Thrombin ist eine Serinprotease, die in Blutplasma in der Form von einer Vorstufe, Prothrombin, vorhanden ist. Thrombin ist für wachstumsfördernde Aktivität für eine breite Vielzahl von Zellen aus verschiedenen Geweben durch Aktivierung eines speziellen Zelloberflächenrezeptors, der als der Rezeptor von nicht proteolytisch aktiviertem Thrombin bekannt ist, bekannt. Beispielsweise wurde gezeigt, dass Thrombin die Angiogenese, die Entwicklung neuer Blutgefäße, fördert und die Endothelzellproliferation stimuliert (siehe beispielsweise US-Patent 5 352 664, 5 500 412).

Thrombinpeptidderivate sind synthetische Analoga von Thrombin, die eine Aminosäuresequenz aufweisen, die zumindest teilweise von der von Thrombin abgeleitet ist, und die an dem Rezeptor von nicht proteolytisch aktiviertem Thrombin aktiv sind. Beispielsweise wurde für Thrombinpeptidderivate aus den Aminosäuren 5080-530 von humanem Prothrombin durch die Erfinder der vorliegenden Erfindung beschrieben, dass sie eine thrombinrezeptorvermittelte Zellstimulation fördern und bei der Behandlung von Wunden, der Stimulation von Knochenwachstum und Knorpelwachstum oder -wiederherstellung und der Förderung von Herzgewebewiederherstellung verwendbar sind (siehe beispielsweise US-Patent 5 352 664, 5 500 412, WO 02/07748, WO 02/005836, WO 02/004008 und WO 03/013569).

Thrombinpeptidderivate zeigen großes Potential als Pharmazeutika wegen deren therapeutischer Aktivität zur Behandlung von Wunden, Stimulation von Knochenwachstum und Knorpelwachstum und Förderung der Herzwiederherstellung. Unglücklicherweise sind jedoch Thrombinpeptidderivate hochempfindlich gegenüber Dimerisierung. Beispielsweise dimerisiert TP508, ein Beispiel für ein Thrombinpeptidderivat, das die Aminosäuresequenz H-Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val-NH₂ (SEQ ID NO: 4) aufweist, über die Zeit und es weist eine Halbwertszeit von etwa 2 bis etwa 4 h in bestimmten gepufferten Lösungen bei neutralem pH-Wert und eine Halbwertszeit von etwa 7 Tagen bei hohen Peptidkonzentrationen in steriler Kochsalzlösung auf (siehe Beispiel 1).

Es ist daher notwendig, Verfahren zur Aufrechterhaltung der Reinheit von Thrombinpeptidderivaten über längere Zeiträume und zur Verhinderung oder Verringerung einer Dimerisierung zu entwickeln, so dass Thrombinpeptidderivate eine lange Lagerungsbeständigkeit aufweisen und es möglich ist, präzise und reproduzierbare Dosierungen auch nach Lagerung über längere Zeiträume zu liefern.

Es wurde nun ermittelt, dass eine pharmazeutische Zusammensetzung, die ein Thrombinpeptidderivat und einen Dimerisierungsinhibitor umfasst, die monomere Form des Thrombinpeptidderivats im wesentlichen frei von Dimeren beibehält. Ein Dimerisierungsinhibitor ist eine Verbindung, die die Dimerisierung eines Thrombinpeptidderivats hemmt oder verringert. Dimerisierungsinhibitoren umfassen Chelatbildner und/oder eine Thiolgruppe enthaltende Verbindungen. In einem Beispiel behielt TP501 in Gegenwart eines Chelatbildners, Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), dessen monomere Form zu mehr als 90 Gew.-% über zwei Wochen bei 4 °C bei (siehe Beispiel 3). Ein Antioxidationsmittel kann ebenfalls in Kombination mit dem Chelatbildner und/oder der eine Thiolgruppe enthaltenden Verbindung verwendet werden. Auf der Basis dieser Entdeckung stellt die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit, die a) ein Thrombinpeptidderivat, das eine Länge von 14 bis 23 Aminosäureresten aufweist und die Aminosäuresequenz Asp-Ala-R, worin R eine konservierte Serinesterasedomäne ist, umfasst, und b) einen Chelatbildner und/oder eine pharmazeutisch akzeptable, eine Thiolgruppe enthaltende Verbindung umfasst, und die Verwendung der pharmazeutischen Zusammensetzung nach Anspruch 1 bei der Herstellung eines Medikaments zur Aktivierung des Rezeptors von nicht proteolytisch aktiviertem Thrombin in einem Subjekt bereit.

Die pharmazeutische Zusammensetzung umfasst ferner optional ein Antioxidationsmittel.

Vorteile der pharmazeutischen Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung umfassen eine längere Lagerungshaltbarkeit für Thrombinpeptidderivate als es früher möglich war. Daher ist es möglich, präzise und reproduzierbare Dosierungen mit Thrombinpeptidderivaten auch nach Lagerung über längere Zeiträume zu liefern. Die pharmazeutische Zusammensetzung kann bei der Behandlung und/oder Prävention von Erkrankungen und/oder Zuständen, bei denen Angiogenese und Zellproliferation vorteilhaft ist, verwendet werden. Die pharmazeutische Zusammensetzung kann zur Beschleunigung von beispielsweise Knochenwachstum, Knorpelwachstum oder -wiederherstellung und zur Heilung von Wunden, wie diabetische Ulzera, und zur Stimulation von Knochenwachstum an Stellen, an denen bei Fehlen einer Behandlung kein Knochenwachstum erfolgt, (beispielsweise Pseudoarthrose-Fraktur, Hohlräume oder Lücken in Knochen oder Knochentransplantaten) verwendet werden. Die pharmazeutische Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung kann auch zur Prävention einer Restenose bei Patienten nach einer Angioplastik und zur Regeneration von Blutgefäßen in Herzgewebe verwendet werden.

1 ist ein Diagramm, das TP508-Monomer, Dimer und andere (Addukte und dgl.) zum Zeitpunkt des Mischens (Zeit 0) mit Dimerisierungsinhibitor (Thioglycerin (T), EDTA (E), Thioglycerin und EDTA (TE) und EDTA unter N₂ (EN)) zeigt.

2 ist ein Diagramm, das die Stabilität von TP508 in Pluronic-Gelen nach 2 Wochen Lagerung bei 4 °C in Gegenwart eines Dimerisierungsinhibitors (Thioglycerin (T), EDTA (E), Thioglycerin und EDTA (TE) und EDTA unter N₂ (EN)) zeigt.

3 ist ein Diagramm, das die Stabilität von TP508 in Pluronic-Gelen nach zwei Monaten Lagerung bei 4 °C in Gegenwart eines Dimerisierungsinhibitors (Thioglycerin (T), EDTA (E), Thioglycerin und EDTA (TE) und EDTA unter N₂ (EN)) zeigt.

Die Anmelder ermittelten, dass bestimmte Thrombinpeptidderivate deren monomere Form im wesentlichen frei von Dimeren in Gegenwart eines Dimerisierungsinhibitors, wie eines Chelatbildners oder einer eine Thiolgruppe enthaltenden Verbindung, beispielsweise zu mehr als 90 Gew.-% frei über einen Zeitraum von zwei Monaten und vorzugsweise zu mehr als 95 Gew.-% frei über einen Zeitraum von zwei Monaten beibehalten (Beispiel 3). Der Chelatbildner und die eine Thiolgruppe enthaltende Verbindung können zusammen oder getrennt zur Prävention oder Verringerung einer Dimerisierung von Thrombinpeptidderivaten verwendet werden. Ein Antioxidationsmittel kann optional in Kombination mit dem Chelatbildner und/oder der eine Thiolgruppe enthaltenden Verbindung verwendet werden.

Der hier verwendete "Chelatbildner" ist eine Verbindung mit mehreren Stellen (zwei, drei, vier oder mehr), die gleichzeitig an ein Metallion oder Metallionen, beispielsweise Blei-, Cobalt-, Eisen- oder Kupferionen, binden können. Die Bindungsstellen umfassen typischerweise Sauerstoff, Stickstoff, Schwefel oder Phosphor. Beispielsweise können Salze von EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure) mindestens vier bis sechs Bindungen mit einem Metallion oder Metallionen über die Sauerstoffatome von vier Essigäureeinheiten (-CH₂C(O)O^–) und die Stickstoffatome von Ethylendiamineinheiten (>N-CH₂-CH₂-N<) von EDTA bilden. Selbstverständlich umfasst ein Chelatbildner auch ein Polymer, das mehrere Bindungsstellen für ein Metall oder Metallionen aufweist. Vorzugsweise ist ein Chelatbildner der Erfindung nichttoxisch und er verursacht keine inakzeptablen Nebenwirkungen bei den zu verabreichenden Dosierungen. Als Chelatbildner der Erfindung ist ein Kupfer-Chelatbildner bevorzugt. Ein "Kupfer-Chelatbildner" bezeichnet einen Chelatbildner, der an ein Kupferion oder Kupferionen binden kann. Beispiele für den Kupfer-Chelatbildner umfassen Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), Penicillamin, Trientin, N,N'-Diethyldithiocarbamat (DDC), 2,3,2'-Tetraamin (2,3,2'-tet), Neocuproin, N,N,N',N'-Tetrakis(2-pyridylmethyl)ethylendiamin (TPEN), 1,10-Phenanthrolin (PHE), Tetraethylenpentamin, Triethylentetramin und Tris(2-carboxyethyl)phosphin (TCEP). Weitere Chelatbildner sind Diethylentriaminpentaessigsäure (DTPA) und Bathophenanthrolindisulfonsäure (BPADA). EDTA ist ein bevorzugter Chelatbildner. Typische Mengen eines Chelatbildners, die in den pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung vorhanden sind, liegen im Bereich zwischen etwa 0,00001 und etwa 0,1 Gew.-%, vorzugsweise zwischen etwa 0,0001 und etwa 0,05 Gew.-%.

Die hierin verwendete "pharmazeutisch akzeptable, eine Thiolgruppe enthaltende Verbindung" ist eine Verbindung, die mindestens eine Thiol(-SH) gruppe umfasst und keine inakzeptablen Nebenwirkungen bei den zu verabreichenden Dosierungen verursacht. Beispiele für die pharmazeutisch akzeptable, eine Thiolgruppe enthaltende Verbindung umfassen Thioglycerin, Mercaptoethanol, Thioglykol, Thiodiglykol, Cystein, Thioglucose, Dithiothreit (DTT) und Dithio-bis-maleimidoethan (DTME). Typischerweise sind zwischen etwa 0,001 und etwa 5 Gew.-%, vorzugsweise zwischen etwa 0,05 und etwa 1,0 Gew.-% einer pharmazeutisch akzeptablen, eine Thiolgruppe enthaltenden Verbindung in den pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung vorhanden.

Das hierin verwendete "Antioxidationsmittel" ist eine Verbindung, die zur Prävention oder Verringerung einer Oxidationsreaktion, die durch ein Oxidationsmittel wie Sauerstoff verursacht wird, verwendet wird. Beispiele für das Antioxidationsmittel umfassen Tocopherol, Cystin, Methionin, Glutathion, Tocotrienol, Dimethylglycin, Betain, butyliertes Hydroxyanisol, butyliertes Hydroxytoluol, Vitamin E, Ascorbinsäure, Ascorbinpalmitat, Thioglykolsäure und Antioxidationsmittelpeptide, wie beispielsweise Turmerin. Typischerweise sind zwischen etwa 0,001 und etwa 10 Gew.-%, vorzugsweise zwischen etwa 0,01 und etwa 5 Gew.-%, noch besser zwischen etwa 0,05 und etwa 2,0 Gew.-% eines Antioxidationsmittels in den pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung vorhanden.

Selbstverständlich können bestimmte Chelatbildner oder eine Thiolgruppe enthaltende Verbindungen auch als Antioxidationsmittel fungieren, beispielsweise Tris(2-carboxyethyl)phosphin, Cystein oder Dithiothreit. Andere Arten von üblicherweise verwendeten Antioxidationsmitteln enthalten jedoch keine Thiolgruppe. Selbstverständlich können bestimmte, eine Thiolgruppe enthaltende Verbindungen auch als Chelatbildner fungieren, beispielsweise Dithiothreit. Andere Arten von üblicherweise verwendeten Chelatbildnern enthalten jedoch keine Thiolgruppe. Selbstverständlich können die pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung auch mehr als einen Chelatbildner, eine eine Thiolgruppe enthaltende Verbindung oder ein Antioxidationsmittel umfassen. Das heißt, ein Chelatbildner kann beispielsweise entweder allein oder in Kombination mit mehreren anderen geeigneten Chelatbildnern verwendet werden.

Ein "Thrombinrezeptoragonist" bezeichnet eine Verbindung, die den Rezeptor von nicht proteolytisch aktiviertem Thrombin (NPAR) stimuliert oder aktiviert (R. Horvat et al., J. Cell Sci. 108, 1155–1164, 1995). Verbindungen, die NPAR stimulieren, werden als NPAR-Agonisten bezeichnet. NPAR ist ein Thrombinrezeptor hoher Affinität, der auf der Oberfläche der meisten Zellen vorhanden ist. Diese NPAR-Komponente ist in großem Maße für die Bindung hoher Affinität von Thrombin, proteolytisch inaktiviertem Thrombin und von Thrombin abgeleiteten Peptiden an Zellen verantwortlich. NPAR scheint eine Zahl von Zellsignalen, die von Thrombin unabhängig von dessen proteolytischer Aktivität initiiert werden, zu vermitteln. Ein Beispiel für ein derartiges Signal ist die Hochregulation von Annexin V und anderen Molekülen, die durch subtraktive Hybridisierung identifiziert wurden (siehe Sower et al., Experimental Cell Research 247: 422 (1999)). NPAR ist daher durch dessen Interaktion hoher Affinität mit Thrombin an Zelloberflächen und dessen Aktivierung durch proteolytisch inaktive Derivate von Thrombin und von Thrombin abgeleiteten Peptidagonisten gemäß der folgenden Beschreibung gekennzeichnet. Eine NPAR-Aktivierung kann auf der Basis der Fähigkeit von Molekülen zur Stimulierung der Zellproliferation, wenn sie zu Fibroblasten in Gegenwart von submitogenen Konzentrationen von Thrombin oder Molekülen, die Proteinkinase C aktivieren, gegeben werden, gemäß der Offenbarung in US-Patent 5 352 664 und 5 500 412 getestet werden. NPAR-Agonisten können durch diese Aktivierung oder durch deren Fähigkeit, mit der ¹²⁵I-Thrombinbindung an Zellen zu konkurrieren, identifiziert werden. Thrombinpeptidderivate sind Beispiele für den Thrombinrezeptoragonisten. Ein Thrombinpeptidderivat ist ein Polypeptid mit weniger als etwa 50 Aminosäuren, vorzugsweise weniger als etwa 33 Aminosäuren und es weist ausreichende Homologie zu dem Fragment von humanem Thrombin, das den Prothrombin-Aminosäuren 508–530 (Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val (SEQ ID NO: 3) entspricht, auf, so dass das Thrombinpeptidderivat mindestens 25 % der Aktivität von TP508 an NPAR, vorzugsweise mindestens 50 % aufweist. Hierin beschriebene Thrombinpeptidderivate weisen zwischen etwa 14 und 23 Aminosäuren, noch besser zwischen etwa 19 und 23 Aminosäuren auf. Optional können die hierin beschriebenen Thrombinpeptidderivate C-terminale Amide und/oder einen acylierten N-Terminus aufweisen.

Ein "acylierter N-Terminus" ist ein N-Terminus, wobei der Stickstoff des N-terminalen Aminosäurerests acyliert ist. Beispielsweise weisen acylierte N-terminale Aminosäurereste die Formel R3C(O)-NH-CHR_aC(O)- auf. R_a ist eine Aminosäureseitenkette und R3 ist Wasserstoff (-H) oder eine C₁-C₆-Alkylgruppe, vorzugsweise eine Methyl(-CH₃)gruppe. Eine bevorzugte Acylgruppe ist eine Acetylgruppe. Ein "-H" am N-Terminus zeigt an, dass der N-Terminus unsubstituiert ist; und keine Bezeichnung am N-Terminus zeigt an, dass der Terminus acyliert oder unsubstituiert ist.

Ein "C-terminales Amid" ist ein Amid am C-terminalen Aminosäurerest, wobei die &agr;-Carbonsäure durch ein Amid ersetzt ist. Beispielsweise weisen amidierte C-terminale Aminosäurereste die Formel -NH-CH(R_a)C(O)-NR4R5 auf. R_a ist eine Aminosäureseitenkette und R4 und R5 stehen unabhängig voneinander für -H, eine C₁-C₆-Alkylgruppe oder zusammengenommen mit dem Stickstoffatom, an das sie gebunden sind, für eine heterocyclische Gruppe, wie Piperidinyl, Morpholinyl, Thiomorphinyl oder Pyrrolidinyl. Vorzugsweise ist das C-terminale Amid ein Carboxamid (-C(O)NH₂). Das hierin verwendete "-NH₂" am C-Terminus zeigt ein C-Terminus-Carboxamid an; "-OH" am C-Terminus zeigt an, dass das Peptid einen freien C-Terminus aufweist; und keine Bezeichnung am C-Terminus zeigt an, dass das Peptid am C-Terminus amidiert ist oder einen freien C-Terminus aufweist.

Vorzugsweise ist der N-Terminus eines Thrombinpeptidderivats frei (d.h. unsubstituiert) und der C-Terminus frei (d.h. unsubstituiert) oder amidiert, vorzugsweise ein Carboxamid (d. h. -C(O)NH₂).

Ein bevorzugtes Thrombinpeptidderivat zur Verwendung in der offenbarten Zusammensetzung besteht aus der folgenden Aminosäuresequenz: R1-Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val-R2 (SEQ ID NO: 1). R1 steht für -H oder R3-C(O)-; R2 steht für -OH oder NR4R5; R3 steht für -H oder eine C₁-C₆-Alkylgruppe (beispielsweise -CH₃); und R4 und R5 stehen unabhängig voneinander für -H, eine C₁-C₆-Alkylgruppe oder zusammengenommen mit dem Stickstoffatom, an das sie gebunden sind, eine nichtaromatische heterocyclische Gruppe, wie Piperidinyl, Morpholinyl, Thiomorphinyl oder Pyrrolidinyl (R4 und R5 sind vorzugsweise beide -H). Vorzugsweise steht R1 für -H und R2 für -NH₂; oder R1 für -H und R2 für -OH.

Alternativ kann ein N-terminal gestutztes Fragment des Thrombinpeptidderivats der SEQ ID NO: 1 mit mindestens 14 Aminosäuren oder ein C-terminal gestutztes Fragment des Thrombinpeptidderivats der SEQ ID NO: 1 mit mindestens 18 Aminosäuren in der Formulierung verwendet werden. Eine weitere Alternative ist ein N-terminal gestutztes Fragment des Thrombinpeptidderivats mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 5, R1-Asp-Asn-Met-Phe-Cys-Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Alg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val-Met-Lys-Ser-Pro-Phe-R2, wobei R1 und R2 wie oben beschrieben sind, mit mindestens 19 Aminosäuren oder es kann ein C-terminal gestutztes Fragment des Thrombinpeptidderivats der SEQ ID NO: 5 mit 23 Aminosäuren in der Formulierung verwendet werden.

Ein "C-terminal gestutztes Fragment" bezeichnet ein Fragment, das nach Entfernen einer Aminosäure oder eines Aminosäureblocks von dem C-Terminus verbleibt. Ein "N-terminal gestutztes Fragment" bezeichnet ein Fragment, das nach Entfernen einer Aminosäure oder eines Aminosäureblocks von dem N-Terminus verbleibt. Selbstverständlich umfassen die Ausdrücke "C-terminal gestutztes Fragment" und "N-terminal gestutztes Fragment" eine Acylierung am N-Terminuns und/oder Amidierung am C-Terminus gemäß der obigen Beschreibung. Selbstverständlich umfasst die Erfindung auch C-terminal gestutzte Fragmente und N-terminal gestutzte Fragmente mit den Modifikationen von Aminosäureresten, die in den ursprünglichen Thrombinpeptidderivaten vor dem Stutzen gemacht wurden, gemäß der obigen Beschreibung.

Ein weiteres hierin beschriebenes bevorzugtes Thrombinpeptidderivat besteht aus der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 2: R1-Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-X₁-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-X₂-Val-R2. X₁ steht für Glu oder Gln; X₂ steht für Phe, Met, Leu, His oder Val; und R1 und R2 sind wie oben beschrieben. Alternativ kann ein N-terminal gestutztes Fragment des Thrombinpeptidderivats der SEQ ID NO: 2 mit mindestens 14 Aminosäuren oder ein C-terminal gestutztes Fragment des Thrombinpeptidderivats der SEQ ID NO: 2 mit mindestens 18 Aminosäuren in der Formulierung verwendet werden. Eine weitere Alternative ist ein N-terminal gestutztes Fragment des Thrombinpeptidderivats mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 6: R1-Asp-Asn-Met-Phe-Cys-Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-X₁-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-X₂-Val-Met-Lys-Ser-Pro-Phe-R2, worin X₁ für Glu oder Gln steht; X₂ für Phe, Met, Leu, His oder Val steht; und R1 und R2 wie oben beschrieben sind, mit mindestens 19 Aminosäuren oder es kann ein C-terminal gestutztes Fragment des Thrombinpeptidderivats der SEQ ID NO: 6 mit 23 Aminosäuren in der Formulierung verwendet werden.

Ein weiteres bevorzugtes Thrombinpeptidderivat zur Verwendung in der offenbarten Zusammensetzung umfasst die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 3: Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val. Dieses Peptid weist vorzugsweise eine Länge von 23 Aminosäuren auf.

Ein weiteres bevorzugtes Thrombinpeptidderivat zur Verwendung in der offenbarten Zusammensetzung ist TP508. TP508 ist ein Beispiel für ein Thrombinpeptidderivat mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 4: H-Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val-NH₂. Ein weiteres Beispiel für ein Thrombinpeptidderivat weist die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 7: H-Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val-OH ("Deamid TP508") auf.

Ein Thrombinpeptidderivat der Strukturformel (I) einer Länge zwischen 14 und 23 Aminosäuren wird in der offenbarten Formulierung verwendet: Asp-Ala-R(I), worin R eine konservierte Serinesterasedomäne ist. Serinesterasen, beispielsweise Trypsin, Thrombin, Chymotrypsin und dgl., weisen eine Region auf, die hoch konserviert ist. Eine "konservierte Serinesterasedomäne" bezeichnet ein Polypeptid, das die Aminosäuresequenz von einer dieser konservierten Regionen aufweist oder zu einer dieser konservierten Regionen so ausreichend homolog ist, dass das Thrombinpeptidderivat NPAR-Aktivierungsvermögen beibehält. In einer Ausführungsform weist die konservierte Serinesterasesequenz die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 8 (Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val) oder eines C-terminal gestutzten Fragments eines Polypeptids mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 8 auf.

Weitere Beispiele für Thrombinpeptidderivate, die in der offenbarten Formulierung verwendet werden können, umfassen N-terminal gestutzte Fragmente von TP508 (oder Deamid TP508), die N-terminal gestutzten Fragmente mit mindestens 14 Aminosäuren oder C-terminal gestutzten Fragmente von TP508 (oder Deamid TP508), die C-terminal gestutzten Fragmente mit mindestens 18 Aminosäuren. Optional sind diese Peptide am C-Terminus amidiert und am N-Terminus unsubstituiert. In einer weiteren Alternative sind diese Peptide optional am C-Terminus als -C(O)-NH₂ amidiert und am N-Terminus unsubstituiert.

Eine "konservative Substitution" ist der Austausch einer Aminosäure durch eine andere Aminosäure, die die gleiche Nettoelektronenladung und etwa die gleiche Größe und Form aufweist. Aminosäuren mit aliphatischen oder substituierten aliphatischen Aminosäureseitenketten weisen etwa die gleiche Größe auf, wenn sich die Gesamtzahl der Kohlenstoff- und Heteroatome in deren Seitenketten um nicht mehr als etwa vier unterscheidet. Sie weisen etwa die gleiche Form auf, wenn sich die Zahl der Äste in deren Seitenketten um nicht mehr als eine unterscheidet. Aminosäuren mit Phenyl- oder substituierten Phenylgruppen in deren Seitenketten werden als etwa die gleiche Größe und Form aufweisend betrachtet. Im folgenden sind fünf Gruppen von Aminosäuren aufgelistet. Der Austausch einer Aminosäure in einem Polypeptid durch eine andere Aminosäure aus der gleichen Gruppe führt zu einer konservativen Substitution:

Gruppe I: Glycin, Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Serin, Threonin, Cystein und nicht natürlich vorkommende Aminosäuren mit aliphatischen C₁-C₄-Seitenketten oder hydroxylsubstituierten aliphatischen C₁-C₄-Seitenketten (geradkettig oder einfach verzweigt).

Gruppe II: Glutaminsäure, Asparaginsäure und nicht natürlich vorkommende Aminosäuren mit carboxylsäuresubstituierten aliphatischen C₁-C₄-Seitenketten (unverzweigt oder ein Verzweigungspunkt).

Gruppe III: Lysin, Ornithin, Arginin und nicht natürlich vorkommende Aminosäuren mit amin- oder guanidinosubstituierten aliphatischen C₁-C₄-Seitenketten (unverzweigt oder ein Verzweigungspunkt).

Gruppe IV: Glutamin, Asparagin und nicht natürlich vorkommende Aminosäuren mit amidsubstituierten aliphatischen C₁-C₄-Seitenketten (unverzweigt oder ein Verzweigungspunkt).

Gruppe V: Phenylalanin, Phenylglycin, Tyrosin und Tryptophan.

Eine "hoch konservative Substitution" ist der Austausch einer Aminosäure durch eine andere Aminosäure, die die gleiche funktionelle Gruppe in der Seitenkette und nahezu die gleiche Größe und Form aufweist. Aminosäuren mit aliphatischen oder substituierten aliphatischen Aminosäureseitenketten weisen nahezu die gleiche Größe auf, wenn die Gesamtzahl der Kohlenstoff- und Heteroatome in deren Seitenketten sich um nicht mehr als zwei unterscheidet. Sie weisen nahezu die gleiche Form auf, wenn sie die gleiche Zahl von Verzweigungen in ihren Seitenketten aufweisen. Beispiele für hoch konservative Substitutionen umfassen Valin für Leucin, Threonin für Serin, Asparaginsäure für Glutaminsäure und Phenylglycin für Phenylalanin. Beispiele für Substitutionen, die nicht hoch konservativ sind, umfassen Alanin für Valin, Alanin für Serin und Asparaginsäure für Serin.

In einer Ausführungsform umfasst die offenbarte pharmazeutische Zusammensetzung ein Thrombinpeptidderivat und entweder einen Chelatbildner oder eine pharmazeutisch akzeptable, eine Thiolgruppe enthaltende Verbindung. Vorzugsweise umfasst die offenbarte pharmazeutische Zusammensetzung ein Thrombinpeptidderivat, den Chelatbildner und die pharmazeutisch akzeptable, eine Thiolgruppe enthaltende Verbindung. Als Chelatbildner der Erfindung ist ein Kupfer-Chelatbildner, wie er zuvor beschrieben wurde, bevorzugt.

Alternativ umfasst die offenbarte pharmazeutische Zusammensetzung ein Thrombinpeptidderivat und einen Chelatbildner, vorzugsweise einen Kupfer-Chelatbildner und/oder eine pharmazeutisch akzeptable, eine Thiolgruppe enthaltende Verbindung und sie umfasst ferner ein Antioxidationsmittel.

In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die offenbarte pharmazeutische Zusammensetzung ein Thrombinpeptidderivat und einen Chelatbildner, vorzugsweise einen Kupfer-Chelatbildner, und ein Antioxidationsmittel. In einer noch günstigeren Ausführungsform umfasst die offenbarte pharmazeutische Zusammensetzung ein Thrombinpeptidderivat und einen Chelatbildner, vorzugsweise einen Kupfer-Chelatbildner, und Methionin. Vorzugsweise ist der Chelatbildner EDTA.

Vorzugsweise liegt die offenbarte pharmazeutische Zusammensetzung in einem pH-Bereich zwischen etwa 5 und etwa 6, noch besser zwischen etwa 5,5 und etwa 6. In einem Beispiel liegt die pharmazeutische Zusammensetzung, die ein Thrombinpeptidderivat und einen Chelatbildner, vorzugsweise einen Kupfer-Chelatbildner, und ein Antioxidationsmittel umfasst, in einem pH-Bereich zwischen etwa 5 und etwa 6, noch besser zwischen etwa 5,5 und etwa 6. In dieser Zusammensetzung ist das Antioxidationsmittel vorzugsweise Methionin.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist die Verwendung der pharmazeutischen Zusammensetzung bei der Herstellung eines Medikaments zur Aktivierung des Rezeptors von nicht proteolytisch aktiviertem Thrombin in einem Subjekt.

Ein "Subjekt" ist vorzugsweise ein Mensch, doch kann es auch ein tierisches Lebewesen, das eine Behandlung mit einem Thrombinrezeptoragonisten benötigt, sein, beispielsweise Begleitertiere (beispielsweise Hunde, Katzen und dgl.), Hoftiere (beispielsweise Kühe, Schweine, Pferde und dgl.) und Labortiere (beispielsweise Ratten, Mäuse, Meerschweinchen und dgl.).

Subjekte "mit der Notwendigkeit einer Behandlung" mit einem Thrombinrezeptoragonisten sind Subjekte mit Erkrankungen und/oder Zuständen, die mit Thrombinrezeptoragonisten und Thrombinpeptidderivaten unter Erreichen eines vorteilhaften therapeutischen und/oder prophylaktischen Ergebnisses behandelt werden können. Vorteilhafte Ergebnisse umfassen eine Verringerung der Schwere von Symptomen oder eine Verzögerung des Einsetzens von Symptomen, erhöhte Lebenserwartung und/oder schnellere oder vollständigere Aufhebung der Erkrankung oder des Zustands. Beispielsweise erfordert ein Subjekt mit der Notwendigkeit einer Behandlung Zellproliferation, die Chondrocyten umfasst, Angiogenese, Knochenwachstum, Herzwiederherstellung, Wundheilung, Knorpelwachstum oder -wiederherstellung oder Restenosehemmung.

Es wurde gezeigt, dass Thrombinpeptidderivate die Proliferation von Endothelzellen, Fibroblasten und Keratinocyten stimulieren (siehe beispielsweise US-Patent 5 500 412 und 5 352 664). Thrombinpeptidderivate können daher zur Förderung der Heilung bei akuten Wunden, beispielsweise Verbrennungen, Hautwunden, Operationswunden und Knochenbrüche, verwendet werden. Ferner wurde vor kurzem gezeigt, dass Thrombinpeptidderivate besonders wirksam im Hinblick auf eine Förderung der Heilung von chronischen Wunden, wie diabetische Ulzera, venöse Ulzera und Dekubitus, sind (siehe beispielsweise WO 03/013569). Daher können Thrombinpeptidderivate zur Stimulierung von Knorpelwachstum oder -wiederherstellung oder Chondrocytenwachstum und -wiederherstellung bei beispielsweise Patienten mit Osteoarthritis oder Gelenkläsionen verwendet werden. Andere Verwendungsmöglichkeiten für Thrombinpeptidderivate umfassen die Stimulierung von Knochenwachstum zur Förderung der Heilung von einfachen Frakturen, Pseudoarthrose-Frakturen, Hohlräumen und Lücken in Knochen und Knochentransplantaten, zur Prävention einer Restenose bei Patienten nach einer Angioplastik und zur Förderung der Regeneration von Blutgefäßen bei Herzgewebe (siehe beispielsweise WO 02/005836, WO 02/004008 und die US-Patentanmeldungsveröffentlichung 2002/0 128 202).

Induziertes Knochenwachstum kann auch an bestimmten Stellen in einem Subjekt (die als "ektopische" Stellen bezeichnet werden), an denen normalerweise kein Knochengewebe gefunden wird, beispielsweise eine Stelle, die ein Knochentransplantat oder eine Knochenfusion benötigt, therapeutisch vorteilhaft sein. Fusionen werden üblicherweise zur Behandlung von Kreuzschmerzen durch physikalische Kopplung von einem oder mehreren Wirbeln an deren Nachbar verwendet. Der durch eine derartige Fusion geschaffene Knochen befindet sich an einer Stelle, die normalerweise nicht von Knochengewebe besetzt wird. Induziertes Knochenwachstum an diesen ektopischen Stellen kann als "Transplantatersatz" fungieren, wobei induziertes Knochenwachstum zwischen den Wirbeln die Stelle eines Transplantats einnimmt und die Notwendigkeit einer zweiten Operation zur Gewinnung von Knochen für das Transplantationsverfahren umgeht. Die Induktion von Knochenwachstum wird auch zur Behandlung von erworbenen und ererbten kraniofazialen und anderen Skelett- oder Zahnanomalien (siehe beispielsweise Glowacki et al., Lancet 1: 959 (1981)); zur Durchführung von Zahn- und Periodontiumrekonstruktionen, wenn ein Ersatz von verlorengegangenem Knochen oder eine Knochenverstärkung erforderlich ist, beispielsweise in einem Kieferknochen; und zur Ergänzung von Alveolarknochenschwund infolge einer Periodontiumerkrankung zur Verzögerung oder Verhinderung von Zahnverlust benötigt (siehe beispielsweise Sigurdsson et al., J. Periodontol., 66: 511 (1995)).

Die pharmazeutische Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung, die ein Thrombinpeptidderivat umfasst, kann daher bei Behandlungen, wie sie oben beschrieben wurden, verwendet werden.

Eine "wirksame Menge" ist die Menge eines Thrombinpeptidderivats in der pharmazeutischen Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung, die zu einem verbesserten klinischen Ergebnis des mit dem Thrombinpeptidderivat zu behandelnden Zustands im Vergleich zum Fehlen einer Behandlung führt. Die verabreichte Menge von Thrombinpeptidderivaten hängt von dem Grad, der Schwere und der Art der Erkrankung oder des Zustands, der Menge der gewünschten Therapie und den Freisetzungseigenschaften der pharmazeutischen Formulierung ab. Sie hängt auch von der Gesundheit, Größe, dem Gewicht, Alter, Geschlecht und der Arzneistofftoleranz des Subjekts ab. Typischerweise wird das Thrombinpeptidderivat über einen ausreichenden Zeitraum, um die gewünschte therapeutische Wirkung zu erreichen, verabreicht. Für die Indikation der Herzwiederherstellung werden typischerweise zwischen etwa 0,1 &mgr;M bis 10 &mgr;M oder noch besser zwischen etwa 50 und 250 &mgr;g pro Einzelinjektion des Thrombinpeptidderivats an einem geschädigten Gewebe für eine ausreichende Zunahme der Wiederherstellungsrate verabreicht. Für die Indikation von Knorpelwachstum oder -wiederherstellung wird typischerweise zwischen etwa 0,1 &mgr;g pro Einzelapplikation und etwa 1 mg pro Einzelapplikation des Thrombinpeptidderivats, vorzugsweise zwischen etwa 25 &mgr;g und etwa 100 &mgr;g pro 20 mm³ verabreicht. Zur Behandlung von chronischem Hautulkus werden typischerweise zwischen etwa 0,1 &mgr;g und etwa 1 mg pro Einzelapplikation, vorzugsweise zwischen etwa 1 &mgr;g und etwa 100 &mgr;g pro Einzelapplikation des Thrombinpeptidderivats verabreicht. Insbesondere werden eine bis sieben Applikationen pro Woche des Thrombinpeptidderivats zur Behandlung von chronischem Hautulkus verabreicht. Für die Indikation Knochenwachstum werden typischerweise zwischen etwa 1 &mgr;g und etwa 1 mg pro Tag, vorzugsweise zwischen etwa 5 &mgr;g und etwa 100 &mgr;g pro Tag des Thrombinpeptidderivats verabreicht.

In einer weiteren Ausführungsform umfasst die offenbarte pharmazeutische Zusammensetzung ferner einen pharmazeutisch akzeptablen Träger als Teil der pharmazeutischen Zusammensetzung. Geeignete pharmazeutische Träger können inerte Bestandteile enthalten, die die biologische Aktivität eines Thrombinpeptidderivats und die Funktion eines Chelatbildners, einer eine Thiolgruppe enthaltenden Verbindung und eines Antioxidationsmittels nicht hemmen. Die Träger sollten biologisch kompatibel, d.h. nichttoxisch, nicht-entzündlich, nicht-immunogen und frei von anderen unerwünschten Reaktionen an der Verabreichungsstelle sein. Pharmazeutisch akzeptable Träger variieren entsprechend dem gewählten Verabreichungsweg und der zu behandelnden Indikation. Beispiele für pharmazeutisch akzeptable Träger umfassen beispielsweise Kochsalzlösung, Aerosole, im Handel erhältliche inerte Gele oder Flüssigkeiten, die mit Albumin ergänzt sind, Methylcellulose oder eine Kollagenmatrix. Pharmazeutische Standardformulierungstechniken können verwendet werden, beispielsweise gemäß der Beschreibung in Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA.

Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können Lösungen, Suspensionen, Emulsionen, Sirupe, Gele, Salben, Lotionen, Cremes, Pasten, kittartig, Extrusionen, Mikroteilchen, Kapseln, Tabletten oder dgl. sein.

Eine Gelformulierung wird üblicherweise verwendet, wenn das Thrombinpeptidderivat zur Förderung von Herzwiederherstellung und Wundheilung verwendet wird. Gels bestehen aus einer Basis, die aus einer ölartigen Basis, Wasser oder einer Emulsionssuspensionsbasis ausgewählt ist. Die ölartige Basis enthält nichtflüssige Öle oder Kohlenwasserstoffe, wie weiße Vaseline oder Mineralöl, oder eine absorbierende Basis, die beispielsweise aus einer absorbierenden wasserfreien Substanz oder Substanzen, beispielsweise wasserfreiem Lanolin, besteht. Die Emulsionssuspensionsbasis umfasst eine Ölphase (innere Phase), die typischerweise nichtflüssige Öle, Kohlenwasserstoffe und dgl., wie Wachse, Vaseline, Mineralöl und dgl., enthält, und eine wässrige Phase (kontinuierliche Phase), die Wasser und etwaige wasserlösliche Substanzen, wie zugesetzte Salze, umfasst. Die zwei Phasen werden durch Verwendung eines Emulgators, beispielsweise eines oberflächenaktiven Mittels, wie Natriumlaurylsulfat, hydrophile Kolloide, wie Akaziengummi, kolloide Tonarten, Bienenwachs und dgl., stabilisiert. Zu der Basis wird ein Geliermittel gegeben, das in der Basis eine Matrix bildet, wobei deren Viskosität zu einer halbfesten Konsistenz erhöht wird. Beispiele für geeignete Geliermittel umfassen Hydroxypropylcellulose, Acrylsäurepolymere, Polymere von Poly(ethylenoxid) oder Copolymere von Ethylen- und Propylenoxid (siehe Cao et al., J. Biomater. Sci 9: 475 (1998), und Sims et al., Plast Reconstr. Surg. 98: 843 (1996)). Pluronic-Gele sind nichttoxische Blockcopolymere von Ethylenoxid und Propylenoxid. Sie zeigen Warmhärtbarkeitseigenschaften, die es ihnen ermöglichen, bei Raumtemperatur als viskose Flüssigkeiten, jedoch bei Körpertemperaturen als Gele zu existieren. Die Wirkstoffe werden zu der Formulierung mit der gewünschten Konzentration an einem Punkt vor der Zugabe des Geliermittels gegeben oder sie können nach dem Gelierungsprozess eingemischt werden. Gele zur Behandlung zur Förderung der Wundheilung können in einer lokalen topischen Verabreichung verabreicht werden. Die Zubereitung von Gelen ist in Beispiel 7 beschrieben.

Andere Formulierungen zur lokalen topischen Verabreichung als Gele umfassen Salben und Cremes. Salben werden typischerweise unter Verwendung der zuvor beschriebenen ölartigen Basis hergestellt. Cremes umfassen allgemein die zuvor beschriebene Emulsionssuspensionsbasis. Nach der Bildung der Basis werden die Wirkstoffe in der gewünschten Konzentration zugegeben.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sind die offenbarten pharmazeutischen Zusammensetzungen lyophilisierte Pellets, die vor der Verwendung rekonstituiert werden können. Die lyophilisierten Pellets werden üblicherweise für Indikationen wie Knochenwachstum und Herzwiederherstellung verwendet. Die lyophilisierten Zusammensetzungen umfassen optional ein Massemittel zusätzlich zu den anderen zuvor beschriebenen Wirkstoffen. Geeignete Massemittel umfassen Mannit, Lactose, Cellulose, Sorbit, Dextrose, Dextran, Polydextrose, Maltit, Xylit, Isomalt, Erythrit, Glycerin und dgl. Die lyophilisierten Zusammensetzungen können zur Bildung von Lösungen rekonstituiert werden und sie können Hilfssubstanzen, wie Befeuchtungsmittel oder Emulgatoren, pH-Puffermittel, viskositätsverstärkende Additive, Konservierungsmittel und dgl. in Abhängigkeit vom Verabreichungsweg und der gewünschten Zubereitung enthalten.

Die pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung sind typischerweise Formulierungen mit Langzeitfreisetzung für Indikationen wie Knochenwachstum, Knorpelwachstum oder -wiederherstellung und Herzwiederherstellung. Die Formulierungen mit Langzeitfreisetzung können eine kontinuierliche Freisetzung der Medikation über einen Zeitraum von Stunden liefern. Polymere werden häufig zur Bildung der Formulierungen mit Langzeitfreisetzung verwendet. Beispiele für die Polymere umfassen Poly-&agr;-hydroxyester, wie Polymilchsäure/Polyglykolsäure (PLGA)-Homopolymere und -Copolymere, Polyphosphazene (PPHOS), Polyanhydride und Poly(propylenfumarate) (PPF).

Polymilchsäure/Polyglykolsäure(PLGA)-Homo- und -Copolymere sind als Vehikel mit Langzeitfreisetzung einschlägig bekannt. Die Freisetzungsrate kann durch den erfahrenen Fachmann durch Variation des Verhältnisses von Polymilchsäure zu Polyglykolsäure und des Molekulargewichts des Polymers eingestellt werden (siehe Anderson et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 28: 5 (1997)). Die Einarbeitung von Poly(ethylenglykol) in das Polymer als Gemisch unter Bildung von Mikroteilchenträgern ermöglicht eine weitere Änderung des Freisetzungsprofils des Wirkstoffs (siehe Cleek et al., J. Control Release 48: 259 (1997)). Keramiken wie Calciumphosphat und Hydroxyapatit können ebenfalls in die Formulierung zur Verbesserung der mechanischen Eigenschaften eingearbeitet werden. PLGA-Mikroteilchen können auch mit Pluronic-Gelen oder Kollagen gemischt werden, um eine Aggregation zu verhindern und die Mikroteilchen zur direkten Injektion geeignet zu machen. Die Herstellung von PLGA-Mikrokügelchen von TP508 ist detailliert in WO 03/061690 beschrieben.

PPHOS-Polymere enthalten abwechselnd Stickstoff und Phosphor ohne Kohlenstoff im Polymergerüst, wie im folgenden in der Strukturformel (I) angegeben:

Die Eigenschaften des Polymers können durch geeignete Variation der Seitengruppen R und R', die an das Polymergerüst gebunden sind, eingestellt werden. Beispielsweise kann der Abbau von und die Arzneistofffreisetzung durch PPHOS durch Variieren der Menge von hydrolytisch instabilen Seitengruppen gesteuert werden. Bei stärkerem Einbau von entweder imidazolyl- oder ethylgkykolsubstituiertem PPHOS wird beispielsweise eine Zunahme der Abbaurate beobachtet (siehe Laurencin et al., J Biomed Mater. Res. 27: 963 (1993)), wodurch die Rate der Arzneistofffreisetzung erhöht wird.

Polyanydride, die in der Strukturformel (II) angegeben sind, weisen klar definierte Abbau- und Freisetzungseigenschaften auf, die durch Einarbeiten variierender Mengen von hydrophoben oder hydrophilen Monomeren, wie Sebacinsäure und 1,3-Bis(p-carboxyphenoxy)propan, gesteuert werden können (siehe Leong et al., J. Biomed. Mater. Res. 19: 941 (1985)). Zur Verbesserung der mechanischen Festigkeit werden Anhydride häufig mit Imiden unter Bildung von Polyanhydrid-co-imiden copolymerisiert. Beispiele für Polyanhydrid-co-imide, die für orthopädische Anwendungen geeignet sind, sind Poly(trimethylimido-glycin-co-1,6-bis(carboxyphenoxy)hexan- und Pyromellityimidoalanin:1,6-Bis(p-carboxyphenoxy)hexan-Copolymere.

Die pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können auf jedem geeigneten Weg, lokal oder systemisch verabreicht werden. Typischerweise hängt der Verabreichungsweg von der Art der verwendeten Formulierung und der behandelten Indikation ab. Topische Verabreichung wird üblicherweise zur Behandlung von Wunden verwendet. Zur topischen Verabreichung sind die pharmazeutischen Zusammensetzungen typischerweise Cremes, Gele, Salben oder Aerosole, die zuvor detailliert beschrieben wurden. Für bestimmte Indikationen, wie Stimulation von Knochenwachstum, Knorpelwiederherstellung oder -wachstum und Herzwiederherstellung, ist es vorteilhaft, die pharmazeutische Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung direkt an der Behandlungsstelle zu injizieren oder zu implantieren.

Für die Indikationen mit der Notwendigkeit von Herzwiederherstellung, Knorpelwachstum oder -wiederherstellung und Knochenwachstum sind die pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung typischerweise injizierbare Formen. Beispielsweise können die offenbarten injizierbaren Zusammensetzungen direkt an der Stelle mit der Notwendigkeit von Knochenwachstum injiziert werden und in günstiger Weise zum Auffüllen von Hohlräumen und Verbinden von Knochen ohne die Notwendigkeit eines invasiven Eingriffs verwendet werden. "Injizierbar" bedeutet, dass das Material durch eine Spritze über eine Standardnadel, die zur Injektion von Lösungen, Pasten oder Gelen verwendet wird, injiziert werden kann. Die injizierbaren Zusammensetzungen können intravenös oder direkt an der Stelle mit der Notwendigkeit einer Behandlung verabreicht werden. Die injizierbaren Zusammensetzungen können ferner physiologische Kochsalzlösung, bakteriostatische Kochsalzlösung (Kochsalzlösung, die etwa 0,9 (mg/ml) Benzylalkohol enthält), phosphatgepufferte Kochsalzlösung, Hank-Lösung, Ringer-Lactat oder Flüssigkeiten, die mit Albumin, Methylcellulose oder Hyaluronsäure ergänzt sind, umfassen. Die injizierbaren Zusammensetzungen können auch Polymere von Poly(ethylenoxid) oder Copolymere von Ethylen und Propylenoxid umfassen. Pluronic-Gele sind Beispiele für derartige Polymere und sie zeigen Wärmehärtbarkeit, die es ermöglicht, dass sie bei Raumtemperatur als viskose Flüssigkeiten, jedoch bei Körpertemperatur als Gele existieren, wie früher diskutiert wurde. Andere Zusammensetzungen für die zur Abgabe injizierbaren Zusammensetzungen umfassen die Lösungen von Poly(propylenfumarat)(PPF)-Copolymeren und Pasten von Calciumphosphatkeramiken (siehe Schmitz et al., J. Oral Maxillofacial Surgery 57: 1122 (1999)).

Implantierbare pharmazeutische Zusammensetzungen sind insbesondere für Indikationen wie Stimulation von Knochenwachstum, Knorpelwachstum oder -wiederherstellung und Herzwiederherstellung vorteilhaft. "Implantation" oder "Verabreichung an einer Stelle" bedeutet eine so ausreichende Nähe zu der eine Behandlung benötigenden Stelle, dass die gewünschte Heilung (beispielsweise eine klinische Verbesserung des zu behandelnden Zustands in Gegenwart des Arzneistoffs im Vergleich zu dessen Nichtvorhandensein) an der Stelle erfolgt, wenn das Thrombinpeptidderivat aus der pharmazeutischen Zusammensetzung freigesetzt wird. Selbstverständlich kann eine implantierbare pharmazeutische Zusammensetzung auch eine Formulierung mit langzeitiger Freisetzung oder eine injizierbare Formulierung, die zuvor beschrieben wurden, sein. Beispielsweise können implantierbare pharmazeutische Zusammensetzungen auch einen Träger mit Langzeitfreisetzung umfassen, um langsame und kontinuierliche Medikationen an der Implantationsstelle zu erreichen.

Die implantierbaren pharmazeutischen Zusammensetzungen können nach Wunsch im Vorfeld der Operation geformt werden oder durch den Arzt oder einen Techniker während einer Operation geformt werden. Vorzugsweise wird die Matrix derart geformt, dass ein Gewebedefekt überspannt wird, und vorzugsweise erhält sie die gewünschte Form des neuen Gewebes. Im Falle einer Knochenwiederherstellung eines Pseudoarthrosedefekts ist es beispielsweise günstig, Abmessungen zu verwenden, die die Pseudoarthrose überspannen. Bei Knochenbildungsverfahren wird das Material durch den Körper langsam absorbiert und durch Knochen in der Form des Implantats oder sehr nahe der Form des Implantats ersetzt.

Alternativ kann die implantierbare pharmazeutische Zusammensetzung partiell in einer stützenden physikalischen Struktur, wie einem Netz, einem Drahtmatrix, einem Edelstahlgehäuse, einem hohlen Körperfusionsgehäuse (threaded interbody fusion cage) und dgl., vor der Verabreichung an der Stelle, die beispielsweise Knochenwachstum benötigt, eingeschlossen werden.

In einer noch weiteren Alternative umfassen die offenbarten pharmazeutischen Zusammensetzungen insbesondere zur Stimulation von Knochenwachstum und Knorpelwiederherstellung oder -wachstum vorzugsweise Träger, die poröse Matrizes umfassen, die dann als Gerüst für Knochen- und Gewebewachstum dienen können, auf das Knochenvorläuferzellen und osteogene Zellen wandern können und daran haften können. Derartige Träger werden als osteokonduktiv bezeichnet. Für bestimmte Anwendungen sollte der Träger ausreichende mechanische Festigkeit aufweisen, um dessen dreidimensionale Struktur beizubehalten und die Immobilisierung der Knochen- oder Gewebesegmente, die vereinigt oder zusammengepfroft werden sollen, zu unterstützen. Beispiele für geeignete osteokonduktive Träger umfassen Kollagen (beispielsweise Rinderkollagen), Fibrin, Calciumphosphatkeramik (beispielsweise Hydroxyapatit und Tricalciumphosphat), Calciumsulfat, guanidinextrahierten allogenen Knochen und Kombinationen derselben. Eine Zahl geeigneter Träger ist im Handel erhältlich, beispielsweise COLLAGRAFT^® (Cohension Technologies, Inc., Palo Alto, CA), das ein Gemisch aus Hydroxyapatit, Tricalciumphosphat und fibrillärem Kollagen ist, und PRO OSTEON 500^TM (Interpore Cross International, Irwine, CA), das eine Hydroxyapatitbiomatrix ist, die durch die Umwandlung von marinem Korallencalciumcarbonat in kristallines Hydroxyapatit gebildet wurde. Beschreibungen synthetischer biologisch abbaubarer Polymere, die als osteokonduktive Träger mit Langzeitfreisetzungseigenschaften dienen können, finden sich in Behravesh et al., Clinical Orthopaedics 367: 5118 (1999), und Lichun et al., Polymeric Delivery Vehicles for Bone Growth Factors in "Controlled Drug Delivery – Designing Technologies for the Future", Hrsg. Park und Mrsny, American Chemical Society, Washington, DC (2000). Beispiele für die biologisch abbaubaren Polymere umfassen Poly-&agr;-hydroxyester, wie Polymilchsäure/Polyglykolsäure-Homopolymere und -Copolymere, Polyphosphazene (PPHOS), Polyanhydride und Poly(propylenfumarate), die oben detailliert beschrieben sind.

Alternativ können die pharmazeutischen Zusammensetzungen an der Stelle in der Form von Mikroteilchen oder Mikrokügelchen implantiert werden. Beispielsweise werden die Mikroteilchen in Kontakt mit der oder in enger Nähe zu der Stelle mit der Notwendigkeit von Herzherstellung, Knochenwachstum oder Knorpelwiederherstellung entweder durch chirurgisches Freilegen der Stelle und Applikation der Mikroteilchen an der oder in enger Nähe der Stelle durch Aufstreichen, Pipettieren, Aufsprühen, Injizieren oder dgl. gebracht. Mikroteilchen können auch durch Endoskopie oder durch Laparoskopie zugeführt werden. Poly(propylenfumarate) (PPF) sind sehr günstige biologisch kompatible implantierbare Träger zur Verwendung bei der Wiederherstellung von Knochendefekten, da sie ein injizierbares, in situ polymerisierbares, biologisch abbaubares Material sind. PPF bildet in Kombination mit einem Vinylmonomer (N-Vinylpyrrolidinon) und einem Initiator (Benzoylperoxid) eine injizierbare Lösung, die in situ polymerisiert werden kann. Es ist besonders geeignet zur Auffüllung von Skelettdefekten einer breiten Vielzahl von Größen und Formen (siehe Suggs et al., Macromolecules 30: 4318 (1997), Peter et al., J. Biomater. Sci. Poly, Ed. 10: 363 (1999) und Yaszemski et al., Tissue Eng. 1: 41 (1995)). Die Zugabe von Festphasenkomponenten, wie &bgr;-Tricalciumphosphat und Natriumchlorid, kann die mechanischen Eigenschaften von PPF-Polymeren verbessern (siehe Peter et al., J. Biomed. Mater. Res. 44: 314 (1999)). Verfahren zur Verkapselung von Zusammensetzungen (beispielsweise in einem Überzug aus Hartgelatine oder Cyclodextran) sind einschlägig bekannt (Baker et al., "Controlled Release of Biological Active Agents", John Wiley and Sons, 1986).

Erkrankungen und Zustände, die mit der offenbarten pharmazeutischen Zusammensetzung, die ein Thrombinpeptidderivat umfasst, behandelbar sind, beispielsweise Wunden und Angioplastik, werden häufig von Symptomen und Beschwerden wie Schmerz und Infektion begleitet. In bestimmten Fällen kann es vorteilhaft sein, ein oder mehrere zusätzliche pharmakologisch aktive Mittel zusammen mit der pharmazeutischen Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung gemeinsam zu verabreichen, um derartige Probleme zu behandeln. Beispielsweise kann die Behandlung von Schmerz und Entzündung eine Co-Verabreichung mit einem Analgetikum oder entzündungshemmenden Mittel erfordern. Die Behandlung einer Infektion kann eine Co-Verabreichung mit antimikrobiellen Mitteln, Antibiotika oder Desinfektionsmitteln erfordern.

Thrombinpeptidderivate können durch Festphasenpeptidsynthese(beispielsweise BOC oder FMOC) verfahren, durch Lösungsphasensynthese oder durch andere geeignete Techniken, die Kombinationen der vorhergehenden Verfahren umfassen, synthetisiert werden. Die BOC- und FMOC-Verfahren, die bekannt sind und in weitem Umfang verwendet werden, sind in Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 88: 2149 (1963); Meienhofer, Hormonal Proteins and Peptides, C. H. Li, Hrsg., Academic Press, 1983, S. 48–267; und Barany und Merrifield in The Peptides, E. Gross und J. Meienhofer, Hrsg., Academic Press, New York, 1980, S. 3–285, beschrieben. Verfahren der Festphasenpeptidsynthese sind in R. B. Merrifield, Science, 232: 341 (1986); L. A. Carpino und G. Y. Han, J. Org.

Chem., 37: 3404 (1972); und H. Gauspohl et al., Synthesis, 5: 315 (1992), beschrieben.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele erläutert, die in keinster Weise beschränkend sein sollen.

TP508 wurde in 150 mM steriler Kochsalzlösung unter Bildung einer Endkonzentration von 5 mg/ml gelöst. Proben (100 &mgr;l) wurden in ein steriles 2-ml-Cryoröhrchen überführt und vor Licht geschützt bei 4 °C aufbewahrt. Die Proben wurden an festgelegten Zeitpunkten auf 1 mg/ml verdünnt und durch Umkehrphasen-HPLC unter Verwendung einer C18-Säule (Alltech Adsorbus 4 XL-Säule C18 90 A 5 &mgr;m 250 × 4,6 mm) analysiert. Ein Gradientenverfahren wurde durchgeführt, wobei die mobile Phase B von 1–15 min von 20 % auf 50 % erhöht wird (mobile Phase A – 0,1 % TFA in Wasser; mobile Phase B – 0,1 TFA in Acetonitril) und das Injektionsvolumen 10 &mgr;l beträgt. TP508, TP508-Dimer und nicht identifizierte Peaks wurden identifiziert und aufgrund der Fläche des Chromatogramms quantitativ bestimmt.

TP508 wurde mit 1 mg/ml in gepufferten oder ungepufferten Lösungen, mit oder ohne EDTA gelöst. Die Lösungen wurden bei Raumtemperatur inkubiert und Proben wurden in Abständen zur Analyse durch HPLC genommen. Der Prozentsatz der Bildung des Dimers wurde aus den erhaltenen Chromatogrammen berechnet. Die folgenden Lösungen wurden zum Lösen von TP508 verwendet (1 mg/ml):

PPS, pH 7,4 (30 min mit N₂ durchperlt)

10 mM Hepes, 150 mM NaCl, pH 7,0

10 mM Hepes, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, pH 7,0

1 ml jeder Lösung wurde in ein 1,5-ml-Polypropylenmikrozentrifugenröhrchen gegeben und bei Raumtemperatur stehengelassen. In festgelegten Abständen wurden 100 &mgr;l zur Analyse durch das in Beispiel 1 angegebene HPLC-Verfahren entfernt. Der Prozentsatz der über die Zeit gebildeten Dimere ist in Tabelle 2 zusammengefasst.

In phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PPS) oder Hepes-NaCl war die Rate der Dimerbildung sehr schnell. Wie angegeben verringerte die Zugabe von 5 mM EDTA die Rate der Dimerbildung stark. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Dimerbildung durch das Vorhandensein von Spurenmengen zweiwertiger Ionen gefördert werden kann, da die Bildung von Dimeren durch EDTA verhindert oder verringert wird.

Proben, die wie in Tabelle 3 beschrieben hergestellt wurden, enthielten typischerweise 50 &mgr;g/ml TP508 in Pluronic-Gelen gelöst. Die Proben wurden dann über die Zeit bei 4 °C aufbewahrt. Zur Analyse wurden die Proben 10-fach mit 0,1 TFA verdünnt und durch HPLC analysiert. Typischerweise wurden 50 &mgr;l der verdünnten Probe analysiert. Die quantitative Bestimmung von TP508 erfolgte durch einen externen Standard. Ein zweifacher TP508-Standard wurde vor der Probenanalyse analysiert. Eine Probe von jeder Gruppe von Tabelle 3 wurde analysiert.

• T – Thioglycerin
• E – EDTA
• TE – Thioglycerin/EDTA
• EN – EDTA mit N₂

Wie in 1 gezeigt ist, wurde eine sehr niedrige Dimerkonzentration zum Zeitpunkt 0 für alle Proben, die gemäß der Beschreibung in Tabelle 3 hergestellt wurden, beobachtet. Unbekannte Peaks, die etwa 20 % und 6 % der Gesamtprobe umfassten, wurden in den Proben, die Thioglycerin (Gruppe T) bzw. Thioglycerin/EDTA (Gruppe TE) enthielten, beobachtet. Diese unbekannten Peaks wiesen eine Retentionszeit, die etwas größer als die von TP508 war, auf, was nahelegt, das sie einem Addukt von TP508 und Thioglycerin entsprechen könnten, da die Menge der Adduktbildung etwa proportional dem Thioglyceringehalt in den zwei Proben ist.

Proben, die zwei Wochen bei 4 °C aufbewahrt wurden, zeigten im wesentlichen die gleiche Dimerkonzentration wie die zum Zeitpunkt 0, wie in 2 angegeben ist. In der Probe, die EDTA (Gruppe E) oder EDTA w/N₂ (Gruppe EN) enthielt, behielten über 90 % des TP508 immer noch ihre monomere Form bei.

Wie in 3 gezeigt ist, zeigten alle Proben, die einen Dimerisierungsinhibitor enthielten (Gruppe T, E, TE und EN) erhöhte Stabilität von TP508 im Vergleich zu den Proben ohne einen Dimerisierungsinhibitor. Die Probe, die sowohl Thioglycerin als auch EDTA enthielt, (Gruppe TE) zeigte im wesentlichen die gleiche Dimermenge wie zum Zeitpunkt 0, was anzeigt, dass TP508 dessen monomere Form im wesentlichen frei von Dimeren auch nach zweimonatiger Aufbewahrung in Gegenwart von sowohl Thioglycerin als auch EDTA mit nur 10 % eines TP508-Thioglycerin-Addukts beibehielt. Etwa 80 von TP508 verblieben als Monomer in der Probe, die EDTA (Gruppe E) oder EDTA w/N₂ (Gruppe EN) enthielt. Das Vorhandensein einer Stickstoffdecke während der Herstellung von Gelen scheint die Dimerisierung nicht zu beeinflussen. Die Probe, die Thioglycerin enthielt, (Gruppe T) zeigte dass etwa 60 % des TP508 dessen monomere Form beibehielten und die übrigen etwa 40 % des TP508 ein TP508-Thioglycerin-Addukt bildeten. Diese Ergebnisse zeigen, dass EDTA und eine Thiolgruppen enthaltende Verbindung zur Stabilisierung von TP508 gegenüber einer Dimerisierung verwendet werden können.

Die im folgenden angegebenen Antioxidationsmittel wurden auf deren Fähigkeit zur Hemmung der Dimerisierung von TP508 in Kombination mit EDTA getestet. Der normale Prozentsatz, der in einer Formulierung verwendet wird, ist in der folgenden Tabelle 4 angegeben:

Eine Gelbasis (17 % Pluronic, 0,0004 % EDTA und Citratpuffer, pH 5,0, mit Konservierungsmitteln) wurde hergestellt und verwendet. Jede Antioxidationsmittelart (entweder niedriger oder hoher Prozentsatz) wurde in der gewünschten Konzentration zugegeben. Dann wurde TP508 zu dem Gel zur Bildung einer Konzentration von 50 &mgr;g/ml gegeben. Die Proben wurden bei 4 °C drei Wochen inkubiert. Dann wurden 100 &mgr;l einer Probe mit 900 &mgr;l 0,1 % TFA verdünnt und durch HPLC nach dem Verfahren gemäß der Beschreibung in Beispiel 1 analysiert. Ein zweifacher Standard wurde vor der Probenanalyse analysiert. Auch wurde ein Leerwertgel mit Konservierungsmitteln und Antioxidationsmittel analysiert.

Die Ergebnisse sind im folgenden in der Tabelle 5 angegeben. Kurz gesagt, war TP508 bei hoher Konzentration von Antioxidationsmitteln bei 4 °C drei Wochen sehr stabil. Mit Ausnahme von Ascorbinsäure waren niedrige Konzentrationen von Antioxidationsmitteln ebenfalls wirksam.

Zubereitungen von gepufferten Proben mit 10 &mgr;m EDTA bei verschiedenem pH-Wert und pH 5,5 mit Zugabe von Antioxidationsmitteln wurden auf deren Fähigkeit zur Hemmung der TP508-Dimerisierung und Bildung anderer Molekülformen getestet. Die Proben, die bei verschiedenem pH-Wert und verschiedenen Prozentmengen des Antioxidationsmittels getestet wurden, sind in Tabelle 6 angegeben.

TP508 wurde in Citratpuffer 50 mM von pH 4,5 bis 6,0 mit 10 &mgr;m EDTA hergestellt. Die Proben wurden filtrationssterilisiert und bei Raumtemperatur abseits jeder Lichtquelle inkubiert. An angegebenen Zeitpunkten wurden die einzelnen Proben durch HPLC analysiert, um die TP508-Monomerkonzentration (Tabelle 7), den Dimerprozentsatz (Tabelle 8), den Adduktprozentsatz (Tabelle 9) und unbekannte Molekülspezies (Tabelle 10) zu bestimmen.

• *Niedrigste Werte

Die Ergebnisse zeigen, dass alle in dieser Untersuchung getesteten Antioxidationsmittel die Dimerisierung von TP508, die in Tabelle 8 angegeben ist, in Bezug auf die in Citratpuffern im Bereich von 4,5 bis 6,0 erhaltene, verhindern oder verringern. Die Ergebnisse in Tabelle 9 zeigen, dass Methionin aufgrund des Fehlens einer Thiolgruppe unfähig ist, TP508-Addukte zu erzeugen. Diese Ergebnisse legen nahe, dass der beste pH-Wert zur Hemmung einer Dimerbildung von TP508 aufgrund dieses Experiments ohne jedes Antioxidationsmittel bei pH 6,0 lag. Bei Zugabe von 0,5 % (Gew/V) Methionin wurde bei pH 5,5 die niedrigste Rate erhalten (0,0183), was in Tabelle 10 angegeben ist. Die Rate der Bildung von Unbekannten ist umgekehrt proportional zum pH-Wert von 4,5 bis 6,0, was anzeigt, dass TP508 bei diesem Puffersystem einer Säurehydrolyse unterliegt. Auch ergab Methionin in diesem Experiment keine Verhinderung oder Verursachung der Bildung von Unbekannten. Kurz gesagt scheint Methionin das beste Antioxidationsmittel zur Verhinderung oder Verringerung einer Dimerisierung von TP508 ohne die Bildung von TP508-Addukten zu sein und die langsamste Rate der Bildung eines unbekannten Peaks lag bei diesem Experiment bei pH 6,0.

Die zweiwertigen Chelatbildner Diethylentriaminpentaessigsäure (DPTA) und Bathophenanthrolindisulfonsäure (BPADA), von denen bekannt ist, dass sie Kupferionen chelatisieren, wurden auf deren Fähigkeit zur Hemmung der TP508-Dimerbildung getestet.

• A. 50 mM Acetat/100 mM NaCl, pH 5,4
• B. 50 mM Acetat/100 mM NaCl, pH 5,4 mit 10 &mgr;M DTPA
• C. 50 mM Acetat/100 mM NaCl, pH 5,4 mit 10 &mgr;M BPADA

TP508 (10 &mgr;g/ml) wurde mit den oder ohne die Chelatbildner in Polypropylenzentrifugenröhrchen bei Raumtemperatur inkubiert und zu den angegebenen Zeitpunkten durch Kapillarelektrophorese analysiert, um eine Dimerbildung zu überwachen.

Diese Ergebnisse belegen, dass andere Chelatbildner als EDTA ebenfalls TP508 stabilisieren können, um eine Dimerbildung zu verhindern oder zu verringern.

TP508 (3,60 mg, Bachem Fmoc) wurde zu Pluronic-Gelen (72 ml) unter Bildung einer Konzentration von 50 &mgr;g/ml in 100-ml-Becherglas mit einem Magnetrührstäbchen gegeben. Die Gele wurden 1 h bei 4 °C gerührt, um vollständiges Mischen zu erreichen. Für die Probe D wurden Gele in einer Stickstoffatmosphäre unter Verwendung einer Stickstoffgasdecke gerührt. Gele wurden dann bis zum Rand einer 1-ml-Polypropylenampulle eingefüllt. Die Ampulle wurde mit einer teflonausgekleideten Kappe verschlossen, um die Einführung jeglicher Luftbläschen in die Gele zu verhindern. Die Proben wurden bei entweder 4 °C oder in einer Schublade (25 °C) lichtgeschützt aufbewahrt.

In einer kommerziellen Formulierung kann TP508 zu einem vollständig formulierten Gel oder einer Zwischenphase, die geeignete Stabilisatoren enthält, gemäß der Beschreibung in Beispiel 3, Tabelle 3, gegeben werden.

Zwar wurde diese Erfindung unter Bezug auf bevorzugte Ausführungsformen derselben speziell angegeben und beschrieben, doch ist dem Fachmann klar, dass verschiedene Änderungen in Bezug auf Form und Einzelheiten in dieser ohne Abweichung vom Umfang der Erfindung, der durch die angehängten Ansprüche angegeben ist, durchgeführt werden können.