Die vorliegende Erfindung betrifft natives P5-Außenmembran-Protein des Bakterienstammes Haemophilus influenzae und auf P5-Protein gerichtete Antikörper. Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Isolierung von P5-Protein und eine Vakzin-Zusammensetzung zur Verwendung bei der Behandlung von Haemophilus influenzae-Infektionen.

Die Haemophilus influenzae-Stämme sind in zwei Gruppen unterteilt, typisierbare und nicht-typisierbare. Stämme, die eine bekannte Kapsel aufweisen, werden durch eine serologische Reaktion der Kapsel mit Referenz-Antiseren typisiert. Derzeit sind die Typen a–f als typisierbar identifiziert. Stämme, die keine Kapsel besitzen und nicht mit irgendeinem der Referenz-Antiseren reagieren, sind nicht typisierbar.

Nicht-typisierbare Haemophilus influenzae(NTHi)-Infektionen sind bei mehreren Krankheitszuständen impliziert, einschließlich Otitis media, Sinusitis und chronische obstruktive Lungenerkrankung („chronic pulumonary obstructive disease"). Haemophilus in fluenzae, Typ b (Hib), ist eine Hauptursache für Meningitis und andere invasive Infektionen bei Kindern im Alter von unter vier Jahren. Antikörper, die gegen das kapselförmige Polysaccharid des Organismus gerichtet sind, sind bakterizid, in vitro opsonisch und bei Versuchstieren und Menschen schützend. Wie hierin verwendet, ist opsonisch als Präparation der Oberfläche von Mikroorganismen definiert, so dass diese leichter von Phagozyten aufgenommen werden können. Obgleich sichere und wirksame Vakzine zur Prävention der Haemophilus influenzae-Typ B-Erkrankung erzeugt wurden, basieren die Vakzine alle auf der Herstellung von Antikörpern gegen die Polysaccharid-Kapsel, die sich bei den Bakterien außerhalb der Zellwand befindet. NTHi-Stämme von Haemophilus influenzae-Stämmen fehlt per definitionem eine Kapsel. Daher sind Antikörper gegen die Kapsel nicht wirksam zur Verhinderung von NTHi-Infektionen.

Es besteht ein Interesse daran, die Außenmembran-Proteine von Haemophilus influenzae-Bakterien zu charakterisieren und ihr Vakzin-Potential zu beurteilen. Munson et al. (J. Clin. Invest, 72:677–684 (1983)) berichteten die Reinigung und Charakterisierung von 22, einem der Haupt-Außenmembran-Proteine von Haemophilus influenzae-Stämmen. Die Forscher stellten fest, dass das P2-Protein in hohen Konzentrationen vorhanden ist, leicht zu reinigen ist und bei Kaninchen schützende Antikörper induziert. Man vermutet, dass das P5-Protein mit der Außenmembran-Proteinschicht in Verbindung steht und früher durch Solubilisierung mit Natriumdodecyl-Sulfat (SDS) und organische Lösungsmittel-Fraktionierung extrahiert wurde (Coulton et al., Can. J. Microbiology, 20:280–287 (1983)). Es wurde jedoch angedeutet, dass die Verwendung von SDS Proteine unter bestimmten Umständen denaturieren könnte.

Munson und Granoff (American Society of Microbiology, Infection and Immunity, Bd. 49, Nr. 3, S. 544 (1985)) berichteten die teilweise Charakterisierung von P5- und P6-Proteinen. Die Ergebnisse deuteten darauf hin, dass während der P6-Zellwand-Komplex bei Kaninchen Antikörper hervorrief, die im Ratten-Modell mit unreifen Ratten („infant rat model") eine schützende Aktivität hatten, P5 kein Antiserum ergab, welches bei unreifen Ratten schützend wirkte, und seine Antiseren kehrten auch nicht nach einer Immunfluoreszenz an die Oberfläche von Bakterien zurück, welche in vitro eine Immunfluoreszenz aufwiesen. Auf Grund dieser Ergebnisse schlossen die Fachleute, dass 25 kein Vakzin-Anwärter für die Prävention von durch Haemophilus influenzae, Typ b, verursachte Krankheiten sei.

Munson et al. (Infection and Immunity, 61:4017–4020 (1993)) berichteten von der Klonierung und Expression des P5-Proteins in E. coli. Das so hergestellte Protein lag jedoch großteils in denaturierter Form vor und wurde nicht für korrekt gefaltet erachtet.

Es ist daher ein Ziel der vorliegenden Erfindung, im Wesentlichen reines, natives P5-Außenmembran-Protein von Haemophilus influenzae-Bakterien, auf P5-Protein gerichtete Antikörper, und eine Vakzin-Zusammensetzung zur Verwendung bei der Behandlung von infektiösen Stämmen von Haemophilus influenzae vorzusehen.

Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Reinigung von P5-Protein aus der Außenmembran von Haemophilus influenzae-Bakterien vorzusehen, welches ein Protein ergibt, das zur Herstellung aktiver Antikörper verwendet werden kann. So kann P5 verwendet werden, um ein Vakzin für NTHi und Typ b-Stämme von Haemophilus influenzae herzustellen. Die Erfindung kann durch Bezugnahme auf die folgenden Zeichnungen und die detaillierte Beschreibung besser verstanden werden.

1 sieht ein Natriumdodecyl-Sulfat(SDS)-Gel von gereinigten nicht-typisierbaren und Typ B-P5-Proteinen vor. Das Dublett in Bahn 1 repräsentiert die durch Hitze modifizierte und nicht durch Hitze modifizierte Form des P5-Proteins.

2 sieht die Aminosäuresequenz des gereinigten P5-Proteins vor, welches einen bakteriziden Antikörper hervorrufen kann.

3 sieht Ganzzellen-ELISA-Endpunkt-Titer vor, die von Kaninchen-Antiseren erzeugt wurden, welche gegen NTHi P5 gerichtet waren.

4 sieht Ganzzellen-ELISA-Endpunkt-Titer vor, die von Maus-Antiseren erzeugt wurden, welche gegen NTHi P5 gerichtet waren.

5 sieht die bakterizide Aktivität von P5-Antiserum aus P860295 gegen mehrere verschiedene, nicht-typisierbare Haemophilus-Stämme vor.

Die vorliegende Erfindung betrifft ein gereinigtes, natives P5-Außenmembran-Protein von nicht-typisierbaren Haemophilus influenzae-Bakterien. Das P5-Protein ist ein durch Hitze modifizierbares 28–35 kDa-Außenmembran-Protein mit sowohl konservierten als auch variablen Regionen.

Das P5-Protein hat mehrere Eigenschaften, die dieses (und Peptide und Proteine, die Epitope des P5-Proteins haben) besonders wertvoll für eine Impfung gegen nicht-typisierbaren Haemophilus influenzae machen. Wie hierin verwendet, ist Epitop als eine Region eines Antigens definiert, an welche die variable Region eines Antikörpers bindet. Die meisten Antigene haben eine große Anzahl von Epitopen, und daher enthält ein polyvalentes Antiserum gegen das Antigen eine große Anzahl verschiedener Antikörper, wobei jeder Antikörper an ein anderes Epitop des Antigens binden kann. Im Gegensatz zu im Stand der Technik veröffentlichten Berichten kann das P5-Protein Antikörper hervorrufen, die auf die Oberfläche der Bakterien reagieren und bakterizid sind. Das Protein wurde gereinigt und es zeigte sich, dass es eine Immunantwort gegen verschiedene Stämme von nicht-typisierbarem Haemophilus influenzae induziert.

Die Peptide oder Proteine der vorliegenden Erfindung tragen ein gemeinsames Epitop mit dem P5-Protein und sind somit immunologisch kreuz-reaktiv mit diesem. Sie können Fragmente oder Oligopeptide umfassen, die Epitope des P5-Proteins enthalten. Wie hierin verwendet, sind Oligopeptide als polymere Ketten einiger monomerer Repeat-Einheiten definiert. Die N-terminale Aminosäuresequenz des P5-Proteins wurde bestimmt und ist in SEQ ID NR:1 gezeigt. Die Peptide und Proteine der vorliegenden Erfindung umfassen jedes Peptid oder Protein, das mindestens einen Teil der in 2 dargestellten Aminosäuresequenz oder irgendwelche biologisch äquivalente Sequenzen hat. Zu veränderten Sequenzen zählen Sequenzen, in welchen funktionell äquivalente Aminosäurereste für Reste innerhalb der Sequenz substituiert sind, was zu einer stillen Veränderung führt. Beispielsweise können eine oder mehrere Aminosäurereste innerhalb der Sequenz für eine andere Aminosäure von ähnlicher Polarität, die als funktionelles Äquivalent wirkt, substituiert werden, was zu einer stillen Veränderung führt. Substituenten für eine Aminosäure innerhalb der Sequenz können von anderen Mitgliedern der Klasse, zu welcher die Aminosäure gehört, ausgewählt werden. Beispielsweise inkludieren die nicht-polaren (hydrophoben) Aminosäuren Glycin, Alanin, Leucin, Isoleucin, Valin, Prolin, Phenylalanin, Tryptophan und Methionin. Die polar neutralen Aminosäuren inkludieren Serin, Threonin, Cystein, Tyrosin, Asparagin und Glutamin. Die geladenen (basischen) Aminosäuren inkludieren Arginin, Lysin und Histidin. Die negativ geladenen (sauren) Aminosäuren inkludieren Asparagin- und Glutaminsäure.

Die Peptide und Proteine der vorliegenden Erfindung inkludieren auch Fragmente oder Oligopeptide, die Epitope des P5-Proteins haben, die innerhalb der Sequenz dargestellt sind oder jegliche Analoga solcher Fragmente oder Epitope. Zusätzlich kann jedes der Peptide und Proteine zur Konjugation mit anderen Molekülen modifiziert sein, z.B. durch das Anhängen von Kupplungsgruppen, wie die Aminosäuren Cystein und Lysin, oder andere verbindende Gruppen.

Wie nachstehend im Detail beschrieben, eignen sich das P5-Protein und die Peptide und Proteine dieser Erfindung in vielen verschiedenen Formen (z.B. alleine oder in Mischungen) in Vakzinen. Für diese Zwecke werden die Peptide und Proteine durch Isolierung aus Haemophilus influenzae oder durch chemische Synthese, oder potentiell durch biotechnologische Methoden, wie rekombinante Expression in verschiedenen Wirtszellen, hergestellt.

Natives P5-Protein wird aus Haemophilus influenzae durch ein differentielles Detergens-Extraktionsverfahren gereinigt. Dieses Verfahren umfasst nicht die Verwendung von Denaturierungsmitteln und Reduktionsmitteln, wie Natriumdodecylsulfat bzw. 2-Mercaptoethanol, die wichtige antigene Epitope des Proteins zerstören können und die nicht in großem Umfang als sicher für die Verabreichung an Menschen akzeptiert werden.

Bei diesem Verfahren werden zuerst Außenmembran-Komponenten von Haemophilus influenzae-Zellen erhalten. Außenmembran-Komponenten können aus einer Ganzzellen-Membran-Fraktion hergestellt werden. Gesamtmembran-Fraktionen werden typischerweise durch differentielle Sedimentation nach dem Aufbrechen von Haemophilus influenzae-Zellen durch Verfahren wie Ultraschallbehandlung, Mahlen oder Austreiben aus einer „French press" oder anderen Homogenisations-Vorrichtungen hergestellt. Die Gesamtmembran-Fraktion wird dann in Innen- und Außenmembranen durch Dichte-Gradienten-Sedimentation oder durch differentielle Solubilisierung der Innenmembran-Bestandteile mit bestimmten Detergentien, wie Polyoxyethylenoctylphenol (Triton X-100^TM) oder N-Lauroyl-Sarcosin-Natriumsalz (Sarcosyl), fraktioniert. Bei der bevorzugten Ausführungsform werden die äußeren Zelimembran-Komponenten durch Differential-Solubilisierung von Innenmembranen in 0,1–2% (Gew./Vol.) Triton X-100 in 100 mM HEPES-NaOH, 1 mM MgCl₂, pH 7,4, zubereitet. Diese Extraktion wird typischerweise zwei Mal durchgeführt.

Als alternative Quelle der Außenmembran-Komponenten ist ein Kulturmedium von Haemophilus influenzae-Zellen geeignet. Das Medium enthält abgeworfene Komponenten („blebs" genannt) der Außenmembran der Bakterien. Vgl. Loeb, M.R. (1987) Infection and Immunity 55 (11):2612–2618.

Die Solubilisierung des P5-Proteins aus dem Außenmembran-Zellwand-Komplex wird dann durch eine dreistufige Differential-Solubilisierung erreicht. In der ersten Stufe wird eine wässerige Lösung von 0,1–10%, typischerweise 0,1–2% (Gew./Vol.) Dodecylsulfobetain (Zwittergent^TM 3–14) verwendet, um die Außenmembran-Proteine zu entfernen. Vorzugsweise wird eine 1% Lösung verwendet, und die Extraktion wird gewöhnlich 2–3 Mal durchgeführt. Nach den Zwittergent^TM 3–14 und 0,5M NaCl-Extraktionen wird das P5-Protein mit 1% Sarcosyl in 50 mM Tris-HCl, pH 8, 5 mM Na₂EDTA solubilisiert. Die Extrakte werden auf 1% Zwittergent^TM 3–14 im selben Puffer eingestellt und gegen einen 10-fachen Überschuss von 1% Zwittergent^TM 3–14 in 50 mM Tris-HCl, pH 8, 5 mM Na₂EDTA (3X) während 24 Stunden dialysiert. Der dialysierte Extrakt wird dann durch eine Anionen-Austauscher(DEAE)-Säule und eine in Tandem verbundene Kationen-Austauscher(S)-Säule geleitet. Die Säulen werden getrennt, und die S-Säule wird mit einem steigenden Salz-Gradienten im selben Zwittergent-enthaltenden Puffer eluiert. Das gereinigte P5-Protein wird als einzelner Peak eluiert, wie mittels SDS-PAGE (1) analysiert.

Das mit diesem Verfahren gereinigte P5-Protein ist im Wesentlichen frei von bakteriellem Endotoxin und ist für eine Verabreichung an Menschen geeignet. Das gereinigte Präparat des P5-Proteins wird dann alleine als pharmazeutische Zusammensetzung formuliert, wie z.B. ein Vakzin für Haemophilus influenzae, oder in einer Mischung mit Adjuvantien und/oder mit Antigenen von anderen, bei Otitis media oder anderen Krankheiten implizierten Organismen. Gewünschtenfalls wird das Protein mittels chemischer oder enzymatischer Standard-Techniken fragmentiert, um antigene Segmente zu erzeugen.

Die Peptide und Proteine dieser Erfindung können chemisch synthetisiert werden gemäß der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID Nr:1 gezeigt ist, oder Variationen dieser Sequenz, wie oben beschrieben. Jede der Standard-Chemien für die Fest- oder Flüssigphasen-Synthese von Peptiden und Proteinen ist geeignet. Für die Herstellung von Oligopeptiden, die Epitope von P5-Protein enthalten, kann die chemische Synthese besonders geeignet sein.

Die Erfahrung mit Antikörpern gegen das kapselförmige Polysaccharid von Haemophilus influenzae zeigt, dass die Fähigkeit der Antikörper, die Bakterien in in vitro-Tests zu töten, mit der Fähigkeit, eine schützende Immunantwort bei Kleinkindern des Menschen hervorzurufen, eng korreliert (Fedea et al., J. Infect. Dis., 160, 999–1004 (1989)).

Als Antwort auf die Peptide und Proteine dieser Erfindung hervorgerufene Anti-P5-Protein-Antikörper werden unter Verwendung ähnlicher in vitro-Test-Systeme getestet, um die Fähigkeit, Haemophilus influenzae-Zellen zu töten, zu demonstrieren. Diese Ergebnisse zeigen eine ähnliche Korrelation mit der Fähigkeit des P5-Proteins, eine schützende Immunantwort hervorzurufen, und dienen als Vakzin für Kleinkinder, Kinder und erwachsene Menschen.

Ein in vitro-Komplement-vermitteltes bakterizides Test-System (Musher et al., 1983, Infect. Immun. 39:297–304; Anderson et al., 1972, J. Clin. Invest. 51:31–38), welches früher zur Messung der bakteriziden Aktivität von Antikörpern gegen PRP und Lipopolysaccharid (LPS) gegen Haemophilus influenzae verwendet wurde, ist geeignet für die Bestimmung, ob ein Antikörper, der gegen ein besonderes Peptid Protein oder Fragment davon gerichtet ist, eine bakterizide Aktivität gegen nicht-typisierbaren Haemophilus influenzae aufweist.

Die Peptide und Proteine der vorliegenden Erfindung sind als Immunogene in Untereinheits-Vakzinen für die Impfung gegen nicht-typisierbaren Haemophilus influenzae geeignet. Die Vakzine sind geeignet, eine Anfälligkeit für akute Otitis media und andere, von nicht-typisierbaren Stämmen des Organismus verursachte Erkrankungen zu verhindern oder zu verringern, im Allgemeinen, um Kinder oder Erwachsene gegen Otitis media zu impfen, oder für Kinder, bei welchen ein Risiko besteht, Otitis media oder andere Erkrankungen zu bekommen (beispielsweise Kinder mit einer Ohreninfektion in ihrer Krankengeschichte).

Die Peptide und Proteine dieser Erfindung werden als univalente und multivalente Vakzine formuliert. Wie hierin verwendet, sind univalente Vakzine als Einzelkomponenten-Vakzine definiert, und sind multivalente Vakzine als Multi-Komponenten-Vakzine definiert.

Das P5-Protein selbst wird so verwendet, wie es hergestellt wurde, oder mittels oben beschriebener Methoden isoliert oder mit anderen Antigenen gemischt.

Die Peptide oder Proteine dieser Erfindung werden als multivalente Untereinheits-Vakzine in Kombination mit anderen Antigenen von Haemophilus influenzae verabreicht.

Wie erwähnt, rufen Peptide und Proteine mit Epitopen von P5-Protein bakterizide Antikörper hervor, die beim Töten von Haemophilus influenzae mit Antikörpern gegen andere Außenmembran-Proteine von Haemophilus influenzae synergistisch wirken. Somit wird bei einer Ausführungsform der Erfindung das P5-Protein in Verbindung mit anderen Außenmembran-Proteinen von Haemophilus influenzae (oder Peptiden oder Proteinen mit Epitopen davon) verabreicht, um eine synergistische bakterizide Aktivität zu erzielen. Besonders bevorzugte Außenmembran-Proteine von Haemophilus influenzae sind das Peptidoglycan-assoziierte Außenmembran-Lipoprotein (PAL) und das Haemophilus-Lipoprotein PCP, beschrieben von Deich, P.A. et al. (1988) J. Bacteriol. 170(2): 489–498.

Zur kombinierten Verabreichung mit Epitopen anderer Außenmembran-Proteine wird das P5-Protein-Peptid entweder separat, als Mischung, oder als Konjugat oder genetisches Fusionspeptid oder -Protein verabreicht. Beispielsweise wird das PAL und PCP oder irgendwelche von ihnen stammende Proteine, Peptide oder Epitope als Mischung oder als Konjugat oder Fusion mit einem P5-Protein oder einem von P5-Protein stammenden Peptid oder Protein verabreicht. Das Konjugat wird mittels Standard-Techniken zur Kopplung proteinhältiger Materialien gebildet. P5-Protein oder jegliche davon abstammende Peptide oder Proteine können in Verbindung mit Antigenen anderer Organismen (z.B. eingekapselten oder nicht eingekapselten, Bakterien, Viren, Pilzen und Parasiten) verwendet werden. Beispielsweise ist das P5-Protein nützlich in Verbindung mit Antigenen anderer Mikroorganismen, die bei Otitis media oder anderen Erkrankungen impliziert sind. Zu diesen zählen Streptococcus pneumonia, Streptococcus pyogenes, Gruppe A, Staphylococcus aureus, Respiratory Syncytial-Virus und Branhemella catarrhalis.

Bei der Formulierung der Vakzin-Zusammensetzungen mit dem Peptid oder Protein, alleine oder in den verschiedenen beschriebenen Kombinationen, wird das Immunogen auf eine geeignete Konzentration eingestellt und mit irgendeinem geeigneten Vakzin-Adjuvans formuliert. Das Immunogen kann auch in Liposome eingearbeitet werden oder mit Polysacchariden und/oder anderen Polymeren konjugiert werden zwecks Verwendung in einer Vakzin-Formulierung.

Die Vakzine der vorliegenden Erfindung werden auf vielerlei Wegen an Menschen oder Tiere verabreicht. Zu diesen zählen der intradermale, intramuskuläre, intraperitoneale, intravenöse, subkutane, orale und intranasale Verabreichungsweg.

Die Peptide und Proteine dieser Erfindung werden auch als Lebend-Vakzin verabreicht. Zu diesem Zweck werden rekombinante Mikroorganismen hergestellt, die die Peptide oder Proteine exprimieren. Der Vakzin-Empfänger wird mit dem rekombinanten Mikroorganismus geimpft, welcher sich im Empfänger vermehrt, das P5-Protein-Peptid oder Protein exprimiert und eine Immunantwort auf Haemophilus influenzae hervorruft. Bevorzugte Lebend-Vakzin-Vektoren sind Pox-Viren, wie Vaccinia (Paoletti und Panicali, U.S. Patent Nr. 4,603,112) und attenuierte Salmonella-Stämme (Stocker, U.S. Patent Nr. 4,550,081).

Lebend-Vakzine sind besonders vorteilhaft, weil sie zu einem längeren Stimulus führen, welcher eine im Wesentlichen lang andauernde Immunität vermitteln kann. Wenn die Immunantwort gegen eine nachfolgende Haemophilus influenzae-Infektion schützt, kann das Lebend-Vakzin selbst in einem präventiven Vakzin gegen Haemophilus influenzae verwendet werden.

Multivalente Lebend-Vakzine werden aus einem einzigen oder aus einigen rekombinanten Mikroorganismen, die verschiedene Epitope von Haemophilus influenzae exprimieren (z.B. andere Außenmembran-Proteine, wie PAL und PCP, oder Epitope davon), hergestellt. Zusätzlich können Epitope anderer pathogener Mikroorganismen in das Vakzin eingearbeitet werden. Beispielsweise kann ein Vaccinia-Virus so konstruiert werden, dass er Codiersequenzen für andere Epitope zusätzlich zu jenen von Haemophilus influenzae enthält. Ein solches rekombinantes Virus kann selbst als Immunogen in einem multivalenten Vakzin verwendet werden. Alternativ kann eine Mischung von Vaccinia oder anderen Viren, von welchen jedes ein anderes Gen exprimiert, das für verschiedene Epitope von Außenmembran-Proteinen von Haemophilus influenzae und/oder Epitope anderer krankheitsverursachender Organismen codiert, als multivalentes Vakzin formuliert werden.

Ein anderes Vakzin der vorliegenden Erfindung ist ein inaktiviertes Virus-Vakzin. Inaktivierte Vakzine sind „tot" in dem Sinn, dass ihre Infektiosität zerstört wurde, gewöhnlich durch chemische Behandlung (z.B. eine Formaldehyd-Behandlung). Idealerweise wird die Infektiosität des Virus zerstört, ohne die Proteine, die die Immunogenität des Virus tragen, zu beeinflussen. Um inaktivierte Vakzine herzustellen, werden große Mengen des rekombinanten Virus, das die gewünschten Epitope exprimiert, in Kultur gezüchtet, um die nötige Menge der relevanten Antigene vorzusehen. Eine Mischung aus inaktivierten Viren, die verschiedene Epitope exprimieren, ist für die Formulierung „multivalenter" Vakzine geeignet. In gewissen Fällen sind diese „multivalenten" inaktivierten Vakzine einer Lebend-Vakzin-Formulierung vorzuziehen wegen der potentiellen Schwierigkeiten, die sich aus der gegenseitigen Beeinflussung von gemeinsam verabreichten Lebend-Viren ergeben. In jedem Fall wird das inaktivierte Virus oder die Mischung von Viren in einem geeigneten Adjuvans formuliert, um die immunologische Antwort auf die Antigene zu verstärken. Zu den geeigneten Adjuvantien zählen: oberflächenaktive Substanzen, z.B. Hexadecylamin, Octadecylaminosäure-Ester, Octadecylamin, Lysolecithin, Dimethyl-dioctadecylammoniumbromid, N,N-Dicoctadecyl-N'-N'-bis(2-hydroxyethylpropan-diamin), Methoxyhexadecylglycerin und Pluronic-Polyole, Polyamine, z.B. Pyran, Dextransulfat, Poly-IC, Carbopol; Peptide, z.B. Muramyldipeptid, Dimethylglycin, Tuftsin, Ölemulsionen, und Mineral-Gele, z.B. Aluminiumhydroxid, Aluminiumphosphat, usw.

Die Peptide und Proteine der vorliegenden Erfindung sind auch für die Herstellung polyklonaler Antikörper zur Verwendung in der passiven Immuntherapie gegen Haemophilus influenzae geeignet. Humanes Immunglobulin wird bevorzugt, weil heterologes Immunglobulin eine nachteilige Immunantwort auf seine fremden immunogenen Bestandteile auslösen kann. Polyklonales Antiserum wird von Individuen erhalten, die mit den Peptiden oder Proteinen in einer der beschriebenen Formen immunisiert wurden. Die Immunglobulin-Fraktion wird dann angereichert. Beispielsweise werden Immunglobuline, die für die Epitope von P5-Protein spezifisch sind, durch Immunaffinitäts-Techniken unter Verwendung der Peptide oder Proteine dieser Erfindung angereichert. Der Antikörper wird aus Antiseren auf ein Immunadsorbens, das Epitope des P5-Proteins enthält, spezifisch absorbiert und dann vom Immunadsorbens als angereicherte Immunglobulin-Fraktion eluiert.

Zusätzlich können Nukleinsäuren, die die Nukleotidsequenz des Gens aufweisen, welches für das P5-Protein codiert, oder irgendwelche Nukleotidsequenzen, die mit diesem hybridisieren, als Sonden in Nukleinsäure-Hybridisierungs-Tests für die Detektion von Haemophilus influenzae in verschiedenen Geweben oder Körperflüssigkeiten von Patienten verwendet werden. Die Sonden können in jeder Form von Nukleinsäure-Hybridisierungs-Test verwendet werden, einschließlich: Southern Blots (Southern, 1975, J. Mol. Biol. 98:508); Northern Blots (Thomas et al., 1989, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 77:5201–05); Kolonie-Blots (Grunstein et al., 1975, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 72:3961–65), usw. Die Stringenz der Hybridisierung kann je nach den Erfordernissen des Tests variiert werden.

Die Erfindung ist weiters durch die folgenden Beispiele veranschaulicht.

Protein-Extrakte von P5 werden sowohl aus NTHi als auch Hib-Stämmen durch differentielle Detergens-Extraktion von Außenmembranen erhalten. Nach Zwittergent Octylglucosid 3–14 und Zwittergent 3–14 und 0,5 M NaCl-Extraktionen wird das P5-Protein mit 1% Sarcosyl in 50 mM Tris-HCl, pH 8, 5 mM Na₂EDTA solubilisiert. Die Extrakte werden auf 1% Zwittergent^TM 3–14 im selben Puffer eingestellt und gegen einen 10-fachen Überschuss von 1% Zwittergent^TM 3–14 in 50 mM Tris-HCl, pH 8, 5 mM Na₂EDTA (3X) während 24 Stunden dialysiert. Der dialysierte Extrakt wird dann durch eine Anionen-Austauscher(DEAE)-Säule und eine in Tandem verbundene Kationen-Austauscher(S)-Säule geleitet. Die Säulen werden getrennt, und die S-Säule wird mit einem steigenden Salz-Gradienten im selben Zwittergent enthaltenden Puffer eluiert. Das gereinigte P5-Protein wird als einzelner Peak eluiert, wie mittels SDS-PAGE analysiert (1).

Protease-Verdau, Peptid-Isolierung und Protein-Sequenzierung Gereinigtes NTHi P5 und Hib P5 werden direkt verwendet, um die N-terminale Aminosäuresequenz zu bestimmen (2). Die gesamte Sequenz des NTHi-Proteins wird bestimmt, indem überlappende Peptide durch Protease-Verdau mit mehreren Proteasen, einschließlich Endopeptidasen Lys-C, Arg-C, Glu-C, Papain, Trypsin und Chymotrypsin erhalten werden. Cyanogenbromid wird ebenfalls zur Spaltung des Proteins an Methionin-Resten verwendet, um große Fragmente zu erzeugen. Die Peptide werden unter Verwendung eines Microbore-Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographen (HPLC) isoliert, und die Sequenzen mit einem Protein-Sequenzierer bestimmt. Bei der fluchtenden Ausrichtung der Peptide werden überlappende Peptide und eine Homologie mit dem E. coli-OmpA-Protein verwendet (2).

Ganze, mit Formalin fixierte Haemophilus influenzae-Zellen aus mehreren verschiedenen Stämmen werden von mid-log Phasen-Zellen, die auf eine OD₄₉₀ = 1,0 in BHI-XV-Medium gezüchtet worden waren, hergestellt. Die Zellen werden zweimal in mit Phosphat gepufferter Kochsalzlösung (phosphate buffered saline, PBS) (7 mM NaHPO₄-7H₂O, 2 mM KH₂PO₄, 2 mM KCl, 137 mM NaCl, pH 7,4) gewaschen, dann in PBS mit 0,3% Formalin resuspendiert und bei Raumtemperatur 1–2 Stunden lang inkubiert. Das Formalin wird durch Waschen der Zellen in PBS und Resuspendieren der Zellen in PBS auf eine Endkonzentration OD₆₂₀ = 0,2 entfernt. 75 Mikroliter der Zellen werden dann in die Vertiefungen von Mikrotiter-Platten zugegeben und über Nacht bei 37°C getrocknet. Die Platten werden mit PBS-0,1% Tween-20 eine Stunde lang blockiert und in einem Mikroplatten-Waschgerät gewaschen. 100 Mikroliter Antiserum, verdünnt in mit Phosphat gepufferter Kochsalzlösung, enthaltend 0,15 mM CaCl₂, 0,5 mM MgCl₂, 1% Gelatine und 0,3% Tween-20 (PCM-GT) werden in die Vertiefungen zugegeben, und die Platten werden bei 37°C zwei Stunden lang inkubiert. Nach dem Waschen wurden gebundene Antikörper mit Ziegen-anti-Maus (IgG+IgM), konjugiert mit alkalischer Phosphatase (TAGO), verdünnt in PBS 0,05% Tween-20, 0,1% Gelatine, eine Stunde lang bei 37°C detektiert. Die Zellen wurden wiederum gewaschen, und die Platten wurden mit 1 mg/ml Lösung von p-Nitrophenylphosphat (SIGMA) in Diethanolamin 30 Minuten lang entwickelt. Die Reaktion wird nach Zugabe von 3N NaOH gestoppt. Die Platten werden auf einem Lesegerät bei OD₉₅₀, Referenz OD₆₂₀, abgelesen. Ganzzellen-ELISA-Daten für Kaninchen und Maus-anti-P5-Serum sind in 3 bzw. 4 gezeigt.

Zellen aus mehreren verschiedenen Haemophilus influenzae-Stämmen werden über Nacht in BHI-XV-Medium gezüchtet. Am folgenden Tag werden frische Kulturen aus einer 1:10-Verdünnung der Über-Nacht-Stammlösung zubereitet und auf OD₄₉₀ = 1,0 gezüchtet. Während des Zellwachstums wird eine Komplement-Quelle, prä-kolostrales Kälberserum, mit P860295-Zellen eine Stunde lang prä-adsorbiert. Die Zellen werden dann vom Komplement weg pelletiert, und das präadsorbierte Komplement wird durch eine 0,2 &mgr;m Filtereinheit sterilfiltriert und vor Verwendung auf Eis gelagert. Das gesamte, in diesem Test gescreente Antiserum wird bei 56°C 15 Minuten lang hitzeinaktiviert, um die Komplement-Aktivität zu entfernen, und 1:5 in PCM verdünnt, gefolgt von nachfolgenden zweifachen Verdünnungen, die in sterilen Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen zubereitet werden. Die zu einer OD₄₁₀ = 1,0 gezüchteten Bakterienzellen werden 1:100.000 in PCM, das die Komplementquelle in einer Verdünnung von 1:5 enthält, verdünnt. 15 Mikroliter dieser Mischung werden zu den seriellen Verdünnungen von Antiserum zugegeben, und man lässt die Platten 45 Minuten bei 37°C inkubieren. Danach werden 10 Mikroliter jeder Reaktion auf BHI-XV ausplattiert. Nach einer Inkubation bei 37°C über Nacht werden die Kolonien gezählt, um die bakteriziden Titer zu bestimmen (das Reziproke der höchsten Verdünnung von Antiserum, die mehr als 50% der Bakterien töten kann, im Vergleich zu Präimmunseren-Kontrollen). Die bakteriziden Daten in Bezug auf P5 sind in 5 dargestellt.