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Dokumentenidentifikation DE69935539T2 06.12.2007
EP-Veröffentlichungsnummer 0001315958
Titel Untersuchungsverfahren für Protein-Protein-Interaktion
Anmelder Glaxo Group Ltd., Greenford, Middlesex, GB
Erfinder WEINER, Michael Phillip, Research Triangle Park, NC 27709, US;
BUCKHOLZ, Richard Gordon, Research Triangle Park, NC 27709-3398, US
Vertreter Vossius & Partner, 81675 München
DE-Aktenzeichen 69935539
Vertragsstaaten AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 26.03.1999
EP-Aktenzeichen 999150535
WO-Anmeldetag 26.03.1999
PCT-Aktenzeichen PCT/US99/06671
WO-Veröffentlichungsnummer 1999049294
WO-Veröffentlichungsdatum 30.09.1999
EP-Offenlegungsdatum 04.06.2003
EP date of grant 14.03.2007
Veröffentlichungstag im Patentblatt 06.12.2007
IPC-Hauptklasse C12N 1/19(2006.01)A, F, I, 20051017, B, H, EP
IPC-Nebenklasse C12N 15/64(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   C12N 15/81(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   G01N 33/50(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   

Beschreibung[de]
FACHGEBIET DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren, die für das Ermitteln von Protein-Protein-Interaktionen nützlich sind, welche die Assoziation von zwei oder von mehreren Proteinen durch die Erzeugung von nicht kovalenten Bindungen ermöglichen, wenn sich die zwei Proteinoberflächen präzise entsprechen. Diese Bindungen begründen die Spezifität der Erkennung. Protein-Protein-Interaktionen sind zum Beispiel bei dem Aufbau von Enzym-Untereinheiten; bei Antigen-Antikörper-Reaktionen; bei der Erzeugung von supramolekularen Strukturen von Ribosomen, Filamenten und Viren; beim Transport und bei der Interaktion von Rezeptoren auf einer Zelle mit Wachstumsfaktoren und Hormonen beteiligt. Die Produkte von Oncogenen können eine neoplastische Transformation durch Protein-Protein-Interaktionen verursachen.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Der Hefe-Zwei-Hybrid (Y2H)-Test ist ein Verfahren zum Ermitteln von Protein-Protein-Interaktionen, wobei ein genetisches System verwendet wird. Die Technik kann für das Auswerten von Protein-Interaktionen verwendet werden und daher zum Identifizieren von möglichen Partnern in genetischen Signalwegen. Der Test ist sensitiv und ergibt die DNA-Sequenzen, welche die Proteine codieren, die interagieren. In einem typischen Zwei-Hybrid-Test wird ein bekanntes Protein, das einen Teil des Hybrids einer DNA-bindenden Domäne erzeugt, gegen eine Bibliothek von allen möglichen Proteinen, die als Hybride einer Transkriptions-Aktivierungsdomäne vorliegen, getestet. Einige Zwei-Hybrid-Ansätze beruhen auf eine Interaktionspaarung. In diesem Verfahren werden das Protein, das an die DNA-bindenden Domäne fusioniert ist, und das Protein, das an die Aktivierungsdomäne fusioniert ist, in zwei verschiedenen haploiden Hefestämmen eines entgegengesetzten Paarungstyps exprimiert und die Stämme werden gepaart, um zu bestimmen, ob die zwei Proteine interagieren. Wenn haploide Hefestämme des entgegengesetzten Paarungstyps in Kontakt kommen, erfolgt eine Paarung und dies führt zu der Fusion der zwei Haploide, um einen diploiden Hefestamm zu erzeugen. Eine Interaktion kann daher durch die Messung der Aktivierung eines Zwei-Hybrid-Reporter-Gens in dem diploiden Stamm bestimmt werden.

Finley RL et al. (1997) beschreiben Verfahren zur Durchführung von Interaktionspaarungsanalysen von kleinen oder großen Gruppen von Proteinen, wobei die Interaktionsfalle verwendet wird, in der eine Platte mit Köderstämmen und eine Platte mit Beutestämmen in die gleiche Samt-Kopie gedrückt werden und der Abdruck wird mit einer Platte, die YPD-Medium enthält, abgehoben ("Two-Hybrid Analysis of Genetic Regulatory Networks", Advances in Molecular Biology (1997), Seiten 197–214). Finley RL et al. (1994) beschreiben Interaktionen zwischen Zellzyklus regulierenden Proteinen von Drosophila melanogaster durch eine Hefe-Interaktionspaarungstechnik, welche die Interaktionsfalle (ein Hefe-Zwei-Hybrid-Verfahren) ausdehnt und das Zeigen der Muster von Interaktionen in den Interaktionsmatrizen, zweidimensionalen Arrays von diploiden Stämmen von geeigneten Indikator-Platten involviert (Proceedings of the National Academy of Science of USA, National Academy of Science, Washington, 91: 12980–12984).

WO 94/10300 und das US-Patent Nr.: 5,283,173 beschreiben Verfahren zum Ermitteln der Interaktion zwischen Proteinen, wobei die Rekonstitution der Aktivität eines transkriptionellen Aktivators verwendet wird. Diese Rekonstitution verwendet chimäre Gene, die Hybrid-Proteine exprimieren. Das erste Hybrid enthält die DNA-bindende Domäne eines transkriptionellen Aktivators, der an ein bekanntes Protein (der "Köder") fusioniert ist, wobei die DNA-bindende Domäne das DNA-bindende Element stromaufwärts von einem Reporter-Gen gelegen ist. "Beute"-Proteine werden entweder als Zufallssequenzen oder cDNAs cloniert und werden an das Amino- oder das Carboxyende einer Transkriptions-Aktivierungsdomäne fusioniert. Wenn die Köder- und die Beute-Proteine in der Lage sind, miteinander zu interagieren, bringen sie die beiden Domänen des transkriptionellen Aktivators in eine enge Nähe. Diese Nähe ist ausreichend, um eine Transkription zu verursachen, die durch die Aktivität eines Reporter-Gens nachgewiesen werden kann, das eine Bindungsstelle für die DNA-bindende Domäne enthält.

Die Nachteile dieser Techniken sind, dass irrelevante Interaktionen mit Hefe-Proteinen erzeugt werden. Diese schließen falsch positive Interaktionen ein, bei denen es unwahrscheinlich ist, dass sie in lebenden Zellen gefunden werden, und falsch negative Interaktionen, das heißt solche Interaktionen, die sonst nachgewiesen würden, aber nicht nachgewiesen werden. Die Techniken, wie sie in WO 94/10300 und dem US-Patent Nr. 5,283,173 offenbart wurden, benötigen die Verwendung einer Paarung in einem festen Medium, das beschwerlich und arbeitsintensiv ist und das keine diploiden Zellen für eine weitere Analyse bewahrt.

Wir haben eine Paarungsstrategie des Hefe-Zwei-Hybrid-Tests in einem automatisiertem Format entwickelt, das die Verarbeitung von vielen Köder-Proteinen ermöglicht. Das Format verwendet eine Array-Vorrichtung, zum Beispiel Mikrotiterplatten und die Paarung in einer flüssigen Masse von einer Untergruppe einer großen, komplexen Bibliothek. Durch das Verfolgen der positiven Interaktionen in der Bibliothek haben wir ein Verfahren entwickelt, um eine funktionell verkleinerte Bibliothek zu erzeugen, das heißt, eine Bibliothek, die ohne einen auswertbaren Phänotyp hergestellt werden kann. Unser Verfahren ermöglicht zum Beispiel die Bestimmung des Nachweises von Hybriden, die promiskuitiv mit vielen Zielen wie z.B. mit Hitzeschock-Proteinen reagieren, und deren Eliminierung von jeder weiteren Überlegung.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Ermitteln von Protein-Protein-Interaktionen zur Verfügung gestellt, das die Paarung in einer flüssigen Masse von Untergruppen einer großen, komplexen Bibliothek umfasst. Das Verfahren stellt ein Mittel für das Entfernen von nicht relevanten Protein-Protein-Interaktionen zur Verfügung, um einen funktionell verkleinerten Test zu erhalten.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Ermitteln einer Interaktion zwischen einem ersten Test-Protein und einem zweiten Test-Protein zur Verfügung gestellt, das umfasst:

  • (a) das Bereitstellen einer Wirtszelle, die ein Reporter-Gen enthält, wobei das Reporter-Gen ein nachweisbares Protein exprimiert, wenn das Reporter-Gen von einer Aminosäuresequenz, die eine Transkriptions-Aktivierungsdomäne einschließt, aktiviert wird, wenn die Transkriptions-Aktivierungsdomäne in ausreichender Nähe zu dem Reporter-Gen ist;
  • (b) das Bereitstellen eines ersten chimären Gens, das in der Lage ist, in der Wirtszelle exprimiert zu werden, wobei das erste chimäre Gen eine DNA-Sequenz umfasst, die ein erstes Hybrid-Protein codiert, wobei das erste Hybrid-Protein umfasst:
  • (i) eine DNA-bindende Domäne, die eine Bindestelle auf dem Reporter-Gen in der Wirtszelle erkennt; und
  • (ii) ein erstes Test-Protein oder ein Fragment davon, das auf Interaktion mit mindestens einem zweiten Test-Protein oder Fragment davon getestet werden soll;
  • (c) das Bereitstellen eines zweiten chimären Gens, das in der Lage ist, in der Wirtszelle exprimiert zu werden, wobei das zweite chimäre Gen eine DNA-Sequenz umfasst, die ein zweites Hybrid-Protein codiert, wobei das zweite Hybrid-Protein umfasst:
  • (i) die Transkriptions-Aktivierungsdomäne; und
  • (ii) ein zweites Test-Protein oder ein Fragment davon, das auf Interaktion mit dem ersten Test-Protein oder Fragment davon getestet werden soll; wobei die Interaktion zwischen dem ersten Test-Protein und dem zweiten Test-Protein in der Wirtszelle, die Transkriptions-Aktivierungsdomäne veranlasst, die Transkription des Reporter-Gens zu aktivieren;
  • (d) das Einführen des zweiten chimären Gens in die Wirtszelle und das anschließende Einführen der Zellen in eine Array-Vorrichtung, wobei eine Master-Bibliotheksplatte erstellt wird;
  • (e) das Einführen von Zellen von der Master-Bibliotheksplatte in eine zweite Array-Vorrichtung, die eine Array-Vorrichtung für flüssiges Medium ist, wobei ein Paarungssatz erstellt wird;
  • (f) das Einführen des ersten chimären Gens in die Wirtszelle und das anschließende Einführen der Zelle in den Paarungssatz, wodurch es ermöglicht wird, das die Paarung in flüssigem Medium erfolgt;
  • (g) das Selektieren nach Auswuchs der Interaktion der ersten und zweiten Gene;
  • (h) das Entfernen eines Teils des Paarungssatzes zu einer dritten Array-Vorrichtung, wobei ein Rettungssatz erstellt wird;
  • (i) das Ermitteln, ob das Reporter-Gen in dem Paarungssatz exprimiert wurde; und
  • (j) das Analysieren der Zellen von der Rettungsplatte.

Der Ausdruck "Reporter-Gen" oder "Markierungs-Gen", wie er hierin verwendet wird, bedeutet jedes Gen, dessen Expression getestet werden kann. Mehr als ein Reporter-Gen kann durch die Wirtszelle in Schritt (a), vorstehend, codiert werden.

Der Ausdruck "Array-Vorrichtung", wie er hierin verwendet wird, bedeutet jedes Verfahren zur Haltung von Clonen in flüssigem Medium, in Suspension oder in festem Medium, zum Beispiel Mikrotiterplatten oder Teströhrchen.

Der Ausdruck "Selektieren nach Auswuchs", wie er hierin verwendet wird, bedeutet jedes Verfahren, das ein selektierbares Mittel verwendet, um eine Gruppe von interagierenden Proteinen entweder zu amplifizieren oder zu isolieren. Dieses selektierbare Mittel kann das Auswachsen in einem nährstoffdefizienten Wachstumsmedium einschließen, worin die interagierenden Proteine die Transkription eines biosynthetischen Gens oder Signalwegs hervorrufen. Beispiele von anderen nützlichen selektierbaren Mitteln schließen biosynthetische Gene von Aminosäuren, Metaboliten, Kataboliten und Nucleinsäuren wie z.B. Hefe-HIS3, URA3 und LYS2, GAL1, E. coli-galK und CAT, GUS, Resistenz gegen Antibiotika und jedes Gen ein, das ein Zelloberflächen-Antigen codiert, für das Antikörper erhältlich sind. Man kann das Auswachsen für 5–10 Tage fortschreiten lassen, bevor das Selektieren nach Auswuchs durchgeführt wird.

Der Ausdruck "Analysieren", wie er hierin verwendet wird, bedeutet jedes Verfahren zur Ermittlung von Informationen, welche die Protein-Protein-Interaktion betreffen, zum Beispiel das Selektieren positiver Clone, das Durchführen von PCR, DNA-Sequenz-Analyse und der Vergleich mit Datenbanken wie z.B. LifeSeq® (Incyte Pharmaceuticals) oder Genbank.

Der Ausdruck "funktionell verkleinert" bedeutet das Fehlen eines nachweisbaren Phänotyps, der eine nicht relevante Protein-Protein-Interaktion repräsentiert.

In einem weiteren Aspekt der Erfindung kann die Bestimmung der Expression des Reporter-Gens und die Analyse der Zellen in einem Schritt erreicht werden, das heißt die vorstehenden Schritte (i) und (j) können kombiniert werden. In einer anderen Ausführungsform können die Schritte (h), (i) und (j) eliminiert werden.

Eine Hefe-Wirtsstamm kann so konstruiert werden, dass das Protein (der "Köder") des therapeutischen oder diagnostischen Interesses als ein Fusionsprotein kovalent an eine bekannte DNA-bindende Domäne eines transkriptionellen Aktivators gebunden wird. Der Hefe-Wirtsstamm enthält ebenfalls ein oder mehrere "Reporter-Gene", das heißt Gene, deren Transkription als Antwort auf eine Köder-Beute-Interaktion nachgewiesen wird. Die Köder-Proteine binden über ihre DNA-bindende Domäne an ihre spezifische DNA-Stelle, die stromaufwärts von einem Reporter-Gen gelegen ist, die Transkription des Reporter-Gens wird jedoch nicht stimuliert, weil dem Köder-Protein eine eigene Aktivierungsdomäne fehlt.

Um Gene zu isolieren, die neue interagierende Proteine codieren, werden Zellen dieses Stamms, die ein Reporter-Gen enthalten und ein Köder-Protein exprimieren, mit individuellen Mitgliedern einer DNA (zum Beispiel eine cDNA)-Expressions-Bibliothek transformiert. Jedes Mitglied der Bibliothek leitet die Synthese eines zur Auswahl stehenden interagierenden Proteins, das an eine schwache und unveränderliche Gen-Aktivierungsdomänen-Markierung fusioniert ist. Die durch die Bibliothek codierten Proteine ("Beute"-Proteine), die physikalisch mit dem Promotor-gebundenen Köder-Protein interagieren, aktivieren nachweisbar die Transkription des stromabwärts gelegenen Reporter-Gens und stellen einen einfachen Test zur Identifizierung von bestimmten Zellen zur Verfügung, die einen DNA-Clon enthalten, der ein interagierendes Protein von Interesse codiert.

In einer Ausführungsform wird eine cDNA-Bibliothek, die in E. coli erzeugt wurde und die eine cDNA umfasst, die an die DNA-Sequenz fusioniert ist, welche die Aktivierungsdomäne des transkriptionellen Aktivators, das GAL4-Protein, codiert, auf 960-LB-Agarplatten mit einer Dichte von 1000 Clonen pro Platte ausplattiert. Die E. coli-Kolonien von jeder Platte werden vereinigt, die Plasmid-DNAs werden isoliert und die DNAs werden verwendet, um Hefezellen zu transformieren. Die transformierten Hefezellen werden auf festes Medium ausplattiert und die Kolonien von jeder Platte werden vereinigt und in Aliquots aufgeteilt, die in unterschiedliche Vertiefungen von einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen gegeben werden, um eine angeordnete Gruppe von 10 "Master-Bibliotheksplatten" zu erzeugen. Fünf Mikroliter von jeder Vertiefung der Master-Bibliotheksgruppe wird erneut in Aliquots aufgeteilt, um einen "Paarungssatz" zu erzeugen, und 5 &mgr;l von Köder enthaltenden Hefezellen werden anschließend getrennt in je eine Vertiefung gegeben. Der "Köder" umfasst ein chimäres Gen, das ein Hybridprotein exprimiert, das die DNA-bindende Domäne von GAL4 enthält, die an ein bekanntes Protein fusioniert ist. Der Wirtshefestamm enthält das GAL1-lac-Z-Gen, das die GAL4-DNA-bindende Domäne binden kann. Das GAL1-lacZ-Gen enthält das lacZ-Gen von E. coli, das die &bgr;-Galactosidase codiert. Die Aktivität von &bgr;-Galactosidase ist ein Maß für die GAL4-Funktion. Das Wachstum von Hefe auf Galactose benötigt die Transkription von Genen, die durch GAL4 reguliert werden, und ist ebenfalls ein Maß für die GAL4-Funktion. Man lässt die Paarung in der flüssigen Masse für einen Zeitraum ablaufen und das Paarungsgemisch wird 100fach mit Leucin-Drop-out-Medium verdünnt. Nach dem Auswachsen von positiv interagierenden, gepaarten Hefe-Diploiden in dem Drop-out-Medium wird ein Teil entfernt und auf eine getrennte Gruppe von "Rettungsplatten" gegeben und eine &bgr;Gal-Analyse wird bei dem Paarungssatz durchgeführt. Die transkriptionelle Aktivierung kann durch das Messen der &bgr;-Galactosidaseaktivität auf Galactose enthaltende Medien bestimmt werden. Vertiefungen, die eine &bgr;Gal-Aktivität enthalten, werden identifiziert und Clone von der entsprechenden Gruppe von Vertiefungen aus den Rettungsplatten werden durch PCR-Sequenzierung analysiert.

Nicht-relevante Protein-Protein-Interaktionen können durch das Kombinieren ausschließlich produktiver Clone mit der Master-Bibliothek eliminiert werden, wodurch Clone eliminiert werden, die Proteine wie zum Beispiel Hitzeschock-Proteine herstellen, von denen bekannt ist, dass sie mit vielen anderen Proteinen interagieren.

Es wird ebenfalls ein Verfahren für eine Strategie zur Clonierung eines offenen Leserahmens zur Verfügung gestellt, welche die dynamische Umcodierung der Enden von DNA-Molekülen involviert. Diese Strategie zur Clonierung erhöht die Effizienz des Tests durch die Eliminierung aller Clone, die Proteine codieren, die außerhalb des Leserahmens mit Bezug auf die Aktivierungsdomäne liegen, aus dem Test.

Bei der dynamischen Umcodierung einer Aktivierungsdomäne kann das 3'-Ende des Gens der Aktivierungsdomäne umcodiert werden, um ein Aminosäure-Hybrid-Peptid einzubauen, das ebenfalls die DNA kontrollierenden Elemente codiert, die für die Expression von E. coli-Genen notwendig sind. In einem Aspekt umfassen diese Kontrollelemente hintereinander i) eine Sequenz, zum Beispiel eine -35- und eine -10-Sequenz, die als ein E. coli-Promotor wirkt, um die Transkription von mRNA zu initiieren, ii) eine Ribosomen-Bindestelle und ein ATG fMet-Codon, das notwendig ist, um die Translation von Protein zu initiieren, iii) einen Polylinker (multiple Clonierungsschnittstelle), der aus einer oder aus mehreren Restriktionsstellen aufgebaut ist, die vorzugsweise einzigartig für den Clonierungsvektor sind, in den die Füllfragmente (Stufferfragmente) der DNA, welche die Proteinfusionen zu der Aktivierungsdomäne codieren können, cloniert werden sollen, und iv) ein Reporter-Gen, zum Beispiel das lacZ-Gen, das außerhalb des Leserahmens mit Bezug auf das ATG-Codon cloniert wurde. In dem System zur Clonierung des offenen Leserahmens kann das ATG innerhalb des Leserahmens mit Bezug auf die Aktivierungsdomäne liegen, das ATG kann außerhalb des Leserahmens mit Bezug auf das lacZ-Gen liegen, es liegt eine vernachlässigbare Menge von &bgr;Gal-Protein vor, das von der Wirtszelle in der Abwesenheit eines Füllfragments hergestellt wird, das den lacZ-Leserahmen wiederherstellt, und es liegt ein Fehlen eines Terminations-Codons am Ende des Aktivierungsdomäne-Gens und des ATG-Codons vor.

Der Ausdruck "Füllfragmente" bedeutet jedes DNA-Fragment, das synthetisch oder durch die Verwendung eines Verfahrens hergestellt wird, das im Allgemeinen verwendet wird, um Zufalls-cDNA-Moleküle oder am 3'-Ende vorbehandelte cDNA-Moleküle, die in den Polylinker des vorstehend beschriebenen Systems zur Clonierung eines offenen Leserahmens geclont werden können.

In einem Aspekt kann durch Random priming hergestellte cDNA, die als Füllfragmente verwendet wird, durch Agarose- oder Polyacrylamid-Gelelektrophorese nach Größe ausgewählt werden. Eine individuelle cDNA, die durch Gelelektrophorese oder durch andere Mittel nach Größe ausgewählt wurde, kann Fragmente enthalten, die, wenn sie in das Vektorsystem, das beschrieben wurde, cloniert werden, in einem der sechs Leserahmen (3 Leserahmen sowohl in Vorwärts- als auch in Rückwärts-Orientierung) liegen können.

Die umcodierte Aktivierungsdomäne kann in Zusammenhang mit dem außerhalb des Leserahmens gelegenen Reporter-Gen verwendet werden, um Clone auszuwählen, die den Leserahmen des Reporter-Gens wiederherstellen. Wenn zum Beispiel das lacZ-Gen zunächst außerhalb des Leserahmens mit Bezug auf den ATG-Anfang des umcodierten Teils der Aktivierungsdomäne liegt, dann werden Clone, die den Leserahmen zwischen dem ATG und dem lacZ-Gen wiederherstellen, Proteinfusionen dieses Clons mit dem lacZ-Genprodukt erzeugen. Fusionen, welche die &bgr;gal-Aktivität wiederherstellen, können danach ausgewählt werden, ob sie chromogen sind, wobei gut bekannte Farbstoffe (z.B. Xgal) verwendet werden, oder auch selektive Wachstumsmedien, die Lactose als die einzige Kohlenstoffquelle enthalten.

In dem System zur Clonierung des offenen Leserahmens kann ein Suppressor-Terminations-Codon von E. coli (zum Beispiel ein TAG-Amber-Terminations-Codon) zwischen dem Füllfragment und dem Reporter-Gen codiert werden, sodass durch die phänotypische Unterdrückung der E. coli-Wirtsstämme das Stopp-Codon durch ein Suppressor-tRNA-Molekül unterdrückt wird, das eine spezifische Aminosäure einführt. In nicht unterdrückenden Wirtszellen, in denen der Interaktionstest durchgeführt wird, würde die Terminierung der Proteintranslation am Terminations-Codon stattfinden. Der Vorteil, dieses unterdrückbare System zu besitzen, liegt darin, dass das Reporter-Protein des offenen Leserahmens nicht an das Carboxyl-Ende des codierten Hybridproteins aus Füllfragment-Aktivierungsdomäne fusioniert sein wird.

Die Wirtszelle ist eine Hefezelle, vorzugsweise Saccharomyces cerevisiae.

Das Köder-Protein kann von einem Bakterienprotein, einem Virusprotein, einem durch ein Oncogen codierten Protein, einen Wachstumsfaktor oder einem Enzym abgeleitet sein. Köder-Proteine können von jedem Protein gewählt werden, von dem eine diagnostische oder therapeutische Bedeutung bekannt ist oder vermutet wird. Bevorzugte Köder-Proteine schließen Oncoproteine ein (wie z.B. myc, ras, src, fos) oder jedes andere Protein, das in der Regulierung des Zellzyklus involviert ist (wie z.B. Kinasen, Phosphatasen).

Beute-Proteine können in einer Bibliothek von Plasmiden codiert werden, die DNA-Insertionen enthalten, die von einer genomischen DNA, cDNA oder von synthetisch erzeugten DNA-Sequenzen abgeleitet sind und die an die DNA-Sequenz fusioniert sind, welche die zweite Aminosäure-Domäne codiert. Die cDNAs können von jeder mRNA-Population konstruiert werden und sie können in einen entsprechenden Expressionsvektor eingeführt werden. Eine solche Bibliothek der Wahl kann de novo aufgebaut werden, wobei im Handel erhältliche Kits (zum Beispiel von Stratagene, La Jolla, CA) verwendet werden oder gut etablierte präparative Verfahren (zum Beispiel Current Protocols in Molecular Biology, New York, John Wiley & Söhne, 1987) verwendet werden. In einer anderen Ausführungsform kann eine im Handel erhältliche cDNA-Bibliothek verwendet werden. Ein Beute-Protein kann durch eine synthetische Sequenz codiert werden oder es kann das Produkt eines zufällig erzeugten offenen Leserahmens oder eines Teils davon sein.

Jedes geeignete Reporter-Gen wie zum Beispiel das LEU2-Gen oder das lacZ-Gen kann verwendet werden. Beispiele von anderen nützlichen Genen, deren Transkription nachgewiesen werden kann, schließen biosynthetische Gene von Aminosäuren und Nucleinsäuren wie z.B. Hefe-HIS3, URA3 und LYS2, GLA1, E. coli-galK, GFP, CUP1 und CAT, GUS, Resistenz gegen Antibiotika und jedes Gen ein, das ein Zelloberflächen-Antigen codiert, für das Antikörper erhältlich sind.

Der Fachmann wird ebenfalls erkennen, dass die Komponenten des Reporter-Gens, der DNA-bindenden Domäne und der Gen-Aktivierungsdomäne von jedem geeigneten eukaryontischen oder prokaryontischen Zellgenom oder von cDNAs sowie von künstlichen Sequenzen abgeleitet sein kann.

Plasmid-Konstrukte, Transformation, Transfektion, Zellkultur und der Nachweis der Transkription kann durch jedes Verfahren, das auf dem Fachgebiet bekannt ist, wie zum Beispiel das US-Patent Nr. 5,283,173 und WO 94/10300, durchgeführt werden.

Jedes Mittel zur Einführung von Genen in die Wirtszellen kann verwendet werden, wie zum Beispiel die Elektroporation, Transfektion, Transformation oder Paarung.

Die Vorteile der beschriebenen Erfindung schließen eine erhöhte Effizienz durch die Eliminierung einer weiteren Analyse von promiskuitiven Proteinen in den Array-Bibliotheken, die Erzeugung eines Mittels, um funktionell Klassen von Proteinen von den Bibliotheken zu entfernen, die Eliminierung einer weiteren Analyse von Clonen, die nicht in einem spezifischen Leserahmen liegen, die verminderte Arbeit im Vergleich zu den derzeitig verwendeten Verfahren, die Wiederverwendung der Primär-Bibliotheken der angeordneten Master-Bibliothekssätze und das angesammelte Wissen über den Zeitverlauf des Aufbaus der angeordneten Clone ein.

Die Erfindung kann durch die nachfolgenden Beispiele, die nicht einschränkend sein sollen, dargestellt werden.

Beispiel 1 Paarung in flüssiger Masse, funktionell verkleinerte Hefe-Zwei-Hybrid-Test

Enzyme der Restriktion und der DNA-Modifikation wurden von verschiedenen Herstellern erworben und wurden gemäß deren Empfehlungen verwendet.

Erzeugung von angeordneten cDNA-Bibliotheken (1). E. coli-cDNA-Bibliotheken wurden von Invitrogen erworben und wurden mit einer niedrigen Dichte (etwa 1000 Clone pro Platte) auf LB + Amp-Platten ausplattiert und für 1–2 Tage bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden 3–4 ml LB-Medium (das 15% Glycerin enthielt) zu jeder Platte zugegeben, die Platte wurde auf einem Plattform-Schüttler bei einer niedrigen Geschwindigkeit geschüttelt und das LB-Medium wurde geerntet, nachdem die Resuspendierung der Kolonien in das LB-Medium offensichtlich war. Ein 200 &mgr;l großer Anteil der resuspendierten Zellen wurde für eine Isolierung der Plasmid-DNA entfernt und die übrigen Zellen wurden als Archiv für eine langfristige Lagerung bei –80°C eingefroren.

Die Plasmid-DNA wurde durch ein Kit, das von Qiagen erhalten wurde, isoliert. Zweihundertfünfzig (250) &mgr;l P2-Lösung (Qiagen) wurden zu dem 200 &mgr;l großen Anteil der Zellen in ein 2 ml-Eppendorf-Zentrifugenröhrchen zugegeben. Die beiden Lösungen wurden vorsichtig gemischt und anschließend wurden 250 &mgr;l P3-Lösung (Qiagen) zugegeben und das Röhrchen wurde geschüttelt. Das Gemisch wurde anschließend mit einer hohen Geschwindigkeit (14.000 UpM) in einer Eppendorf-Zentrifuge zentrifugiert. Der geklärte Überstand (500 &mgr;l) wurde in ein neues Eppendorf-Zentrifugenröhrchen mit einer Pipette gegeben und 1 ml Ethanol wurde zugegeben, um die DNA zu präzipitieren. Die präzipitierte DNA wurde bei hoher Geschwindigkeit (14.000 UpM) für 15 Minuten pelletiert, die Ethanol-Lösung wurde abgegossen und das Pellet wurde im Vakuum getrocknet. Das Pellet wurde in 50 &mgr;l destilliertem H2O resuspendiert und direkt verwendet, um die Hefe zu transformieren.

Die Hefe wurde transformiert, wobei das EZ-Hefe-Transformations-Kit (Zymo Research) gemäß der Anweisungen des Herstellers verwendet wurde, wobei 2,5 &mgr;l DNA, 25 &mgr;l kompetenter Hefestamm EGY48 und 250 ml EZ3 verwendet wurden. Die transformierten Hefezellen wurden für 1 h bei 30°C inkubiert und die gesamte Menge wurde auf SD – trp-Agarplatten ausplattiert. Die Platten wurden für weitere 3–4 Tage bei 30°C inkubiert und die Zellen wurden wie für E. coli geerntet, wobei 3–4 ml SD – trp + 15% Glycerin verwendet wurden. Die geernteten Hefezellen von jeder Platte wurden getrennt in Aliquots in verschiedenen Vertiefungen von Platten mit 96 tiefen Vertiefungen aufgeteilt (die "Master-Bibliotheksplatten") und bei –80°C für eine langfristige Lagerung eingefroren.

Flüssigpaarung von Hefezellen (2). 100 &mgr;l SD – trp oder SGal-trp wurden mit fünf &mgr;l von jeder Vertiefung der Hefe-Master-Bibliothek in einer Platte mit 96 Vertiefungen beimpft und man ließ sie übernacht bei 30°C wachsen. Fünf &mgr;l von jeder Vertiefung wurden in eine neue "Paarungsplatte" mit 96 Vertiefungen übertragen. Ein 5 &mgr;l-Aliquot einer Köder-Kultur (OD600 = 1,0) wurde gemeinsam mit 10 &mgr;l YPD-Medium zu jeder Vertiefung zugegeben. Die Paarungsplatten wurden in eine wiederverschließbare Plastiktüte gegeben und für 12–36 h bei 30°C inkubiert. Jede Vertiefung wurde anschließend zweimal nacheinander 10fach verdünnt (Endverdünnung 100fach), wobei S-min (–leu, –his, –trp, –ura, +gal, +raff) bis zu einem Endvolumen von 110 &mgr;l verwendet wurde. In einer anderen Ausführungsform wurde jede Vertiefung anschließend 1:10 in S-min verdünnt, bei 30°C für zwei Tage inkubiert und anschließend 1:40 in S-min verdünnt (Endverdünnung 400fach). Die verdünnten Paare wurden anschließend für zusätzliche 5–10 Tage bei 30°C inkubiert. Zehn &mgr;l der gepaarten Vertiefungen wurden anschließend auf einen zweiten Satz von Platten übertragen, bevor die &bgr;Gal-Analyse durchgeführt wurde (diese gepaarten und ausgewachsenen 10 &mgr;l-Vorratslösungen ("Rettungsplatten") wurden später zur Rettung der positiven Clone verwendet).

&bgr;Gal-Analyse. Die Zellen wurden durch die Zugabe von 100 &mgr;l einer Lösung des Z-Puffers [Na2HPO4 (16,1 g l–1), NaH2PO4 (5,5 g l–1), KCl (0,75 g l–1) und MgSO4 (0,25 g l–1), auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt und steril autoklaviert], der Oxalyticase (100 E ml–1), SDS (0,1%) und CPRG-Substrat (2 mg ml–1) enthielt, lysiert. Die Platten wurden bei Raumtemperatur inkubiert, bis sich das rote chromogene &bgr;Gal-Substrat entwickelt hatte (im Allgemeinen 10 min bis 2 h). Für eine quantitative Messung der Vertiefungen war es notwendig, dass die Zelltrümmer entweder durch Zentrifugation oder Filtrierung entfernt wurden. Das CPRG-Substrat kann bei einem Absorptionsvermögen von 575 Angstrom gemessen werden. In einer anderen Ausführungsform wurde die &bgr;-Gal-Aktivität unter Verwendung eines chemilumineszierenden Substrats gemessen. Das Tropix Galacton Plus-Kit wurde für diesen Zweck verwendet. Fünfundzwanzig Mikroliter von jeder Analysen-Vertiefung wurden in die entsprechenden Vertiefungen von Lumineszenz-Platten mit 96-Vertiefungen überführt. Fünfundzwanzig Mikroliter CL Reaction-Puffer (Z-Puffer, der 0,2% Igepal CA-630, 100 E/ml Oxalyticase und 1% Galacton Plus enthielt) wurden zu jeder Vertiefung zugegeben und die Platten wurden übernacht bei Raumtemperatur inkubiert. Fünfzig Mikroliter Accelerator II (1:1 mit 0,1 M Na2CO3/NaHCO3, pH 10,5, verdünnt) wurden zu jeder Vertiefung zugegeben und die Platten wurden für 5 Minuten inkubiert. Die Chemilumineszenz wurde anschließend in einem Luminometer mit 96 Vertiefungen gemessen.

Test der Sensitivität der Vereinigung. Ein Test der Paarungsstrategie in einer vereinten Flüssigkeit wurde durchgeführt, wobei die bekannten starken Y2H-Interactor RPB4 (Hefe-PolII-Untereinheit) und RPB7 (Hefe-PolII-Untereinheit) als Kontrollen verwendet wurden. Die RPB4-Untereinheit wurde in den Aktivierungsdomäne-Vektor pJG4.5 subcloniert. Die rekombinante RPB4-Fusion wurde in den DNA-bindende Domänen-Vektor pEG202 subcloniert, in den Beute-Stamm transformiert und mit verschiedenen prozentualen Anteilen (von 0 bis 100%) mit dem gleichen Beute-Stamm, der den pJG4.5-Eltern-Vektor enthält, gemischt.

Die Ergebnisse (gezeigt in 3) zeigen, dass wir in der Lage waren, den Beute-Stamm für diese Interaktion wiederzugewinnen, auch wenn die Beute ursprünglich etwa 0,1% des Beute-"Paarungsgemisches" darstellte. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass eine etwa 100fache Verdünnung des komplexen YPD-Mediums benötigt werden kann, um das differenzierte Wachstum der positiv interagierenden Paare zu beobachten. Die Verdünnung der Proben, um die Konzentration des YPG-Komplexes zu vermindern, kann gegenüber anderen Verfahren wie z.B. der Zentrifugation oder Filtration bevorzugt werden. Der Grund hierfür ist, dass eine Verdünnung kostengünstiger, schneller und einfacher für eine Automatisierung ist. Die &bgr;Gal-Analyse des Tests der Aktivierung des Reporters im Format einer vereinten Mikrotiterplatte zeigte keinen deutlichen Unterschied zwischen einer 0,1 und 100% rekombinanten Fusion bei einer 100fachen Verdünnung. Bei höheren Verdünnungen erfolgte eine Streuung der &bgr;Gal-Aktivität. Es kann sein, dass bei höheren Verdünnungen (von Vereinigungen mit einem niedrigen prozentualen Anteil) die Probeentnahme der positiven Interaktoren verloren geht.

Test der vereinten, angeordneten cDNA-Bibliotheken. In dem ersten Test des angeordneten cDNA-Bibliotheken-Experiments wurden die nucleären Rezeptoren RXR und LXRa gegen ca. 6 × 105 cDNAs in 6 Mikrotiterplatten getestet. Die meisten der cDNAs stammten von im Handel erhältlichen cDNA-Bibliotheken, die von der menschlichen fötalen Leber (Invitrogen A202-01) und dem menschlichen fötalen Gehirn (Invitrogen A212-01) abgeleitet wurden.

Die cDNA enthaltenden Clone wurden mit etwa 1 × 103 Clone pro Vertiefung ausgesät. Kurz zusammengefasst, der Köder-Stamm (der das Zielprotein enthält, in diesem Fall entweder RXR oder LXRa) wurde zu den Clonen der cDNA-Bibliothek in die Vertiefungen zugegeben und man ließ die Paarung in einem Komplex-Medium fortfahren. Die Paarungsgemische wurden mit Minimal-Medium (–Leucin) verdünnt und man ließ das Wachstum der Interaktoren über einen Zeitraum von 5 oder mehr Tagen stattfinden (wobei das Wachstum eine erfolgreiche Interaktion anzeigte). Die &bgr;Gal-Tests wurden anschließend in den Vertiefungen durchgeführt (vergl. Beispiel, 2) und die Clone von 10 Vertiefungen, die eine deutliche &bgr;Gal-Aktivität zeigten, wurden durch das Ausstreichen eines Aliquots der Vertiefung der Bibliothek auf ein festes Minimal-Medium (–Leucin) erneut isoliert. Die Plasmide wurden von solchen Clonen isoliert und der Analyse der DNA-Sequenz und der Bioinformatik unterzogen. Die Ergebnisse werden nachfolgend in Tabelle 1 gezeigt.

Einige der sequenzierten Clone wurden durch die traditionelle Y2H-Analyse gefunden. Diese schließen TRIP6 (Thyroid-Rezeptor interagierendes Protein 6) ein, das zuvor in der Literatur von anderen "Standard"-Interaktionsfallen-Experimenten gegen andere nucleäre Rezeptoren (es wurde noch nicht gegen LXRa getestet) und TIF1 beschrieben wurde. Wir glauben, dass diese wahre Positive darstellen. Die anderen Clone, beide codieren ein GCN5-Homolog, wurden zweimal isoliert (in zwei verschiedenen Vertiefungen). Wir wissen noch nicht, ob das GCN5-Homolog richtig positiv oder falsch positiv ist.

Man hat herausgefunden, dass ungefähr ein Drittel der interagierenden Clone eine Homologie zu cDNAs in den Datenbanken Incyte oder GenBank besitzen, aber keine zugeschriebene Funktion besitzen.

Von mehreren Clonen scheint bekannt zu sein, dass sie promiskuitiv Positive in den Interaktionsfallen-Experimenten sind (nämlich Cofilin und die Hitzeschock-Proteine). Da nun bekannt ist, in welchen Vertiefungen sie liegen, bedeutet dies, dass sie von der weiteren Analyse ausgeschlossen werden können. Es sollte jedoch beachtet werden, dass, wenn diese Vertiefungen ausgeschlossen werden, ebenfalls Informationen von anderen Clonen in dieser Vertiefung verloren gehen. Wenn zum Beispiel RXR als ein Köder verwendet wird, haben wir eine Interaktion mit dem Thymopoietin verwandten Protein in der Vertiefung 1D9 beobachtet. Wenn mit LXRa abgesucht wurde, wurde jedoch in der gleichen Vertiefung eine positive Interaktion mit dem promiskuitiv positiven HSP90 beobachtet. Man kann hoffen, dass eventuell eine Bibliothek von cDNAs, die groß genug ist, verwendet wird, um eine Redundanz bei der Analyse der Bibliothek zu erhalten.

Tabelle 1 Ergebnisse der Y2H-Analyse
  • a Allgemein bekannt positiv in anderen Y2H-Absuchungen (E. Golemis).
  • b Kein Kommentar zu Genbank-Datenbank spezifischer Sequenz gefunden.
  • c Von diesem Protein ist bekannt, dass es mit mehreren anderen nucleären Rezeptoren interagiert.
  • d GCN5 besitzt eine Histon-Acetyltransferase (HAT)-Aktivität.
  • e Das Protein wurde ebenfalls unter Verwendung eines traditionellen Zwei-Hybrid-Verfahrens isoliert.

Beispiel 2 Strategie zur Clonierung des offenen Leserahmens Clonierung des offenen Leserahmens und Verwendung der Unterdrückung zur Kontrolle der 3'-Genfusion

Eine zufällig gescherte cDNA mit einer Länge von etwa 600 Basenpaaren wurde isoliert und in ein &bgr;gal-Gen mit Leserahmenverschiebung cloniert (5a). Transformierte E. coli-Zellen, die &bgr;gal+ wurden, enthielten einen offenen Leserahmen. In einem Vektor mit einem Amber-Suppressor-Terminations-Codon zwischen dem 3'-Ende der cDNA und dem 5'-Ende von &bgr;gal wurde die Fusion der cDNA mit dem &bgr;gal durch den Sup-Phänotyp des E. coli-Stamms kontrolliert (5b). Der gleiche Typ des Clonierungsschemas kann adaptiert werden, um das 5'-Ende des M13-Phagen-Display-Proteins mit der cDNA zu fusionieren, in diesem Fall werden lebende Phagen eine erfolgreiche Clonierung des offenen Leserahmes anzeigen (5c).

Dynamische Umcodierung des 3'-Endes der Hefe-Aktivierungsdomäne.

Das 3'-Ende der Hefe-Aktivierungsdomäne wurde umcodiert, um die Kontrollelemente der E. coli-Genexpression aufzunehmen. 6 ist ein Beispiel der Umkodierung der Kontrollelemente, die für die Expression des Bakteriophagen-T7-Proteins benötigt werden. Die umcodierte Hefe-Aktivierungsdomäne wurde anschließend in Verbindung mit dem System zur Clonierung des offenen Leserahmens verwendet, um den korrekten Leserahmen mit der Aktivierungsdomäne und gleichzeitig mit einem getrennten 3'-Fusionsprotein zu fusionieren (zum Beispiel &bgr;gal oder M13gp3).

Die Auswahl der cDNA-ORFs nach Phänotyp in E. coli und deren gleichzeitige Fusion an das 3'-Ende der Hefe-Aktivierungsdomäne und dem 5'-Ende von M13gpIII kann gemäß 7 durchgeführt werden: A. Clonierung von zufälligen, 500 bp großen cDNA-Fragmenten; Transformation von T7RNAP+, Sup+ E. coli; Absuchen der Plaques; B. Phagen-Display in E. coli; C. Hefe-Zwei-Hybrid in Hefe: Transformation von T7RNAP, Sup+ E. coli; Transformation von M13 in Sup-Hefe.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

1. Erzeugung der angeordneten cDNA-Bibliotheken. E. coli-cDNA-Bibliotheken wurden mit einer niedrigen Dichte (etwa 1000 Kolonien pro Platte) auf LB + Amp ausplattiert. Anschließend wurden 3–4 ml LB-Medium (das 15% Glycerin enthielt) zu jeder Platte zugegeben und das LB-Medium wurde geerntet, nachdem die Resuspendierung der Kolonien im LB-Medium offensichtlich war. Die Plasmid-DNA wurde durch ein Kit, das von Qiagen (Valencia, CA) erhalten wurde, isoliert und direkt verwendet, um Hefezellen zu transformieren. Die transformierten Hefezellen wurden auf SD – trp-Agarplatten ausplattiert. Die Platten wurden inkubiert und die Zellen wurden wie für E. coli geerntet, wobei 3–4 ml SD – trp + 15% Glycerin verwendet wurden. Die geernteten Hefezellen von jeder Platte wurden getrennt in Aliquots in verschiedenen Vertiefungen von Platten mit 96 tiefen Vertiefungen aufgeteilt (die "Master-Bibliotheksplatten") und bei –80°C für eine langfristige Lagerung eingefroren.

2. Automatisierbares Y2H-Format. Die nachfolgenden Schritte wurden verwendet, um eine Y2H-Analyse in einer Mikrotiterplatte durchzuführen: i) Zugabe des Köder-Stamms zu dem cDNA-Bibliothek-Stamm in einer Vertiefung, ii) Stattfinden der Paarung in Komplex-Medium, iii) Verdünnung des Paarungsgemisches in Minimal-Drop-out-Medium (–leu), iv) Wachstum der positiv interagierenden Proteine (Wachstum als Anzeige), v) Durchführung der &bgr;Gal-Tests (quantitative Anzeige), vi) Sequenz (+)-Clone, Abfrage der Datenbank(en). Legende: 1 = Master-Bibliothek; 2 = Tochter; 3 = Zugabe des Köders (Paarung für 24–36 h); 4 = selektives Auswachsen (Inkubation > 5 Tage); 5 = Lagerung; 6 = &bgr;Gal.

3a und 3b. Untersuchung der Reporter-Aktivierung in einer vereinten Vertiefung einer Mikrotiterplatte. Ergebnisse werden als % Interaktor im Pool von Nicht-Interaktoren ausgedrückt. Bekannte Interaktoren werden in einem bekannten Verhältnis gemischt und in dem flüssigen Paarungs-Format gegen eine Köder-Fusion getestet. X-Achse: Paarungsverdünnung; Y-Achse: A600 oder A574. 3A: Selektives Auswachsen nach Verdünnung der gepaarten Hefe im Leucin-Drop-out-Medium. Fusion der Aktivierungsdomäne: pJG-scRPB4 (Hefe-PolII-Untereinheit); Fusion der DNA-bindenden Domäne: pEG-scRPB7 (Hefe-PolII-Untereinheit); 3B: &bgr;gal-Test der Vertiefungen. Fusion der Aktivierungsdomäne: pJG-scRPB4 (Hefe-PolII-Untereinheit); Fusion der DNA-bindenden Domäne: pEG-scRPB7 (Hefe-PolII-Untereinheit).

4. Y2H-Analyse des menschlichen nucleären Rezeptors RXR, der gegen (etwa) 88 × 104 cDNA-Clone abgesucht wurde. Jede Vertiefung der drei gezeigten Platten mit 96 Vertiefungen stellt einen &bgr;gal-Test dar, die mit einem pEG202-RXR-Köder-Plasmid enthaltenen Hefestamm, der mit etwa 1000 Hefe-Clone einer pJG4.5 AD-Bibliothek gepaart wurde, durchgeführt wurde. Die acht Vertiefungen am linken Rand jeder Platte sind positive und negative Kontrollen (von oben nach unten auf der Platte); a) pEG202 × pjGRXR, b) pEG202, c) pEGKREV1 × pjGRAF, d) pEGKREV1 × pJGKRIT1, e) pEGRAS × pJGKRIT1, f) pEGRAS × pJGRAF, g) pEGRXR × pJGGOR4 und h) pEGGOR4 × pJGRXR.

5. Strategie zur Clonierung des offenen Leserahmens. Clonierung des offenen Leserahmens. A. Fusion der Leserahmenverschiebung mit &bgr;gal+. Eine zufällig gescherte cDNA mit einer Größe von etwa 600 Basenpaaren wurde isoliert und in ein &bgr;gal-Gen mit Leserahmenverschiebung cloniert. Transformierte E. coli-Zellen, die &bgr;gal+ wurden, enthielten einen offenen Leserahmen. B. Fusion der Leserahmenverschiebung mit &bgr;gal+ in einem Sup+-Wirt. In einem Vektor mit einem Amber-Suppressor-Terminations-Codon zwischen dem 3'-Ende der cDNA und dem 5'-Ende von &bgr;gal wurde die Fusion der cDNA mit dem &bgr;gal durch den Sup-Phänotyp des E. coli-Stamms kontrolliert. C. Die Fusion der Leserahmenverschiebung mit M13gpIII in einem Sup+-Wirt. Der gleiche Typ des Clonierungsschemas kann adaptiert werden, um das 5'-Ende des M13-Phagen-Display-Proteins mit der cDNA zu fusionieren, in diesem Fall werden lebende Phagen die erfolgreiche Clonierung des offenen Leserahmens anzeigen.

6. Dynamische Umcodierung der 3'-Hefe-Aktivierungsdomäne. Translation der T7-Kontrollelemente (T7CE). Das 3'-Ende der Hefe-Aktivierungsdomäne (AD) wurde umcodiert, um die Kontrollelemente für die Genexpression in E. coli aufzunehmen. Gezeigt wird ein Beispiel der Umcodierung der Kontrollelemente, die für die Expression des Bakteriophagen-T7-Proteins benötigt wird. Die umcodierte Hefe-Aktivierungsdomäne wurde anschließend in Verbindung mit dem System zur Clonierung des offenen Leserahmens verwendet, um den korrekten Leserahmen mit der Aktivierungsdomäne und gleichzeitig mit einem getrennten 3'-Fusionsprotein (zum Beispiel &bgr;gal oder M13gp3) zu fusionieren. Legende: 1 = Hefe; 2 = cDNA-Insertion; 3 = Leserahmenverschiebung.

7. Phänotypische Auswahl der offene Leserahmen-cDNA in E. coli und deren gleichzeitige Fusion an das 3'-Ende der Hefe-Aktivierungsdomäne (AD) und dem 5'-Ende von M13gpIII. A. Clonierung von zufälligen, 500 bp großen cDNA-Fragmenten; Transformation von T7RNAP+, Sup+ E. coli; Absuchen der Plaques; B. Phagen-Display in E. coli; C. Hefe-Zwei-Hybrid in Hefe: Transformation von T7RNAP-Sup+ E. coli; Transformation von M13 in Sup-Hefe. Legende: 1 = Hefe; 2 = Insertionsstelle; 3 = Leserahmenverschiebung.


Anspruch[de]
Verfahren zum Ermitteln einer Interaktion zwischen einem ersten Test-Protein und einem zweiten Test-Protein, das umfasst:

(a) das Bereitstellen einer Hefe-Wirtszelle, die ein Reporter-Gen enthält, wobei das Reporter-Gen ein nachweisbares Protein exprimiert, wenn das Reporter-Gen von einer Aminosäuresequenz, die eine Transkriptions-Aktivierungsdomäne enthält, aktiviert wird, wenn die Transkriptions-Aktivierungsdomäne in ausreichender Nähe zu dem Reporter-Gen ist;

(b) das Bereitstellen eines ersten chimären Gens, das von der Hefe-Wirtszelle exprimiert wird, wobei das erste chimäre Gen eine DNA-Sequenz umfasst, die ein erstes Hybrid-Protein codiert, wobei das erste Hybrid-Protein umfasst:

(i) eine DNA-bindende Domäne, die eine Bindestelle auf dem Reporter-Gen in der Wirtszelle erkennt; und

(ii) ein erstes Test-Protein oder Fragment davon, das auf Interaktion mit mindestens einem zweiten Test-Protein oder Fragment davon getestet werden soll;

(c) das Bereitstellen eines zweiten chimären Gens, das in der Hefe-Wirtszelle exprimiert wird, wobei das zweite chimäre Gen eine DNA-Sequenz umfasst, die ein zweites Hybrid-Protein codiert, wobei das zweite Hybrid-Protein umfasst:

(i) die Transkriptions-Aktivierungsdomäne;

(ii) ein zweites Test-Protein oder Fragment davon, das auf Interaktion mit dem ersten Testprotein oder Fragment davon getestet werden soll; wobei Interaktion zwischen dem ersten Test-Protein und dem zweiten Test-Protein in der Hefe-Wirtszelle die Transkriptions-Aktivierungsdomäne veranlasst, die Transkription des Reporter-Gens zu aktivieren;

(d) das Einführen des zweiten chimären Gens in einen Hefe-Wirtszellstamm eines ersten Paarungstyps und das anschließende Einführen der Zellen in eine Array-Vorrichtung, wobei eine Master-Bibliotheksplatte erstellt wird;

(e) das Einführen von Zellen von der Master-Bibliotheksplatte in eine zweite Array-Vorrichtung, die eine Array-Vorrichtung für flüssiges Medium ist, wobei ein Paarungssatz erstellt wird;

(f) das Einführen des ersten chimären Gens in einen Hefe-Wirtszellstamm des entgegengesetzten Paarungstyps zu (d) und anschließend das Einführen der Zelle in den Paarungssatz, wodurch es ermöglicht wird, dass die Paarung in flüssigem Medium erfolgt; und

(g) das Selektieren nach Auswuchs der Interaktion der ersten und zweiten Gene.
Verfahren zum Nachweisen einer Interaktion zwischen einem ersten Test-Protein und einem zweiten Test-Protein gemäß Anspruch 1, das die zusätzlichen Schritte umfasst:

(h) das Entfernen eines Teils des Paarungssatzes zu einer dritten Array-Vorrichtung, wobei ein Rettungssatz erstellt wird;

(i) das Ermitteln, ob das Reporter-Gen in dem Paarungssatz exprimiert wurde; und

(j) das Analysieren der Zellen von der Rettungsplatte.
Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei die Wirtszelle Saccharomyces cerevisiae ist. Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Reporter-Gen ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus LEU2, lacZ, HIS3, URA3, LYS2, GAL1, E. coli-galK, GFP, CUP1, CAT, G418 und GUS.






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