne Verlust von viraler Antigenität völlig zu zerstören. Vorzugsweise wurde das Verfahren zur Inaktivierung des JE-Virus bei 22°C aufgrund der Einfachheit bei Kulturen in großem Maßstab gewählt und die Inkubationszeit wurde für einen Sicherheitsrahmen auf 7 Tage ausgedehnt. Beispiele von inaktivierenden Wirkstoffen, die wirksam waren, beinhalten jedoch Formaldehyd, sind aber nicht darauf beschränkt. Im Allgemeinen kann dies durch chemische oder physikalische Mittel erreicht werden. Eine chemische Inaktivierung kann durch Behandeln der Viren zum Beispiel mit Enzymen, &bgr;-Propiolacton, Ethylenimin oder einem Derivat davon und einem organischen Lösungsmittel wie zum Beispiel Tween, Triton, Natriumdesoxycholat und Sulfobetain bewirkt werden. Wenn nötig, wird die inaktivierende Substanz danach neutralisiert; Material, das mit Formaldehyd inaktiviert wurde, kann zum Beispiel mit Thiosulfat neutralisiert werden. Physikalische Inaktivierung kann vorzugsweise vorgenommen werden, indem die Viren einer energiereichen Strahlung wie zum Beispiel UV-Licht, Röntgenstrahlung oder Gamma-Strahlung ausgesetzt werden.

Die JE-Impfstoffe werden als injizierbare Flüssigkeiten hergestellt, entweder als flüssige Lösung oder als Suspension. Es ist möglich, einen stabilisierenden Wirkstoff wie zum Beispiel Kohlenhydrate (Sorbit, Mannit, Stärke, Saccharose, Dextran, Glucose, etc.), Proteine (Albumine, Casein, etc.), einen Wirkstoff, der Proteine enthält (Rinderserum, Magermilch, etc.) und Puffer (wie zum Beispiel Alkalimetallphosphat) zuzugeben. Die Aufbereitung kann nach Zugabe eines Stabilisators lyophilisiert werden und sie kann im Vakuum oder unter Stickstoff gelagert werden. Wenn gewünscht können eine oder mehrere Verbindungen mit einer unterstützenden Wirkung zugegeben werden. Geeignete Verbindungen für diesen Zweck sind zum Beispiel: Aluminiumhydroxid, Phosphat oder Oxid, Mineralöl (wie zum Beispiel Bayol, Marcol 52) und Saponine. Zusätzlich werden, wenn gewünscht, ein oder mehrere Emulgierungsmittel wie zum Beispiel Tween oder Span zu den Virusmaterialien gegeben.

Die Wirksamkeit eines Hilfsstoffs wurde festgestellt, indem die Menge der neutralisierenden, gegen das Virus gerichteten Antikörper, die auf die Verabreichung des inaktiven Virus in Impfstoffen, die auch an ein Adjuvans absorbiert werden, zurückzuführen sind, gemessen wurde. Beispiele eines Hilfsstoffs, der wirksam war, schließen Aluminiumhydroxid („alum hydroxide") ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Der erhaltene Impfstoff wurde durch den Plaque-Reduktions-Neutralisationstest (PRNT) mit den Seren von Mäusen, die mit dem besagten Impfstoff immunisiert worden waren, und durch direkte Konfrontation immunisierter Mäuse mit einem neurovirulenten Virus auf Wirksamkeit untersucht. Als Ergebnis wurde gezeigt, dass der besagte Impfstoff die gleiche oder eine bessere Wirksamkeit als vergleichbare Impfstoffe beim Hervorbringen von neutralisierendem Antikörper hatte.

Um mögliche Änderungen der Immunogenität von Viren, die mit einer unterschiedlichen Zahl von Passagen an Vero adaptiert waren, zu untersuchen, wurden die Impfstoffe mit einer verschiedenen Zahl von Passagen hergestellt und die Wirksamkeit eines jeden Impfstoffs wurde verglichen. Es gab trotz aufeinanderfolgender Passagen auf Vero-Zellen keinen bemerkenswerten Unterschied bei der Wirksamkeit unter den Impfstoffen, die aus Viren mit unterschiedlichen Zahlen von Passagen hergestellt worden waren. Somit kann festgestellt werden, dass der an Vero adaptierte JE-Virusstamm CJ50003 eine stabile Immunogenität aufweist.

Die folgenden Beispiele erläutern das attenuierte, an Vero-Zellen adaptierte JE-Virus gemäß der vorliegenden Erfindung und den JE-Impfstoff, der gemäß der vorliegenden Erfindung das besagte attenuierte Virus umfasst. Aufgrund der vorangehenden Beschreibung und den folgenden Beispielen wird angenommen, dass Fachleute imstande sind, die Erfindung in vollem Umfang auszuführen.

BEISPIEL 1 Adaptation des Virus SA1414-2(PDK) an Vero-Zellen

JE SA14-14-2(PDK), Virus SA14-14-2 nach Passage 8 in Nierenzellkultur vom Hund, wurde verwendet, um fortlaufende Passagen in Vero-Zellkultur einzuleiten. Die Einzelschichten von Vero-Zellen wurden mit JE SA14-14-2(PDK) bei einer MOI von 0,1 PBE pro Zelle beimpft. Die infizierten Zellkulturen wurden in Kulturflaschen mit 25 cm2, die 5 ml Nährmedium, das aus Eagle's minimalem essentiellen Medium, das mit 10 % fetalem Rinderserum ergänzt worden war, bestand, enthielten, in einer Atmosphäre von etwa 5 % CO2 in Luft und bei einer Temperatur von nicht über etwa 35°C, üblicherweise von ungefähr 32°C bis ungefähr 35°C, wobei ungefähr 35°C bevorzugt wurden, angezogen. Das Virenwachstum wurde durch mikroskopische Beobachtung des zytopathischen Effekts (CPE) und verschiedene Untersuchungen auf die Anwesenheit von viralem Antigen einschließlich Hämadsorptionstest (HA), Plaque-Assay und Festphasen-Enzymimmunoassay (ELISA) überwacht. JE-Virus wurde am Tag 5 nach der Infektion, als die Kultur einen Gipfelpunkt des Virustiters zeigte, gewonnen und durch Zentrifugation geklärt. Die einzelne Plaque wurde vom geklärten Überstand gereinigt und in Vero-Zellen vermehrt. Das vervielfältigte Virus wurde erneut zur Infektion von Vero-Zellen für weitere Passagen benutzt. Nachfolgende, fortlaufende Passagen wurden bis zu 30 Passagen durch aufeinanderfolgende Infektionen mit Virus, Titration und Plaquereinigung wie oben beschrieben durchgeführt. Wie in 1 gezeigt erreichten die Virustiter mit 4 Passagen in Vero-Zellen etwa 4×107 PBE pro ml Kulturüberstand und bleiben in weiteren Passagen nahe bei diesem Spiegel. Außerdem wurde die optimale Periode zur Gewinnung von Viren von 5 Tagen bei Passage 1 auf 2–3 Tage bei Passage 4 verringert. Ein erheblicher Anstieg bei der Virusausbeute, ungefähr 105 PBE/ml bis über 107 PBE/ml und eine Abnahme der Inkubationszeit führten zur Wahl der JE-Passage 4 in Vero-Zellen als Ausgangsmaterial der Wahl zur Herstellung eines Kandidaten für einen JE-Impfstoff. Die JE-Passage 4 in Vero-Zellen wurde als CJ50003 (Vero, PS4) gekennzeichnet. Die Abkürzung PS bedeutet die Zahl der Viruspassagen in der bezeichneten Zelle.

BEISPIEL 2 Charakterisierung des Virus CJH50003; Sequenzierung des Hüllengens und Untersuchung der Neurovirulenz

Als Versuch, einen Einblick in die molekularen Grundlagen für die biologischen Eigenschaften des Stammes CJ50003 zu geben, wurde die Sequenz von 1500 Nukleotiden, die für das Gen der Hülle (E) codiert und bedeutende neutralisierende Epitope besitzt, bestimmt und mit denen von den Impfstämmen, von denen er abstammt, SA14-14-2(PDK), SA14-14-2(PHK) und von einem Wildtyp-Stamm des Virus SA14 (Aihira, S. et al. Virus Genes, 5:95-109, 1991; Ni, H. et al. J Gen Virol. 76:401–407, 1995; Ni, H. et al. J Gen Virol. 76:409–413, 1995; Nitayaphan, S. et al. Virology 177:541–542, 1990) verglichen. Für die Sequenzanalyse wurde Virus CJ50003 (Vero, PS4) verwendet. Dies zeigte, dass die C-terminale Region (Aminosäuren 280-500) vollständig konserviert ist, während die N-terminale Region (Aminosäuren 1-279) Sequenzvariationen unter den Virusstämmen zeigt. Die Mutationen in der N-terminalen Region sind nahezu gleichförmig verteilt. Die Nukleotidsequenz des Gens für das E-Protein von CJ50003 unterschied sich von SA14/CDC in 8 Nukleotiden und 7 Aminosäuren, während sich SA14-14-2(PDK) von SA14/CDC in 7 Nukleotiden und 5 Aminosäuren unterschied. Die Ergebnisse wurden in Tabelle 1 zusammengefasst.

Die Sequenz des Virus CJ50003 unterschied sich von der veröffentlichten Sequenz das Virus SA14-14-2(PDK) an 5 Positionen: Nukleotidaustausche an den Positionen 1032, 1506, 1704 und 1769 führten zu 4 Unterschieden bei Aminosäuren zwischen den Viren SA14-14-2(PDK) und CJ50003; Nukleotidaustausche an der Position 989 führen zu keiner Substitution einer Aminosäure. Höhere Passagen des Virus CJ50005, das heißt Passage 15 oder 30 zeigten keine weiteren Austausche von Nukleotiden. Daher gab es 5 verschiedene Nukleotid- und 4 Aminosäureaustausche zwischen CJ50003 und dem Virus SA14-14-2(PDK), von dem es abstammt, und diese Änderungen waren bei der Passage dieses Virus in der Zellkultur stabil. Der Lys-Rest an Position 243 in SA14-14-2(PDK), der im Vergleich mit anderen attenuierten JE-Viren einzigartig unterschiedlich ist, wurde in CJ50003 mit einem Glu-Rest substituiert.

Die Sequenz von CJ50003 unterschied sich auch von der veröffentlichten Sequenz des Virus SA14-14-2(PHK) (Aihira, S. et al. Virus Genes, 5:95–109, 1991). Die Nukleotidabweichung an Position 1032 führte zu einem Aminosäureaustausch an Position E19, aber der Austausch an der Nukleotidposition 989 führte zu keiner Substitution einer Aminosäure. Die Nukleotide an den Positionen 1506 und 1704 im Virus CJ50003 entsprachen denen, die in SA14-14-2(PHK) an diesen Positionen vorlagen, während sie sich von denen in SA14-14-2(PDK) an diesen Positionen unterschieden. Das Muster der Substitutionen in den N-terminalen Regionen der E-Gene von CJ50003 und SA14-14-2(PHK) ist fast dasselbe, mit Ausnahme der Aminosäuresubstitution an Position E19.

Die Viren SA14-14-2(PHK), SA14-14-2(PDK) und CJ5003 haben im Vergleich mit der Sequenz des Virus SA14, von dem sie abstammen, 4 identische Substitutionen von Aminosäuren an den Positionen E107, E138, E176 und E279. Darunter waren die Aminosäuren an den Positionen E138 und E176 (Ni, H. et al. J Gen Virol. 76:409–413, 1995), von denen bekannt ist, dass sie zur Abschwächung beitragen, nach der Adaptation an Vero noch konserviert, was darauf hindeutet, dass CJ50003 seinen attenuierten Charakter nicht verloren hat.

CJ50003 und SA14-14-2(PDK), von dem es abstammt, wurden mittels intracerebraler (i.c.) Injektion in 4 Wochen alte BALB/c-Mäuse auf ihre Neurovirulenz für Mäuse untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt. Die Letalität für junge erwachsene Mäuse, die im Vergleich zu der des Wildtyp-Virus SA14 sehr niedrig ist, ist zwischen SA14-14-2(PDK) und CJ50003 nicht signifikant unterschiedlich. Somit scheint es so zu sein, dass das Einschleusen in das Vero-Zellsubstrat nicht einen neurovirulenten Phänotyp von SA14-14-2(PDK) hervorbrachte und dass das Virus CJ50003 noch einen attenuierten Charakter hat.

Tabelle 2. Intracerebrale Virulenz bei 4 Wochen alten Mäusen, denen CJ50003-Viren nach Passagen in Vero eingeimpft wurden. PS stellt die Passage in PDK- oder Vero-Zellen dar.

  • a: Kenneth H. Eckels et al(Vaccine 6: 513–518, 1988).
  • b: 0/10 Mäuse starb nach dem Einimpfen von unverdünntem Virus.

Das Volumen des Inokulums für die i.c.-Injektion beträgt 0,03 ml pro Maus.

BEISPIEL 3 Wachstum des Virus und Reinigung

Die Keime zur Herstellung wurden in der Viruspassage 5 in Vero-Zellen [CJ50003 (Vero, PS5)] hergestellt und im Tiefkühlschrank gelagert. Vero-Zellen wurden in Eagle's minimalem essentiellen Medium (EMEM, Gibco), das 10 % fetales Rinderserum (FBS, Gibco) enthielt, angezogen. Rollerflaschenkulturen von Einzelschichten von Vero-Zellen wurden mit Virus zur Herstellungssaat bei einer MOI von 0,01 bis 0,1 PBE pro Zelle infiziert. Nach einer Virusadsorption von 2 Stunden wurden die Kulturen 3-mal mit PBS gewaschen und mit EMEM, das kein Serum enthielt, versorgt und bei 35°C inkubiert. In infizierten Vero-Zellkulturen erreichte das Virus 2 oder 3 Tage nach der Infektion Titer von ungefähr 107 bis 108 PBE/ml. Obwohl bis 8 oder 9 Tage nach der Infektion beginnend am Tag 2 oder 3 nach der Infektion in Intervallen von 2 Tagen 4-mal Viren abgenommen wurden, wurden dennoch Virustiter über 107 PBE/ml mit sehr schwachem CPE aufrechterhalten. Aber nach 9 Tagen nach der Infektion lagen die Titer unter 107 PBE/ml (2). Die gesammelten Produkte wurden bei 8.000 Upm 15 Minuten lang zentrifugiert und die Überstände wurden durch einen Filter von 0,45 &mgr;m gefiltert. Die Überstände der Viruskulturen wurden durch Ultrafiltration (Ultrasette, Filtron, 100k) oder durch Präzipitation mit PEG konzentriert. Durch PEG präzipitiertes Virus wurde durch Zentrifugation gesammelt und in PBS oder STE-Puffer (10 mM Tris pH 7,2, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl) suspendiert. Das Retentat wurde nach der Ultrafiltration auf 250 ml eingeengt und die Kassette wurde mit 100 ml PBS gewaschen. Nach Zugabe von 0,5–2 mg/ml Protaminsulfat wurden die Viruskonzentrate 2 Stunden lang in Eis gekühlt und es wurden durch 5 Minuten Zentrifugation bei 10.000 Upm Überstände gewonnen. Die konzentrierten Viren wurden durch Ultrazentrifugation auf Saccharosegradienten gereinigt. Die Ultrazentrifugation wurde bei 38.000 g 18 Stunden lang durchgeführt. Die Fraktionen wurden einer Elektrophorese auf Polyacrylamidgelen, die das Detergens Natriumdodecylsulfat enthielten, unterzogen (SDS-PAGE). Die Banden des Nukleokapsidproteins (C, 13.500 Da), des Membranproteins (M, 8.700 Da) und des Hüllenproteins (E, 53.000 Da) waren in der SDS-PAGE (3, Feld A) zu erkennen. Hüllenantigene (E) wurden durch Western Blotting mit monoklonalem Antikörper gegen JE-Virus von der Maus nachgewiesen. Viruspositive Fraktionen, Fraktionen Nr. 4 bis 9, in denen mit Ausnahme von viralen Proteinen andere Proteinbanden in silbergefärbten Gelen nicht sichtbar waren (3, Feld B), wurden zusammengefasst und mit dem Verfahren von Lowry auf Proteinkonzentration untersucht. Es werden ausführliche Ergebnisse aus zwei Reinigungen aus infizierten Vero-Kulturen, die entweder mit Tangentialfluss-Ultrafiltration oder durch Präzipitation mit PEG8000 konzentriert wurden, gezeigt (Tabellen 3 und 4). Gereinigtes Virus wurde mit dem doppelten Volumen PBS verdünnt, zu den endgültigen 0,01 % Tween80 gegeben und durch einen Filter von 0,22 &mgr;m gefiltert.

Tabelle 3. Reinigung von JE-Virus durch Konzentration mit Tangentialfluss-Ultrafiltration.

Tabelle 4. Reinigung von JE-Virus durch Konzentration mit Präzipitation mit PEG8000.

Die Viruszubereitungen wurden unter Verwendung von Messungen der spezifischen Aktivität (das heißt PBE/mg Protein) im Hinblick auf ihre relative Reinheit verglichen. Virus, das durch Ultrafiltration aus dem Konzentrat gereinigt worden war, hatte ungefähr die gleiche Aktivität wie Virus, das durch Präzipitation mit PEG8000 aus dem Konzentrat gereinigt worden war. Es wurde auch die Reinheit der zusammengefassten, gereinigten Viren beurteilt, indem auf chromosomale DNA und Protein, die von Vero-Zellen stammten, untersucht wurde. Die Ergebnisse zeigten, dass ungeachtet des Reinigungsverfahrens der Gehalt von DNA und Protein von Wirtszellen lediglich 2,5 pg beziehungsweise 2 ng pro 5 &mgr;g von gereinigtem JE-Virus betrug, was zeigte, dass beide oben beschriebenen Reinigungsverfahren andere Verunreinigungen aus dem viralen Antigen wirksam entfernten. Hinsichtlich der Proteinausbeute von gereinigtem Virus ist das Reinigungsverfahren, welches die Ultrafiltration verwendet, jedoch 2-fach besser als das Reinigungsverfahren, das mit Präzipitation mit PEG8000 verbunden ist.

BEISPIEL 4 Inaktivierung des Virus

Gereinigtes Virus wurde entweder direkt zur Herstellung von attenuiertem Lebendimpfstoff nach Dialyse mit PBS verwendet oder mit Formaldehyd zur Herstellung von inaktiviertem Impfstoff inaktiviert. Die Inaktivierung mit 0,018 % Formaldehyd wurde bei 22°C oder 4°C durchgeführt. In regelmäßigen Intervallen wurden Proben genommen und mittels Plaquetitration (4) direkt auf infektiöses Virus untersucht. Proben, die in der direkten Plaque-Untersuchung negativ waren, wurden einer blinden Passage auf Einzelschichten von Vero-Zellen unterzogen, um niedrige Virusspiegel zu vervielfältigen und dann erneuten Plaque-Untersuchungen unterzogen. Es wurde festgestellt, dass 4 Tage bei 22°C oder 46 Tage bei 4°C für eine vollständige Inaktivierung der Infektiosität erforderlich waren (Tabellen 5 und 6). Die Antigenität des Virus wurde während der Inaktivierung durch Untersuchen von Proben mit dem "Antigen-Spot-Blot-Assay" und polyklonalen Antiseren überwacht. Dieser Untersuchung zufolge schien es keine nachweisbaren Verluste bei der Antigenität nach der Einwirkung von 0,018 % Formaldehyd von bis zu 10 Tagen bei 22°C oder 15 Tagen bei 4°C zu geben.

Die Inaktivierung mit Formaldehyd wurde unter diesen Bedingungen mindestens 7 Tage lang bei 22°C oder 60 Tage bei 4°C durchgeführt, was einen Sicherheitsrahmen ergab. Nach der Inaktivierung wurde freier Formaldehyd in den Proben durch die Zugabe von 0,038% Natriummetabisulfit neutralisiert. Es wurde nebenläufig eine Dialyse mit PBS durchgeführt und dann durch einen Filter von 0,22 &mgr;m gefiltert.

Tabelle 5: Inaktivierung von JE-Virus CJ50003 mit Formaldehyd bei 4°C

Tabelle 6: Inaktivierung von JE-Virus mit Formaldehyd bei 22°C

BEISPIEL 5 Immunogenität des gereinigten, inaktivierten Virus (PIV) CJ50003 und lebend-attenuierten Virus (LAV) in Mäusen

Die Immunogenitäten von LAV und PIV wurden dann an Mäusen mit vorher kommerzialisiertem inaktiviertem Impfstoff von Biken untersucht. Gruppen von 20 sechs Wochen alten BALB/c-Mäusen wurden intraperitoneal mit drei Arten von Immunogenen immunisiert. Die Immunisierung wurde mit zwei Impfungen ohne Adjuvans im Abstand von 2 Wochen vorgenommen. Zwei Wochen nach der zweiten Immunisierung wurden von jeder Gruppe von Mäusen Seren gewonnen, zusammengefasst und anschließend mit dem PRNT-Verfahren auf die Anwesenheit von neutralisierenden Antikörpern untersucht (Tabelle 7). Wie in Tabelle 7 gezeigt gab es beim Titer neutralisierender Antikörper keinen signifikanten Unterschied zwischen Gruppen, welche die drei Arten von Immunogenen erhielten.

Tabelle 7. Induktion neutralisierender Antikörper in Mäusen, die mit PIV oder LAV immunisiert wurden

  • a: Der Titer von neutralisierendem Antikörper ist als der Kehrwert der Serumverdünnung, die zu einer Verringerung von 50 % von Plaques von Nakayama-Virus nach Passage in Hirn von der Maus führt, definiert.
  • b: 1 Dosis des Impfstoffs von Biken enthält laut Hersteller 5 &mgr;g virales Protein (TCA-fällbar).

Die Immunogenität von PIV wurde weiter an Mäusen untersucht. Erwachsene Inzuchtmäuse wurden mit verschiedenen Verdünnungen von inaktiviertem Virus mit oder ohne Aluminium-Adjuvans immunisiert. Gruppen von 20 sechs Wochen alten BALB/c-Mäusen wurden subcutan mit 500, 50 und 5 ng PIV in Salzlösung oder in Salzlösung mit Aluminiumhydroxid (Rehydragel) immunisiert. Die Mäuse erhielten zwei Impfungen im Abstand von 3 Wochen. Von jeder Gruppe von Mäusen wurden 3 Wochen nach der zweiten Immunisierung die Seren zusammengefasst und mit dem Stamm Nakayama nach Passage in Hirn von der Maus als neutralisiertes Virus auf das Vorliegen neutralisierender Antikörper untersucht (Tabelle 8). PIV war bei allen Dosen besser als der Impfstoff von Biken und Adjuvans verbesserte die Immunreaktion von Mäusen auf 50 und 500 ng PIV ungefähr 4- beziehungsweise 8-fach.

Tabelle 8. Vergleich der Titer neutralisierender Antikörper in Mäusen, die mit PIV mit oder ohne Aluminiumhydroxid immunisiert wurden

  • a: Der Titer von neutralisierendem Antikörper ist als der Kehrwert der Serumverdünnung, die zu einer Verringerung von 50 % von Plaques von Nakayama-Virus nach Passage in Hirn von der Maus führt, definiert.
  • b: 1 Dosis des Impfstoffs von Biken enthält laut Hersteller 5 &mgr;g virales Protein (TCA-fällbar).

Die in vivo protektive Wirksamkeit von PIV wurde dann in BALB/c-Mäusen untersucht. Zu Untersuchungen der schützenden Wirkung wurden Gruppen von 10 drei Wochen alten BALB/c-Mäusen subcutan mit inaktivierten JE-Viren in Salzlösung oder in Salzlösung mit Aluminiumhydroxid (Rehydragel) in die Hinterviertel geimpft. In Hinsicht auf das Alter zusammenpassende Kontrollen wurden mit PBS oder nicht spezifischen Antigenen in Aluminium geimpft. Die Mäuse wurden mit einer gleichwertigen Dosis drei Wochen später nachverstärkt. Die Mäuse wurden drei Wochen nach der Immunisierung mit einer intracraniellen Einimpfung mit 500 PBE des für Mäuse neurovirulenten JE-Virus (Nakayama, an Hirn von Mäusen adaptiert), die in 30 &mgr;l PBS enthalten waren, konfrontiert. Die konfrontierten Mäuse wurden täglich auf Morbidität und Mortalität bis zu 21 Tagen überwacht. Wein Tabelle 9 dargestellt zeigten die Mäuse, die mit 50 ng PIV immunisiert waren, einen Schutz von 90 %. Weiterhin zeigten Mäuse, die mit 50 und 5 ng PIV, das mit Aluminium gemischt war, immunisiert waren, einen Schutz von 100 % beziehungsweise von 70 %, während 11100 einer Dosis des Impfstoffs von Biken nur 50 % der immunisierten Mäuse schützte. Im Vergleich erkrankten alle Mäuse in der Kontrollgruppe und starben beginnend von fünf Tagen bis sieben Tage nach der Konfrontation.

Tabelle 9. Schutz von geimpften Mäusen gegen Konfrontation mit dem Immunogen von Nakayama-Virusa

  • a: Die Mäuse wurden mit 2 Impfungen der Testimpfstoffe im Abstand von 3 Wochen immunisiert und dann mit 500 PBE des für Mäuse neurovirulenten Nakayama-Virus konfrontiert.
  • b: In Hinsicht auf das Alter zusammenpassende Kontrollen wurden mit PBS oder nicht spezifischen Antigenen in Aluminium geimpft.
  • c: 1 Dosis des Impfstoffs von Biken enthält laut Hersteller 5 &mgr;g virales Protein (TCA-fällbar).

Um die immunologische Stabilität des Virus CJ50003 über Passagen in Vero-Zellen zu untersuchen, wurden Viren mit verschiedenen Zahlen von Passagen in Vero-Zellen unabhängig gereinigt und die Immunogenitäten wurden mit dem Verfahren wie in Tabelle 8 beschrieben festgesetzt. Wie in Tabelle 10 dargestellt gab es zwischen Impfstoffen, die aus den Viren mit unterschiedlichen Zahlen von Viruspassagen in Vero-Zellen hergestellt waren, keinen bemerkenswerten Unterschied bei der Fähigkeit, neutralisierende Antikörper hervorzubringen, was darauf hindeutet, dass das Virus CJ50003 im Hinblick auf Immunogenität während Passagen in Vero-Zellen sehr stabil ist.

Tabelle 10. Wirksamkeit von Impfstoffen, die mit JE-Viren mit unterschiedlichen Zahlen von Viruspassagen in Vero-Zellen hergestellt waren

  • a: Immunogen (PIV – Xps); gereinigter, inaktivierter Impfstoff, hergestellt aus dem Virus CJ50003, dessen Zahl von Passagen in Vero-Zellen C beträgt.
  • b: Der Titer von neutralisierendem Antikörper ist als der Kehrwert der Serumverdünnung, die zu einer Verringerung von 50 % von Plaques von Nakayama-Virus nach Passage in Hirn von der Maus führt, definiert und es wurden Mittelwerte der Ergebnisse aus drei getrennten Experimenten verwendet. Der 50 %-Endpunkt wird mit der Methode von Reed und Muench festgelegt.
  • c: Standardabweichung.

Die hier vorgelegten Ergebnisse deuten darauf hin, dass sowohl ein Impfstoff aus inaktiviertem JE-Virus als auch ein attenuierter Lebendimpfstoff unter Verwendung des Stamms CJ50003 vielversprechend sind. Es wurden relativ schnelle und effiziente Verfahren zur Anzucht von JE-Viren in Vero-Zellen, zum Konzentrieren und Reinigen von ihnen in einem Ausmaß, das für die Verwendung an Menschen geeignet sein kann, und zum Inaktivieren von ihnen ohne messbaren Verlust von Antigenität entwickelt. Es wurde festgestellt, dass diese Zubereitungen in Mäusen immunogen und protektiv sind.


Anspruch[de]
Attenuiertes Japanische-Enzephalitis-Virus, dadurch gekennzeichnet, dass das E-Protein-Gen des Virus die Punktmutationen T19A, T177A, K243E und Q264H umfasst. Attenuiertes Japanische-Enzephalitis-Virus nach Anspruch 1, wobei die Mutationen des E-Proteins auf der Polynukleotidebene durch die Punktmutationen A1032G, A1506G, A1704G und G1769T codiert sind. Attenuiertes Japanische-Enzephalitis-Virus nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Virus eine Multiplizität von mehr als 1×107 PBE/ml in Vero-Zellen aufweist und LD50/PBE für die junge adulte Maus weniger als 0,000001 beträgt. Attenuiertes Japanische-Enzephalitis-Virus nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Virus CJ50003 mit der Hinterlegungsnummer KCCM-10125 ist. Japanische-Enzephalitis-Impfstoff, umfassend das attenuierte Japanische-Enzephalitits-Virus nach Anspruch 1. Impfstoff nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Virus durch ein Inaktivierungsmittel inaktiviert ist. Impfstoff nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Virus lebend-attenuiertes JE-Virus ist, das nicht durch ein Inaktivierungsmittel behandelt ist. Impfstoff nach Anspruch 5, 6 oder 7, welcher außerdem pharmazeutisch annehmbare Additive umfasst. Impfstoff nach Anspruch 5, umfassend Japanische-Enzephalitis-Virus und Aluminiumhydroxid als Adjuvans. Impfstoff nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass das Japanische-Enzephalitis-Virus das Virus CJ50003 mit der Hinterlegungsnummer KCCM-10125 ist. Verfahren zum Herstellen eines attenuierten Japanische-Enzephalitis-Virus nach Anspruch 1, wobei das Verfahren den Schritt des Adaptierens an die Vero-Zellen durch Passagen auf Vero-Zellen umfasst.






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