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Dokumentenidentifikation DE102006027450A1 13.12.2007
Titel Verfahren zur Induktion der Insulinsynthese in Chorionzellen
Anmelder Justus-Liebig-Universität Gießen, 35390 Gießen, DE
Erfinder Baal, Nelli, 35435 Wettenberg, DE;
Jahr, Henning, Dr. rer. nat., 35444 Biebertal, DE;
Reisinger, Kerstin, Dr., 61169 Friedberg, DE;
Zygmunt, Marek, Prof. Dr. med., 35440 Linden, DE;
Fast, Stefanie, 35418 Buseck, DE
Vertreter Riechert, A., Rechtsanw., 60314 Frankfurt
DE-Anmeldedatum 12.06.2006
DE-Aktenzeichen 102006027450
Offenlegungstag 13.12.2007
Veröffentlichungstag im Patentblatt 13.12.2007
IPC-Hauptklasse C12N 5/06(2006.01)A, F, I, 20060612, B, H, DE
IPC-Nebenklasse A61K 38/28(2006.01)A, L, I, 20060612, B, H, DE   
Zusammenfassung Die vorliegende Erfindung bietet ein einfaches, leicht durchführbares Verfahren zur Induktion der Insulinsynthese in isolierten Chorionzellen, die aus der Eihaut gewonnen wurden. Die Zellen werden durch Zugabe von L-Gastrin und GLP-1 bzw. Exendin-4 zur Insulinsynthese angeregt, wobei eine große Insulinmenge freigesetzt wird. Damit sind die Zellen und das Verfahren zur Induktion der Insulinsynthese zur Herstellung eines Mittels zur Behandlung von Diabetes mellitus geeignet.

Beschreibung[de]
Verfahren zur Induktion der Insulinsynthese in Chorionzellen

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Induktion der Insulinsynthese in isolierten Chorionzellen und ihre Verwendung zur Transplantation und bei der Herstellung eines Mittels zur Behandlung des Diabetes mellitus.

Beschreibung und Einleitung des allgemeinen Gebietes der Erfindung

Die Plazenta als ein kurzlebiges transientes Organ verfügt über eine Reihe von pluripotenten Zellen, welche ohne ethische Probleme in hoher Zahl und ohne Belastung für Mutter und Kind entnommen werden können. Hierzu zählen Stammzellen aus dem Nabelschnurblut sowie Amnion- und Chorionzellen. Für die Transplantation sind sie hervorragend geeignet, da sie neben ihrem Stammzellähnlichen Phänotyp eine immunologische Unreife aufweisen und damit eine wesentlich geringere Abstoßungsreaktion bei Transplantation hervorrufen, als adulte Zellen.

Stand der Technik

Zahlreiche wissenschaftliche Arbeitsgruppen beschäftigen sich damit, Stammzellen auch zur Therapie von Diabetes im speziellen Diabetes Typ-1 einzusetzen.

Die Differenzierung von embryonalen Stammzellen führte dabei bisher nur zu geringer Insulinproduktion, die durch ein hohes Risiko, Teratome zu bilden, begleitet wird, so dass die Anwendung neben ethischen auch gesundheitliche- Probleme aufwirft. Die Differenzierung mesenchymaler Zellen wie Zellen des Knochenmarks oder Zellen aus dem Nabenschnurblut sind bisher in Ansätzen verfolgt worden, in denen die Zellen durch virale Transfektion von Differenzierungsgenen zur Insulinsynthese und -sezernierung angeregt worden waren, wodurch die spätere potentielle Transplantation in Menschen erschwert wird.

Dies trifft ebenso auf die Differenzierung endodermaler Zellen wie Leber- oder Dünndarmzellen zu, dem bisher erfolgreichsten Ansatz. Die Induktion der Insulinsynthese bis zu einem Drittel der Produktion in authentischen Inselzellen war allerdings nur nach retroviraler- bzw. adenoviraler Transfektion von Differenzierungsgenen bzw. des Telomerasegens möglich. Ausgehend von plazentaren Zellen wurde bisher nur eine Arbeit zur induzierten Insulinsynthese veröffentlicht, in der Amnionzellen in diabetische Mäuse injiziert wurden. Da Insulin nur auf der mRNA Ebene detektiert wurde, ist der tatsächliche Erfolg dieses Ansatzes nur schwer abzuschätzen.

Zurzeit gewährleisten lediglich Transplantationen von Pankreas- bzw. Inselzellen eine physiologisch regulierte Insulinfreisetzung in Diabetespatienten. Im Vergleich zur konventionellen Insulin-Therapie führt dies immerhin zu einer Verhinderung oder zumindest Verzögerung der Diabetes-spezifischen Sekundärkomplikationen. Die Pankreas- bzw. Inselzelltransplantation ist jedoch durch das begrenzte Spenderaufkommen nur bei wenigen Patienten einsetzbar.

Daher besteht der dringende Bedarf an geeigneten Zellen, in denen die Insulinsynthese induziert werden kann und ein entsprechendes Verfahren zur Induktion der Insulinsynthese in diesen Zellen.

Aufgabe

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein einfaches, leicht durchführbares Verfahren zur Induktion der Insulinsynthese in isolierten Chorionzellen bereitzustellen, wobei die Chorionzellen und die Kultivierungsbedingungen so optimiert sind, dass eine hohe Insulinmenge erzeugt wird und die Nachteile im Stand der Technik überwunden werden.

Lösung der Aufgabe

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch ein Verfahren mit den Merkmalen des Anspruchs 1.

Das Verfahren zeichnet sich aus durch eine besondere Kultivierungsmethode der isolierten Chorionzellen und dem gezielten Zusatz einer Kombination von speziellen Substanzen, die die Differenzierung von Chorionzellen zu Insulinproduzierenden Zellen fördern. Diese Substanzen entstammen der Gruppe der Enterohormone, wie Gastrin sowie dessen Derivate und Glucagon-like polypeptide 1 (GLP-1) sowie dessen Derivate einschließlich Exendin-4, oder es sind Wachstums-und Differenzierungsfaktoren wie Hepatocyte growth factor (HGF), Vascular endothelial growth factor-A (VEGF-A), Nerve growth factor-&agr; (NGF-&agr;), Betacellulin, Epidermal growth factor (EGF)-Rezeptoren bindende Substanzen und/oder Substanzen, die die intrazelluläre cAMP-Konzentration erhöhen.

Vorteilhafterweise werden als Zellen zur Induktion der Insulinsysnthese Stammzellen aus der Plazenta insbesondere dem Chorion verwendet. Diese Chorionzellen entstammen ausschließlich der Eihaut und weisen keine Verunreinigungen durch Amnionzellen oder Chorionzellen aus anderen Teilen der Plazenta auf. Diese Zellen sind aber soweit differenziert, dass eine Tumorbildung nach Injektion nahezu ausgeschlossen werden kann. Damit sind diese Zellen für das Verfahren zur Induktion der Insulinsynthese besser geeignet, als bisher im Stand der Technik bekannte Zellen, die eine mögliche Teratombildung bedingen und/oder nur durch eine virale Transfektion zur Insulinproduktion fähig sind.

Im Unterschied zu Zellen aus dem Amnion und Zellen aus anderen Teilen der Plazenta exprimieren die erfindungsgemäßen Chorionzellen endodermale Marker wie z.B. &agr;-Fetoprotein (AFP) (1) in vivo und werden nicht mit Differenzierungsgenen wie PDX-1, MAF1 oder NeuroD mittels retro- bzw. adenoviraler Vektoren transfiziert.

Endodermale Marker wie z.B. &agr;-Fetoprotein (AFP) zeigen an, dass die erfindungsgemäßen Chorionzellen zu endodermalen Zellen wie Dünndarm- oder Leberzellen differenzieren können.

Das Verfahren zur Induktion von Insulin in isolierten Chorionzellen weist folgende Schritte auf:

  • a) Bereitstellung und Kultivierung von Chorionzellen
  • b) Erzeugung und Kultivierung von Chorionzell-Sphäroiden
  • b) Induktion der Insulinsynthese

a) Bereitstellung und Kultivierung von Chorionzellen

Chorionzellen werden aus Choriongewebe eines Säugetieres, bevorzugt eines Menschen durch Abtrennung der gesamten Eihaut von der restlichen Plazenta und Verwerten des Amnions erhalten. Das Choriongewebe wird zerkleinert und einer Kollagenasebehandlung unterzogen, so dass Chorioneinzelzellen entstehen. Die Kultivierung der Chorioneinzelzellen erfolgt in Medium, wobei die adhärente Kultivierung der Chorioneinzelzellen vorzugsweise in serumfreiem oder in fötales Kälberserum enthaltendem Kulturmedium erfolgt.

b) Erzeugung und Kultivierung von Chorionzell-Sphäroiden

Die Erzeugung von Chorionzell-Sphäroiden erfolgt durch Kultur der mechanisch oder enzymatisch abgelösten Zellen in serumfreiem oder Medium, das fötales Kälberserum enthält, auf nicht-adhärenten Zellkulturmaterialien, so dass die Zellen als frei flotierende Aggregate in dreidimensionaler Form (=Sphäroide) vorliegen. Nicht-adhärente Zellkulturmaterialien sind beispielsweise Zellkulturflaschen für Suspensionskultur aus Plastik.

Alternativ erfolgt die Kultivierung der Chorionzellen auf Matrigel zu adhärenten Chorionzell-Sphäroiden in serumfreien Medium oder Medium, das fötales Kälberserum enthält.

c) Induktion der Insulinsynthese durch Zugabe von Enterohormon

Die Induktion der Insulinsynthese erfolgt durch Kultivierung der Chorionzell-Sphäroide in serumfreien Medium oder Medium, das fötales Kälberserum enthält auf nicht-adhärenten Zellkulturmaterialien und gezielter Zugabe von Enterohormonen wie Gastrin oder einem Gastrin-Derivat und GLP-1 bzw. einem GLP-1-Derivat, z.B Exendin-4. In den Chorionzell-Sphäroiden wird auf diese Weise die Bildung sowohl von Insulin-mRNA als auch von Insulin-Protein induziert. Der Gehalt an zellulärem Insulinprotein (gemessen als Insulin-C-Peptid) liegt dabei im Durchschnitt bei 37 ± 7 ng (MW ± SEM, n = 6) pro mg Gewebeprotein. Dies entspricht bei einem molekularen 1:1 Verhältnis einer Insulinmenge von 58 ng bis 77 ng Insulin.

Alternativ erfolgt die Induktion der Insulinsynthese der auf Matrigel adhärenten Chorionzell-Sphäroide durch Kultivierung in serumfreien Medium oder Medium, das fötales Kälberserum enthält, mit Enterohormonen wie Gastrin oder einem Gastrin-Derivat und GLP-1 bzw. einem GLP-1-Derivat, z.B. Exendin-4. Der Gehalt an zellulärem Insulinprotein (gemessen als Insulin-C-Peptid) liegt hierbei im Durchschnitt bei 73 ± 7 ng (MW ± SEM, n = 3) pro mg Gewebeprotein. Dies entspricht bei einem molekularen 1:1 Verhältnis einer Insulinmenge von 135 ng bis 154 ng Insulin.

Alternativ werden neben den Enterohormonen Gastrin und/oder dessen Derivate, GLP-1 und/oder dessen Derivate einschließlich Exendin-4 auch Hepatocyte growth factor (HGF), Vascular endothelial growth factor-A (VEGF-A), Nerve growth factor-&agr; (NGF-&agr;), Betacellulin, Epidermal growth factor (EGF)-Rezeptoren bindende Substanzen und/oder Substanzen, die die intrazelluläre cAMP-Konzentration erhöhen, verwendet, um die Insulinsynthese zu induzieren. Substanzen, die die intrazelluläre cAMP-Konzentration erhöhen sind beispielsweise db-cAMP, 8-Br-cAMP, oder Isobutyl-Methyl-Xanthin.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Induktion der Insulinsynthese in isolierten Chorionzellen ist einfach durchführbar und erzeugt hohe Insulinmengen. Damit sind diese Zellen zur Herstellung eines Mittels zur Behandlung von Diabetes bei Patienten geeignet.

Die Erfindung betrifft weiterhin ein Mittel zur Behandlung von Diabetes bei Patienten, das Chorionzellen beinhaltet, die durch Zugabe von Enterohormonen zur Insulinsysnthese angeregt werden.

Der Begriff Patient bezieht sich dabei gleichermaßen auf Menschen und Wirbeltiere. Damit kann das Mittel zur Behandlung von Diabetes in der Human- und Veterinärmedizin verwendet werden.

Das Mittel zur Behandlung von Diabetes der vorliegenden Erfindung wird den Patienten, als Teil einer pharmazeutisch akzeptablen Komposition entweder oral, rektal, parenteral intravenös, intramuskulär oder subkutan, intracisternal, intravaginal, intraperitoneal, intravasculär, lokal (Puder, Salbe oder Tropfen) oder in Sprayform verabreicht.

Pharmazeutisch akzeptable Kompositionen können die Modifikationen als Salze, Ester, Amide und "Prodrugs" beinhalten, sofern sie nach zuverlässiger medizinischer Beurteilung keine übermäßige Toxizität, Irritationen oder allergische Reaktionen am Patienten auslösen.

Der Terminus "Prodrug" bezieht sich auf Verbindungen, die zur Verbesserung der Aufnahme transformiert werden, wie beispielsweise durch Hydrolyse im Blut. Dosierungsformen für die örtliche Administration des Impfstoffes dieser Erfindung schließen Salben, Puder, Sprays oder Inhalationsmittel ein. Die aktive Komponente wird unter sterilen Bedingungen, mit einem physiologisch akzeptablen Trägerstoff und möglichen Preservativen, Puffern oder Treibmitteln, je nach Bedarf, vermischt.

Ausführungsbeispiele a) Bereitstellung und Kultivierung von Chorionzellen i) Isolierung von Chorionzellen

Von einer Plazenta, die beispielsweise durch Kaiserschnitt nach normaler Schwangerschaft erhalten wird, wird das Chorion laevi einschließlich der daran befindlichen Reste der äußeren Capsula decidua abgetrennt. Die restliche Plazenta, einschließlich des Amnions, wird nicht weiter verwendet. Das Choriongewebe wird in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) von Blutresten befreit. Beispielsweise werden etwa 50 cm2 des Choriongewebes in etwa 1 cm2 große Fragmente zerkleinert und anschließend in einer Kollagenaselösung beispielsweise 200 mg/70 ml PBS inkubiert, vorzugsweise 60 Minuten bei 37°C. Dabei erfolgt die Zerlegung des Gewebes in Einzelzellen und Bindegewebsfragmente.

Die Reaktion wird durch Zugabe von 10% fötalem Kälberserum-haltigem Kulturmedium beendet und die Suspension durch einen Filter mit Porengröße von 70 &mgr;m gefiltert. Die Zellen werden anschließend von der Enzymlösung getrennt, z.B. durch zweimalige Zentrifugation 634 g 10 min, und in Epithelzellmedium, z.B. Quantum 286 (PAA, Cölbe) kultiviert, vorzugsweise in einer Konzentration von 0,5 × 106 Zellen/ml bei 37°C.

ii) Adhärente Zellkultur

Nach etwa 24h wird das Kulturmedium erneuert und dabei nicht adhärente Zellen entfernt. Die Zellen werden für ein bis drei weitere Tage kultiviert.

b) Erzeugung und Kultivierung von Chorionzellen Suspensions-Zellkultur

Die adhärent gewachsenen Zellen werden vom Boden der Kulturflaschen abgelöst und in solche Zellkulturflaschen überführt, die eine Adhärenz weitgehend verhindern, beispielsweise Zellkulturflaschen für Suspensionskultur aus Plastik, so dass sich in serumfreien Opti-MEM (Invitrogen, Karlsruhe) frei flotierende Zellsphäroide von ca. 0,1 – 0,2 mm Durchmesser bilden.

c) Induktion der Insulinsynthese

Dem serumfreien Medium werden Substanzen zugegeben, die die Differenzierung von Chorionzellen zu insulinproduzierenden Zellen fördern. Im Besonderen ist dies eine Mischung aus L-Gastrin (Endkonzentration 100 ng/ml) und dem Inkretinhormon GLP-1 (7–36) (Endkonzentration 50 ng/ml) oder einem Analogon des Inkretinhormons wie beispielsweise Exendin-4 (Endkonzentration 50 ng/ml). Alleiniger Zusatz von L-Gastrin oder GLP-1 (bzw. Exendin-4) fördert ebenfalls die Differenzierung zu insulinproduzierenden Zellen, jedoch wesentlich weniger wirksam, als bei kombinierter Gabe. Eine Induktion der Insulinproduktion wird auch durch Zugabe anderer Peptide induziert, wie beispielsweise durch Hepatocyte growth factor (HGF), Vascular endothelial growth factor-A (VEGF-A), Nerve growth factor-&agr; (NGF-&agr;), Betacellulin, Epidermal growth factor (EGF), oder durch Substanzen die die intrazelluläre cAMP-Konzentration erhöhen (beispielsweise db-cAMP, 8-Br-cAMP, oder Isobutyl-Methyl-Xanthin).

Die Chorionzell-Sphäroide werden 7–21 Tage in serumfreien Medium als Suspensionskultur mit L-Gastrin und Exendin-4 bei 37°C bzw. mit den Substanzen, die die Differenzierung von Chorionzellen zu insulinproduzierenden Zellen fördern inkubiert, wobei das Medium regelmäßig gewechselt wird.

Alternativ erfolgt die Kultur, unter ansonsten gleichen Bedingungen, nach Adhärenz der Chorionzell-Sphäroide auf Matrigel-beschichteten Plastikmaterial, bspw. auf BioCoat Thin-Layer Matrigel Matrix 6-Well Zellkulturplatten von BD-Biosciences Discovery Labware (Heidelberg).

Analyse der Insulinsynthese in den als Sphäroide kultivierten Zellen

Definierte Aliqots der Chorionzell-Sphäroide aus den Suspensionskulturen werden durch Zentrifugation als Pellet gesammelt. Bei den auf Matrigel adhärierten Sphäroiden wird das Matrigel mit Dispase aufgelöst (entsprechend einer Vorschrift des Herstellers) und definierte Aliquots der Zellen werden ebenfalls durch Zentrifugation pelletiert.

Expression des Insulingens

In einem Aliquot wird die Expression des Insulingens auf der Ebene der mRNA durch RT-PCR überprüft. Dazu erfolgt eine Isolierung der RNA nach einem, dem Fachmann bekannten Standardverfahren z.B. auf folgende Weise:

Die RNA wird mittels "Perfect RNATM, Eukaryotic, Mini Kit" (Eppendorf, Hamburg) entsprechend den Herstellerangaben extrahiert und dann mit dem Cloned AMV First Strand cDNA Synthesis Kit (Invitrogen, Karlsruhe) ebenfalls entsprechend den Herstellerangaben revers transkribiert. Die komplementäre DNA wird dann mit HotMasterMix (Eppendorf) unter folgenden Bedingungen amplifiziert: 35 PCR-Zyklen (95 °C für 45 sec, 58 °C für 30 sec, 68 °C für 45 sec) und 68 °C für 5 min nach dem initialen Denaturierungsschritt (95 °C für 2 min). Die mRNA-Banden werden auf beta-Actin bezogen. Für die Amplifizierung werden beispielsweise die folgenden Primer verwendet: Insulin, 5'-CTC ACA CCT GGT GGA AGC TC-3' und 5'-AGA GGG AGC AGA TGC TGG TA-3'; beta-Actin, 5'-TTC CAG CCT TCC TTC CTG G-3' und 5-TTG CGC TCA GGA GGA GCA AT-3'. Das PCR-Produkt entspricht einer Länge von 245 bp. Siehe 2.

Bestimmung des zellulären Insulingehaltes

Die aus den Aliquoten erhaltenen Pellets werden nach Suspension in Albuminhaltigem Phosphatpuffer mit Ultraschall aufgeschlossen und der Gehalt an Insulin-C-Peptid wird mittels Enzymimmunoassay z.B. Mercodia (Uppsala, Schweden) nach Herstellerangaben bestimmt. Insulin-C-Peptid wird gemessen, da auch das Opti-MEM Medium Insulin enthält und so die Ergebnisse verfälscht werden würden. Der verwendete C-Peptid-Assay zeigt keinerlei Kreuzreaktion mit Insulin.

Ergebnis: Beim Zusatz von L-Gastrin + GLP-1 bzw. Exendin-4 werden zelluläre Insulin-C-Peptid-Werte von 37 ± 7 ng/mg Zellprotein für Suspensionskulturen von Zellspäroiden (dies entspricht bei einem molekularen 1:1 Verhältnis einer Insulinmenge von 58 ng bis 77 ng Insulin) und 73 ± ng/mg Zellprotein für Matrigel-Kulturen von Zellsphäroiden erhalten (dies entspricht bei einem molekularen 1:1 Verhältnis einer Insulinmenge von 135 ng bis 154 ng Insulin) (3). Die zellulären C-Peptid-Gehalte von Chorionzell-Sphäroiden kultiviert ohne eines der im Ausführungsbeispiel genannten Zusätze liegt bei 0.8 ± 0.5 ng/mg Zellprotein für Suspensionskulturen und bei 12 ± 3 ng/mg Zellprotein für Matrigel-adhärierte Chorionzell-Sphäroide.

Bestimmung des Gesamtproteingehaltes

Aus den Aliquoten erhaltene Pellets werden nach Suspension in aqua dest mit Ultraschall aufgeschlossen und der Proteingehalt des Homogenats mit einem kolorimetrischen Kit z.B. dem Total Protein Kit, Micro Lowry von Sigma (St. Louis, Mo, USA) nach Herstellerangaben bestimmt

Abbildungslegenden Fig. 1 zeigt die Expression von AFP im Choriongewebe.

Dargestellt ist eine Anfärbung von Kryoschnitten aus humanem Plazentagewebe, wobei die Expression des endodermalen Markers AFP durch Inkubation mit Ziegen-anti-AFP-Primärantikörper (Santa Cruz Biotechnology, Inc.; Santa Cruz, CA) und nachfolgende Darstellung mit 1:400 verdünntem Fluorescein-Isothiocyanat-gekoppeltem Esel-anti-Ziege Immunglobulin (Dianova, Hamburg) verdeutlicht wird. AFP-Expression ist vor allem im Chorionmesenchym zu finden.

Zellkerne werden durch Anfärbung mit Bisbenzimide (Höchst 33342) deutlich. Die Vergrößerung beträgt 1:100.

Fig. 2 zeigt die induzierte Insulin mRNA aus Chorionzellen

Aus Chorionzellen gewonnene Chorionzell-Sphäroide werden eine Woche entweder ohne Enterohormone (als Minuszeichen dargestellt „„) oder mit einer Kombination von 100 ng/ml Gastrin und 50 ng/ml GLP-1 (als Pluszeichen dargestellt „+") inkubiert. Gesamt RNA wird extrahiert und in cDNA umgeschrieben. Abschließend werden Insulin mRNA und als positive Kontrolle beta-Aktin mRNA mittels PCR amplifiziert. Ein Insulin mRNA Amplifikationsprodukt ist nur in der Probe mit einer Kombination von 100ng/ml Gastrin und 50 ng/ml GLP-1 (als Pluszeichen dargestellt „+") nachweisbar.

Fig. 3 zeigt den Insulin C-Peptid Gehalt nach Induktion in Chorionzellen

Aus Chorionzellen gewonnene Chorionzell-Sphäroide werden eine Woche ohne Enterohormone (als Minuszeichen dargestellt „–„) oder mit einer Kombination von 100 ng/ml Gastrin und 50 ng/ml GLP-1 (als Pluszeichen dargestellt „+") inkubiert. Dabei liegt der Gehalt an zellulärem Insulin-C-Peptid bei den frei flotierenden Chorionzell-Sphäroiden im Durchschnitt bei 37 ± 7 ng (MW ± SEM, n = 6), bei den auf Matrigel adhärenten Chorionzell-Sphäroiden im Durchschnitt bei 73 ± 7 ng (MW ± SEM, n = 3).


Anspruch[de]
Verfahren zur Induktion von Insulin in isolierten Chorionzellen bestehend aus den Schritten

a) Bereitstellung und Kultivierung von Chorionzellen

b) Erzeugung und Kultivierung von Chorionzell-Sphäroiden

c) Induktion der Insulinsynthese
Verfahren gemäß Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet dass die isolierten Chorionzellen aus der Eihaut eines Säugetieres entnommen wurden. Verfahren gemäß der vorangegangenen Ansprüche dadurch gekennzeichnet dass die Chorionzellen in Medium kultiviert werden. Verfahren gemäß der vorangegangenen Ansprüche dadurch gekennzeichnet dass das Medium serumfreies oder fötales Kälberserum enthaltenes Kulturmedium ist. Verfahren gemäß der vorangegangenen Ansprüche dadurch gekennzeichnet dass die Induktion durch Zugabe von Enterohormon erfolgt. Verfahren gemäß Anspruch 6 dadurch gekennzeichnet dass Enterohormon ausgewählt sind aus der Gruppe L-Gastrin und dessen Derivate, Exendin-4 und dessen Derivate, Glucagon-like polypeptide 1 (GLP-1) sowie dessen Derivate einschliesslich Exendin-4, Hepatocyte growth factor (HGF), Vascular endothelial growth factor-A (VEGF-A), Nerve growth factor-&agr; (NGF-&agr;), Betacellulin, Epidermal growth factor (EGF)-Rezeptoren bindende Substanzen und Substanzen, die die intrazelluläre cAMP-Konzentration erhöhen. Verfahren gemäß Anspruch 7 dadurch gekennzeichnet dass Substanzen, die die intrazelluläre cAMP-Konzentration erhöhen ausgewählt sind aus der Gruppe db-cAMP, 8-Br-cAMP, Isobutyl-Methyl-Xanthin. Verfahren gemäß Anspruch 5 bis 7 dadurch gekennzeichnet dass die Induktion durch Zugabe von L-Gastrin und GLP-1 erfolgt. Verfahren gemäß Anspruch 5 bis 7 dadurch gekennzeichnet dass die Induktion durch Zugabe von L-Gastrin und Exendin-4 erfolgt. Verfahren gemäß Anspruch 5 bis 9 dadurch gekennzeichnet dass die Induktion durch Zugabe von 100 ng/ml L-Gastrin und 50 ng/ml Exendin-4 erfolgt. Verfahren gemäß Anspruch 5 bis 9 dadurch gekennzeichnet dass die Induktion durch Zugabe von 100ng/ml L-Gastrin und 50 ng/ml GLP-1 erfolgt. Verfahren gemäß der vorangegangenen Ansprüche dadurch gekennzeichnet dass die Kultivierung der Chorionzellen nicht-adhärent erfolgt. Verfahren gemäß Anspruch 12 dadurch gekennzeichnet dass 30ng bis 40 ng zelluläres Insulin-C-Peptid pro mg Gewebeprotein entstehen. Verfahren gemäß der Ansprüche 1 bis 11 dadurch gekennzeichnet dass die Kultivierung der Chorionzellen auf Matrigel erfolgt. Verfahren gemäß Anspruch 14 dadurch gekennzeichnet dass 70 ng bis 80 ng zelluläres Insulin-C-Peptid pro mg Gewebeprotein entstehen. Chorionzellen zur Induktion von Insulin aus Choriongewebe der Eihaut dadurch gekennzeichnet dass in ihnen die Insulinsynthese durch Zugabe von Enterohormonen ausgewählt aus der Gruppe Gastrin und dessen Derivate, Glucagon-like polypeptide 1 (GLP-1) sowie dessen Derivate einschließlich Exendin-4, Hepatocyte growth factor (HGF), Vascular endothelial growth factor-A (VEGF-A), Nerve growth factor-&agr; (NGF-&agr;), Betacellulin, Epidermal growth factor (EGF)-Rezeptoren bindende Substanzen, Substanzen, die die intrazelluläre cAMP-Konzentration erhöhen, induziert wird. Chorionzellen gemäß Anspruch 16 dadurch gekennzeichnet dass die Induktion der Insulinsynthese durch Zugabe von L-Gastrin und GLP-1 erfolgt. Chorionzellen gemäß Anspruch 17 dadurch gekennzeichnet dass die Induktion der Insulinsynthese durch Zugabe von 100ng/ml L-Gastrin und 50 ng/ml GLP-1 erfolgt. Chorionzellen gemäß Anspruch 16 dadurch gekennzeichnet dass die Induktion der Insulinsynthese durch Zugabe von L-Gastrin und Exendin-4 erfolgt. Chorionzellen gemäß Anspruch 19 dadurch gekennzeichnet dass die Induktion der Insulinsynthese durch Zugabe von 100ng/ml L-Gastrin und 50 ng/ml Exendin-4 erfolgt. Chorionzellen gemäß der vorangegangenen Ansprüche 16 bis 20 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Diabetes. Mittel zur Behandlung von Diabetes mellitus, dadurch gekennzeichnet dass es Chorionzellen gemäß Anspruch 16 bis 21 enthält.






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