Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Aufrechterhaltung der Qualität einer wässrigen Injektions-Zubereitung von Thrombomodulin in Form einer nicht-gefrorenen oder nicht-gefriergetrockneten Flüssigkeit während ihrer Lagerung bzw. während des Transports, und eine wässrige Injektions-Zubereitung von Thrombomodulin, die während ihrer Lagerung bzw. während des Transports stabil ist.

Thrombomodulin (im nachfolgenden Text manchmal als TM abgekürzt) ist eine Substanz mit einer Funktion, spezifisch mit Thrombin zu koppeln und die Aktivierung des Proteins C durch Thrombin beachtlich zu beschleunigen. Das Protein C besteht aus einem von Vitamin K abhängigen Protein, das eine wichtige Rolle im System der Koagulation und der Fibrinolyse spielt und durch die Wirkung von Thrombin zu aktiviertem Protein C aktiviert wird. Es ist bekannt, dass aktiviertes Protein C die aktivierten Koagulationsfaktoren V und VIII im Blutkoagulations-System eines lebenden Körpers inaktivieren wird, und dass es an der Erzeugung von Plasminogen-Aktivator Anteil hat, welches eine thrombolytische Funktion deutlich macht (siehe Koji Suzuki, „Igaku-no Ayumi", Progress in Medical Science, Vol. 125, 901, 1983).

Somit wurde erkannt, dass Thrombomodulin die Aktivierung von Protein C durch Thrombin beschleunigt, um eine große Menge von aktiviertem Protein C zu erzeugen, das eine hemmende Wirkung auf die Blutgerinnung und die thrombolytische Funktion ausübt, und das nützlich als ein Antikoagulans und als ein thrombolytisches Mittel ist. Es wurde daher erwartet, Thrombomodulin für die Therapie und die Prophylaxe des akuten koronaren Syndroms (acute coronary syndrome, ACS) zu verwenden, zum Beispiel für Herzmuskelinfarkt und instabile Angina pectoris, zur Wiederherstellung des Blutkreislaufs in den Herzkranzgefäßen; für Therapien und Prophylaxe von Thrombosen, wie zum Beispiel akuten und chronischen Gehirnthrombosen und akuten und chronischen arteriellen und venösen peripheren Thrombosen; Verschlußkrankheiten der peripheren Blutgefäße, wie zum Beispiel Buerger'sche Krankheit und Raynaud'sche Krankheit; obstruktive Arteriosklerose; Entzündung der Blutgefäße, wie zum Beispiel systemischer Lupus erythematodes (SLE), Becet-Krankheit und Kawasaki-Krankheit; sowie für Therapien und Prophylaxe von funktionellen Störungen, die mit einem chirurgischen Eingriff am Herzen einhergehen, Komplikationen, die mit einer Organverpflanzung einhergehen, die Krankheit der Koagulation innerhalb der Gefäße (disease of intravascular coagulation, DIC), Angina pectoris, vorübergehender cerebraler ischämischer Iktus, eine Toxikose während der Schwangerschaft, Diabetes, Krankheiten des Verschlusses der Lebervene (liver venoocclusive diseases, VOD), wie zum Beispiel Krankheiten mit einem Venenverschluss, die auf eine fulminante Hepatitis oder nach einer Knochenmarks-Transplantation folgen, oder eine tiefe venöse Thrombose (deep venous thrombosis, DVT).

In der Vergangenheit wurde Thrombomodulin bestätigt und isoliert als ein Glykoprotein, das auf den endothelialien Zellen der Blutgefäße von Tieren, einschließlich des Menschen, auftritt. Unsere Gruppe von Erfindern der vorliegenden Erfindung war erfolgreich, Thrombomodulin zum ersten Mal zu klonieren. Somit hatten die Erfinder eine Klonierung von Genen einer Vorstufe eines humanen Thrombomodulins durchgeführt, das ein Signalpeptid aus einer cDNA-Bibliothek aus menschlicher Lunge aufweist, wobei ein molekularbiologisches Verfahren verwendet wurde, und wodurch die gesamte Gensequenz des Thrombomodulins analysiert wurde und seine Aminosäure-Sequenz mit 575 Resten, einschließlich eines Signalpeptids von 18 Aminosäure-Resten, aufgeklärt wurde (siehe das japanische Patent Kokai Sho 64-6219 A). Es ist bekannt, dass ein reifes Thrombomodulin, wenn das Signalpeptid abgespalten ist, aus fünf Domänen zusammengesetzt ist, nämlich aus der Domäne am Amino-Ende (Aminosäure-Rest 1 bis 226, in der Reihenfolge beginnend mit dem Amino-Ende), der Domäne mit sechs EGF-ähnlichen Strukturen (Rest 227 bis 462), der Domäne, welche reich an O-Glycosylierungs-Positionen ist (Rest 463 bis 498), der transmembranären Domäne (Rest 499 bis 521) und der zytoplasmatischen Domäne, welche jeweils der Reihe nach beginnend mit dem Amino-Ende aufgezählt wurden, wobei das Segment, welches die Aktivität aufweist, die jener des Thrombomodulins mit vollständiger Länge entspricht, nämlich der kleinsten aktiven Einheit desselben, von demjenigen Segment dargestellt wird, das aus der vierten, fünften und sechsten EGF-ähnlichen Struktur in der Domäne mit den sechs EGF-ähnlichen Strukturen besteht, wie sie der Reihe nach beginnend mit dem Amino-Ende gezählt werden (siehe M. Zushi et al., J. Biol. Chem. 246, 10351–10353, 1989).

Es wurde bestätigt, dass mindestens ein solches Thrombomodulin, welches so hergestellt wurde, dass die transmembranäre Domäne beseitigt wurde, eine solche Eigenschaft aufweist, dass es klar in Wasser gelöst werden kann, auch ohne ein beliebiges grenzflächenaktives Mittel zu verwenden (im Folgenden manchmal als „lösliches Thrombomodulin" bezeichnet), und zum Beispiel kann ein Thrombomodulin, das aus lediglich drei Domänen zusammengesetzt ist, das heißt der amino-terminalen Domäne, der Domäne mit sechs EGF-ähnlichen Strukturen und der Domäne, die reich an O-Glycosylierungs-Positionen ist, das heißt ein Thrombomodulin, das aus der Aminosäure-Sequenz von den Aminosäure-Resten 19 bis 516 der SEQ ID Nr. 1 der Sequenzliste zusammengesetzt ist, durch Verwendung einer rekombinanten Gentechnologie erhalten werden kann, und dass das so erhaltene rekombinante Thrombomodulin eine Aktivität aufweist, die gleich derjenigen des natürlichen Thrombomodulins ist (japanisches Patent Kokai Sho 64-6219 A).

Wie in vielen Fällen erkannt wurde, können Gene nebenbei eine natürliche oder künstliche Mutation aufgrund der mit ihnen durchgeführten diagnostischen Verfahren erfahren, zum Beispiel aufgrund ihrer Isolierung und dergleichen, wobei auch der Mensch keine Ausnahme darstellt, bei dem ebenso eine polymorphe Mutation entdeckt wurde, wobei zwei Mutanten der Vorstufe des humanen Thrombomodulins, das aus der Aminosäure-Sequenz besteht, welche aus den vorstehend erwähnten 575 Aminosäure-Resten zusammengesetzt ist, bestätigt wurden, bei denen der Aminosäure-Rest an Position 473 in einem Fall aus Val besteht, und in denen dieser Aminosäure-Rest im anderen Fall aus Ala besteht. Dies entspricht in der Basensequenz, welche für die Aminosäuren codiert, den Mutationen T und C jeweils an der Position 1418 (Wen et al., Biochemistry 26, 4350–4357, 1987). Sie machen jedoch deutlich, dass keinerlei Unterschied in der Aktivität und in den physikalischen Eigenschaften zueinander bestehen, und dass sie als im Wesentlichen identisch angesehen werden können. Daher wird das vorstehend erwähnte humane Thrombomodulin, das aus der Aminosäure-Sequenz der SEQ ID Nr. 1 der Sequenzliste besteht, als eines der polymorphen Formen des Peptids des Thrombomodulins angesehen, das aus der Aminosäure-Sequenz der SEQ ID Nr. 2 der Sequenzliste zusammengesetzt ist, und beide sollten so betrachtet werden, als seien sie im Wesentlichen miteinander identisch.

Auf der anderen Seite wurden Thrombomodulin-Zubereitungen laufend und ununterbrochen für die praktische Verwendung in Form eines gefriergetrockneten medizinischen Arzneimittels verbreitet. Mittlerweile wurde entdeckt, dass im Verfahren zur Gefriertrocknung einer Thrombomodulin enthaltenden, wässrigen Lösung ein Teil des Thrombomodulins, wenn auch nur in einer geringen Menge, zu einem polymeren Material aufgrund einer Denaturierung umgesetzt wird, um ein Polymer zu bilden, bei dem einige Moleküle des Thrombomodulins in Assoziation gehalten werden. Um dieses Problem zu lösen, haben die Erfinder gründliche Untersuchungen durchgeführt, wobei sie die Entdeckung machten, dass die Denaturierung des Thrombomodulins beim Gefriertrocknen desselben verhindert werden kann, von welcher Erfindung bereits vorher ein Patent angemeldet wurde (japanisches Patent Kokai Hei 6-321805 A).

Abgesehen von den vorstehenden Umständen entstand das Bedürfnis, eine neue Zubereitung in einer nicht-gefrorenen oder nicht-gefriergetrockneten Form bereitzustellen, die einfach und leicht verwendet werden kann, und die zu geringeren Herstellungskosten hergestellt werden kann.

Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben die Möglichkeit zur Herstellung einer wässrigen Injektions-Zubereitung von Thrombomodulin erforscht, welches Verfahren die Vermeidung der Durchführung eines Gefriertrocknungs-Verfahrens ermöglicht, und welches die Notwendigkeit eines Lösungs-Verfahrens bei der praktischen Anwendung beseitigt, wobei der Versuch unternommen wurde, eine neue Zubereitung zu entwickeln, die sich von der gefriergetrockneten Zubereitung unterscheidet. Obwohl es zunächst erforderlich ist, dass die verbleibende Potenz einer wässrigen Injektions-Zubereitung nach der Lagerung über einen langen Zeitraum bei 5 °C bis Raumtemperatur nicht in einem beträchtlichen Ausmaß abnehmen soll (das heißt, dass sie eine Langzeit-Stabilität aufweisen soll), haben die Untersuchungen gezeigt, dass es nicht einfach ist, eine solche Langzeit-Stabilität zu erreichen. Zu unserer Überraschung wurde darüber hinaus gefunden, dass eine wässrige Injektions-Zubereitung in manchen Fällen trüb werden kann, wenn man sie schüttelt. Es ist ausreichend ersichtlich, dass eine flüssige Zubereitung bei ihrer Verteilung einer Schüttelbewegung, wie zum Beispiel dem Transport, unterzogen werden kann, wenn auch in unterschiedlich starkem Ausmaß. Einem solchen Problem begegnete man bei der Herstellung herkömmlicher gefriergetrockneter, pulverartiger Zubereitungen nicht. Somit wurde ein neues und unerwartetes Problem durch uns im Falle der Stabilität bezüglich des Schüttelns einer wässrigen Injektions-Zubereitung erkannt. Das Vorliegen von irgendwelchem unlöslichen Material in einer Injektions-Zubereitung kann ggf. einen fatalen Unfall bei den Patienten verursachen, insbesondere solchen, die Störungen in den Kreislauf-Organen aufweisen, und somit ist das Problem der Stabilität bezüglich des Schüttelns in dem Sinn, das Auftreten einer Trübung beim Schütteln der vorstehend erwähnten wässrigen Injektions-Zubereitung zu vermeiden, ein durchaus erhebliches Hindernis, das überwunden werden muss.

Insgesamt war es bisher schwierig, eine wässrige Injektions-Zubereitung herzustellen, welche die Lagerung bzw. den Transport in flüssiger Form über einen solch langen Zeitraum ermöglichte, da eine beliebige Injektions-Zubereitung, die in Bezug auf die Langzeit-Stabilität und in Bezug auf die Stabilität bezüglich des Schüttelns zufrieden stellend ist, niemals durch einfaches Lösen von Thrombomodulin in Wasser erhalten werden kann, trotz der Umstände, dass eine wässrige Injektions-Zubereitung die vorteilhaften Merkmale aufweist, dass sie in herkömmlicher Weise an den Patienten verabreicht werden kann, ohne dass irgendein Verfahren zur Auflösung in Wasser für Injektions-Zwecke bei der praktischen Anwendung erforderlich ist, und dass sie wirtschaftlich und viel einfacher aufgrund des Wegfalls des Gefriertrocknungs-Verfahrens hergestellt werden kann, im Vergleich mit einer herkömmlichen gefriergetrockneten Zubereitung.

Die Erfinder haben gründliche Forschungsarbeiten zur Vermeidung der vorstehend beschriebenen Probleme durchgeführt, und haben gefunden, dass alle diese Probleme dadurch gelöst werden können, dass eine bestimmte Bedingung eingehalten wird, die zur Vervollständigung der vorliegenden Erfindung geführt hat.

Somit stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Aufrechterhaltung der Qualität einer wässrigen Injektions-Zubereitung von Thrombomodulin in Form einer nicht-gefrorenen oder nicht-gefriergetrockneten Flüssigkeit während ihrer Lagerung bzw. während ihres Transports bereit, welches Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, dass die wässrige Injektions-Zubereitung von Thrombomodulin als eine wässrige Lösung mit einem pH-wert im Bereich von 5 bis 7,0 hergestellt wird, und (a) ein lösliches Thrombomodulin in einer wirksamen Menge und einen Pufferbestandteil enthält, der eine puffernde Wirkung in einem pH-Bereich zwischen 5 und 7,0 entfaltet, wobei die wässrige Lösung von Thrombomodulin entweder das folgende kennzeichnende Merkmal a) oder das Merkmal b) aufweist, nämlich

• a) dass sie darüber hinaus ein grenzflächenaktives Mittel enthält und aseptisch in einen Behälter abgefüllt wird, oder
• b) dass sie aus einer im Voraus abgefüllten Spritzen-Zusammensetzung besteht, die aseptisch in einen Spritzen-Behälter abgefüllt wird, so dass jeglicher Gasraum darin im Wesentlichen ausgeschlossen wird.

Daher besteht die erste Ausführungsform des Verfahrens zur Aufrechterhaltung der Qualität einer wässrigen Injektions-Zubereitung gemäß der vorliegenden Erfindung darin, dass die wässrige Injektions-Zubereitung von Thrombomodulin, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie als eine wässrige Lösung mit einem pH-Wert im Bereich von 5 bis 7,0 hergestellt wird, und dass sie ein lösliches Thrombomodulin in einer wirksamen Menge, einen Puffer-Bestandteil, der eine puffernde Wirkung in einem pH-Bereich zwischen 5 und 7,0 entfaltet, sowie ein grenzflächenaktives Mittel enthält, und dass sie aseptisch in einen Behälter abgefüllt wird, in einer flüssigen Form über einen langen Zeitraum gelagert bzw. transportiert wird.

Die zweite Ausführungsform des Verfahrens zur Aufrechterhaltung der Qualität einer wässrigen Injektions-Zubereitung gemäß der vorliegenden Erfindung besteht darin, dass die wässrige Injektions-Zubereitung von Thrombomodulin, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie als eine wässrige Lösung mit einem pH-Wert im Bereich von 5 bis 7,0 hergestellt wird, und dass sie ein lösliches Thrombomodulin in einer wirksamen Menge und einen Puffer-Bestandteil enthält, der eine puffernde Wirkung in einem pH-Bereich zwischen 5 und 7,0 entfaltet, und dass sie aus einer im Voraus abgefüllten Spritzen-Zubereitung besteht, die aseptisch in einen Spritzen-Behälter abgefüllt wurde, so dass jeglicher Gasraum darin im Wesentlichen ausgeschlossen ist, in einer flüssigen Form über einen langen Zeitraum gelagert bzw. transportiert wird.

Die dritte bevorzugte Ausführungsform des Verfahrens zur Aufrechterhaltung der Qualität einer wässrigen Injektions-Zubereitung gemäß der vorliegenden Erfindung besteht darin, dass die wässrige Injektions-Zubereitung von Thrombomodulin, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie als eine wässrige Lösung mit einem pH-Wert im Bereich von 5 bis 7,0 hergestellt wird, und dass sie ein lösliches Thrombomodulin in einer wirksamen Menge, einen Puffer-Bestandteil, der eine puffernde Wirkung in einem pH-Bereich zwischen 5 und 7,0 entfaltet, und ein grenzflächenaktives Mittel enthält, und dass sie aus einer im Voraus abgefüllten Spritzen-Zubereitung besteht, die aseptisch in einen Spritzen-Behälter abgefüllt wurde, so dass jeglicher Gasraum darin im Wesentlichen ausgeschlossen ist, in einer flüssigen Form über einen langen Zeitraum gelagert bzw. gespeichert wird.

Die vorliegende Erfindung stellt ebenso ein Verfahren zur Verwirklichung einer Langzeit-Stabilität und einer Stabilität bezüglich des Schüttelns einer wässrigen Injektions-Zubereitung von Thrombomodulin in Form einer nicht-gefrorenen oder nicht-gefriergetrockneten Flüssigkeit bereit, welches Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, dass die wässrige Injektions-Zubereitung von Thrombomodulin als eine wässrige Lösung mit einem pH-Wert im Bereich von 5 bis 7,0 hergestellt wird, und ein lösliches Thrombomodulin in einer wirksamen Menge und einen Puffer-Bestandteil, der eine puffernde Wirkung in einem pH-Bereich zwischen 5 und 7,0 entfaltet, enthält, wobei die wässrige Lösung des Thrombomodulins entweder das folgende kennzeichnende Merkmal a) oder das Merkmal b) aufweist, nämlich

• a) dass sie darüber hinaus ein grenzflächenaktives Mittel enthält, und aseptisch in einen Behälter abgefüllt wird, oder
• b) dass sie aus einer im Voraus abgefüllten Spritzen-Zubereitung besteht, die aseptisch in ein Spritzen-Gefäß abgefüllt wurde, so dass jeglicher restlicher Gasraum darin im Wesentlichen ausgeschlossen wird.

Die wässrige Injektions-Zubereitung von Thrombomodulin, die in dem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung in Form einer nicht-gefrorenen oder nicht-gefriergetrockneten Flüssigkeit verwendet werden soll, und die als eine wässrige Lösung mit einem pH-Wert im Bereich von 5 bis 7,0 hergestellt wird, und ein lösliches Thrombomodulin in einer wirksamen Menge und einen Puffer-Bestandteil, der eine puffernde Wirkung in einem pH-Bereich zwischen 5 und 7,0 entfaltet, enthält, ist in der Stabilität bezüglich der Langzeit-Lagerung und in der Stabilität bezüglich des Schüttelns überlegen und für die Lagerung und den Transport über einen langen Zeitraum geeignet, und sie ist ferner dadurch gekennzeichnet, dass die wässrige Lösung des Thrombomodulins einen pH-Wert im Bereich von 5 bis 7,0 aufweist, und entweder das folgende kennzeichnende Merkmal a) oder das Merkmal b) aufweist, nämlich

• a) dass sie darüber hinaus ein grenzflächenaktives Mittel enthält, und aseptisch in einen Behälter abgefüllt wird, oder
• b) dass sie aus einer im Voraus abgefüllten Spritzen-Zubereitung besteht, die aseptisch in ein Spritzen-GefäfS abgefüllt wurde, so dass jeglicher restlicher Gasraum darin im Wesentlichen ausgeschlossen wird.

Somit besteht der erste Gesichtspunkt der wässrigen Injektions-Zubereitung von Thrombomodulin gemäß der vorliegenden Erfindung in einer wässrigen Injektions-Zubereitung von Thrombomodulin in Form einer nicht-gefrorenen oder nichtgefriergetrockneten Flüssigkeit, die in Bezug auf die Stabilität bei der Langzeit-Lagerung und die Stabilität bezüglich des Schüttelns überlegen ist, die für die Lagerung und den Transport über einen langen Zeitraum geeignet ist, und die dadurch gekennzeichnet ist, dass die wässrige Injektions-Zubereitung von Thrombomodulin einen pH-Wert im Bereich von 5 bis 7,0 aufweist, ein lösliches Thrombomodulin in einer wirksamen Menge, einen Puffer-Bestandteil, der eine puffernde Wirkung in einem pH-Bereich zwischen 5 und 7,0 entfaltet, und ein grenzflächenaktives Mittel enthält, und aseptisch in einen Behälter abgefüllt wird.

Der zweite Gesichtspunkt der wässrigen Injektions-Zubereitung von Thrombomodulin gemäß der vorliegenden Erfindung besteht in einer wässrigen Injektions-Zubereitung von Thrombomodulin in Form einer nicht-gefrorenen oder nicht-gefriergetrockneten Flüssigkeit, die in Bezug auf die Stabilität bei der Langzeit-Lagerung und die Stabilität bezüglich des Schüttelns überlegen ist, die für die Lagerung und den Transport über einen langen Zeitraum geeignet ist, und die dadurch gekennzeichnet ist, dass die wässrige Injektions-Zubereitung von Thrombomodulin eine im Voraus abgefüllte Spritzen-Zubereitung darstellt, die einen pH-Wert im Bereich von 5 bis 7,0 aufweist, ein lösliches Thrombomodulin in einer wirksamen Menge und einen Puffer-Bestandteil enthält, der eine puffernde Wirkung in einem pH-Bereich zwischen 5 und 7,0 entfaltet, und die aseptisch in einen Spritzen-Behälter abgefüllt wird, so dass jeglicher Gasraum darin im Wesentlichen ausgeschlossen wird.

Der dritte Gesichtspunkt der wässrigen Injektions-Zubereitung von Thrombomodulin gemäß der vorliegenden Erfindung besteht aus einer wässrigen Injektions-Zubereitung von Thrombomodulin in Form einer nicht-gefrorenen oder nicht-gefriergetrockneten Flüssigkeit, die in Bezug auf die Stabilität bei der Langzeit-Lagerung und die Stabilität bezüglich des Schüttelns überlegen ist, die für die Lagerung und den Transport über einen langen Zeitraum geeignet ist, und die dadurch gekennzeichnet ist, dass die wässrige Injektions-Zubereitung von Thrombomodulin eine im Voraus abgefüllte Spritzen-Zubereitung darstellt, die einen pH-Wert im Bereich von 5 bis 7,0 aufweist, ein wässriges Thrombomodulin in einer wirksamen Menge, einen Puffer-Bestandteil, der eine puffernde Wirkung im pH-Bereich zwischen 5 und 7,0 entfaltet, und ein grenzflächenaktives Mittel enthält, und die aseptisch in einen Spritzen-Behälter abgefüllt ist, so dass jeglicher Gasraum darin im wesentlichen ausgeschlossen wird.

Der Ausdruck „Thrombomodulin", wie er in der Beschreibung dieser Patentanmeldung verwendet wird, bezeichnet ohne eine besondere Beschränkung jede Substanz mit einer Funktion, an Thrombin zu binden, um eine Beschleunigung der Aktivierung von Protein C durch Thrombin zu bewirken. Im Zusammenhang dieser Erfindung bezeichnet der Ausdruck „lösliches Thrombomodulin" eine Substanz, die eine Aktivität als das vorstehend erwähnte „Thrombomodulin" zeigt, und die in Wasser leicht löslich ist, auch wenn ein grenzflächenaktives Mittel fehlt, und die vorzugsweise eine Löslichkeit von zum Beispiel mindestens 1 mg/ml, bevorzugt von mindestens 3 mg/ml, insbesondere bevorzugt von mindestens 6 mg/ml in dem Wasser für die Injektion zeigt. Als bevorzugte Beispiele des löslichen Thrombomodulins können Peptide mit einem Molekulargewicht von 66.000 ± 10.000 Dalton, wie durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese im nicht-reduzierten Zustand bestimmt, welche Peptide eine Funktion der Beschleunigung der Aktivierung von Protein C durch Thrombin zeigen, und die in dem Wasser für die Injektion mit einer Konzentration von mindestens 6 mg/ml löslich sind, aufgezählt werden. Als weitere, bevorzugte, lösliche Thrombomoduline können solche Peptide, die aus Aminosäure-Sequenzen aufgebaut sind, einschließlich der Aminosäure-Sequenz, die aus den Aminosäure-Resten von Position 19 bis Position 29 der SEQ ID Nr. 1 der Sequenzliste zusammengesetzt ist, und die eine Funktion der Beschleunigung der Aktivierung von Protein C durch Thrombin zeigen und in Wasser löslich sind, als Beispiele angeführt werden. Weitere Beispiele von bevorzugten löslichen Thrombomodulinen umfassen jene, die aus Thrombomodulinen bestehen, welche aus einer Aminosäure-Sequenz aufgebaut sind, die aus den Aminosäure-Resten von Position 19 bis zur Position 516 in der SEQ ID Nr. 1 der Sequenzliste zusammengesetzt ist, und die eine Funktion der Beschleunigung der Aktivierung von Protein C durch Thrombin zeigen.

Als ein lösliches Thrombomodulin können darüber hinaus weitere Peptide aufgezählt werden, die aus Aminosäure-Sequenzen aufgebaut sind, einschließlich von mindestens den 4., 5. und 6. Strukturen in der Domäne mit sechs EGF-ähnlichen Strukturen, wie sie der Reihe nach beginnend am Amino-Ende aufgezählt werden, von denen man glaubt, dass sie die kleinste aktive Einheit des Thrombomodulins ausmachen, (zum Beispiel jene Aminosäure-Reste von den Positionen 367 bis 480 der SEQ ID Nr. 1 der Sequenzliste und der SEQ ID Nr. 2 der Sequenzliste für humanes Thrombomodulin). Von diesen sind jene Peptide besonders bevorzugte Thrombomoduline, die durch transformierte Zellen hergestellt werden können, welche durch Transfektion des DNA-Segments, das für die Aminosäure-Sequenz der SEQ ID Nr. 1 der Sequenzliste oder für die SEQ ID Nr. 2 der Sequenzliste codiert, in eine Wirtszelle unter Verwendung eines Vektors erhalten werden. Als ein bevorzugtes Beispiel für Peptide, die aus den transformierten Zellen erhältlich sind, nämlich lösliche Thrombomoduline, können die Peptide aufgezählt werden, welche aus den Aminosäure-Sequenzen aufgebaut sind, die aus den Positionen 19 bis 516 der SEQ ID Nr. 1 der Sequenzliste und der SEQ ID Nr. 2 der Sequenzliste zusammengesetzt sind. Weitere Beispiele können in Übereinstimmung mit der jeweiligen spezifischen Wirtszelle jene Thrombomoduline umfassen, in denen das Signalpeptid als solches im Peptid verbleibt, und die aus den Aminosäure-Sequenzen von der Position Nr. 17 bis zur Position Nr. 516 der SEQ ID Nr. 1 der Sequenzliste und der SEQ ID Nr. 2 der Sequenzliste aufgebaut sind, sowie deren Mischungen. Selbstverständlich weisen diese Peptide ziemlich hohe Löslichkeiten in Wasser auf, die ausreichend sind, um die vorstehend erläuterte, vorgeschriebene Löslichkeit zu erfüllen. Es ist ausreichend, dass diese Peptide lediglich die vorstehend erwähnte Aminosäure-Sequenz aufweisen, und daher erfolgt keine weitere Beschränkung, während es außer Betracht bleibt, ob sie Glycosyl-Ketten aufweisen oder nicht. Es ist auch möglich, lösliche Peptide zu verwenden, die aus menschlichem Urin und dergleichen erhältlich sind. Obwohl die Art, der Ort der Anknüpfung und das Ausmaß der Verknüpfung einer Glycosyl-Kette in dem Peptid gemäß jeder spezifischen Wirtszelle unterschiedlich sein können, wird die Verwendung solcher Peptide dadurch nicht beschränkt. Die Peptide, die aus den Aminosäure-Resten von der Position Nr. 367 bis zur Position Nr. 480 der SEQ ID Nr. 1 der Sequenzliste und der SEQ ID Nr. 2 der Sequenzliste zusammengesetzt sind, besitzen selbst eine hohe Stabilität bezüglich des Schüttelns und können in jedem Fall zu einer bevorzugten wässrigen Zubereitung führen, dennoch ist es so zu verstehen, als sei es nötig, die Stabilität bezüglich des Schüttelns zu erhöhen, indem man für die löslichen Thrombomoduline mit dem vorstehend erwähnten Molekulargewicht, nämlich 66.000 ± 10.000 Da im nicht-reduziertem Zustand, auf ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung zurückgreift, zum Beispiel das lösliche Thrombomodulin, das aus der Aminosäure-Sequenz der Reste von Position Nr. 19 bis zur Position Nr. 516 der SEQ ID Nr. 1 der Sequenzliste aufgebaut ist, das lösliche Thrombomodulin, das aus der Aminosäure-Sequenz der Reste von der Position Nr. 19 bis zur Position Nr. 516 der SEQ ID Nr. 2 der Sequenzliste aufgebaut ist, das lösliche Thrombomodulin, welches durch Transfektion eines DNA-Segments in eine Wirtszelle erhalten wird, das für die in der SEQ ID Nr. 1 der Sequenzliste beschriebene Aminosäure-Sequenz codiert, und das lösliche Thrombomodulin, welches durch Transfektion eines DNA-Segments in eine Wirtszelle erhalten wird, das für die in der SEQ ID Nr. 2 der Sequenzliste beschriebene Aminosäure-Sequenz codiert.

Als Beispiele für eine Wirtszelle können folgende Zellen aufgezählt werden: Eierstöcke des chinesischen Hamsters (chinese hamster ovary, CHO), COS-1, COS-7, VERO (ATCC CCL-81), BHK, MDCK-Zellen, die vom Hund stammen; und AV-12-664-Zellen des Hamsters, sowie Zellen von menschlichem Ursprung, wie zum Beispiel HeLa, WI38 und humane 293 Zellen. Als Vertreter der CHO-Zellen werden DHFR^–-CHO-Zellen stärker bevorzugt.

Im Verlauf der Genmanipulation werden verschiedene Mikroorganismen, wie zum Beispiel Escherichia coli und dergleichen, häufig verwendet, wobei es günstig ist, ein Wirt-Vektor-System zu wählen, das für den spezifischen Zweck geeignet ist, und somit sollte ein geeignetes Vektor-System ebenso für jede der vorstehend erwähnten Wirtszellen ausgewählt werden.

Das Gen eines jeden Thrombomodulins, das im Rahmen eines molekularbiologischen Verfahrens eingebaut werden soll, wurde kloniert, und Beispiele für die Herstellung von Thrombomodulin unter Verwendung eines molekularbiologischen Verfahrens wurden offenbart, zusätzlich zu dem Verfahren der Reinigung zur Gewinnung eines gereinigten Produkts (siehe die japanischen Patent-Veröffentlichungen Kokais Sho 64-6219 A, Hei 2-255699 A, Hei 5-213998 A, Hei 5-310787 A und Hei 7-155176 A, sowie J. Biol. Chem. 264, 10351–10353, 1989). Daher kann das Thrombomodulin, das gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden soll, unter Verwendung der Verfahren, die in den vorstehend zitierten Referenzen beschrieben sind, oder mittels eines Verfahrens, das diesen entspricht, hergestellt werden. Zum Beispiel wird in der japanischen Patent-Veröffentlichung Kokai Sho 64-6219 A ein Escherichia coli K-12 Stamm DH5 (mit der ATCC-Hinterlegungsnr. 67283) offenbart, der das Plasmid psV2TMJ2 aufweist, das die DNA enthält, welche für die gesamte Länge eines Thrombomodulins codiert, während der Anmelder der vorliegenden Erfindung erneut eine Hinterlegung desselben Stammes (Escherichia coli DH5/psV2TMJ2) bei dem Institute of Life Engineering of Agency of Industrial Science and Technology of the Ministry of International Trade and Industry, Nr. 1–3, Higashi 1 Chome, Tsukuba City, Ibaragi Prefecture, Japan, am 19. Juni 1996 vornahm. Die Nummer der Empfangsbestätigung war FERM BP-5570. Unter Verwendung dieser DNA als Ausgangsmaterial, welche für die gesamte Länge des Thrombomodulins codiert, kann das lösliche Thrombomodulin, das gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden soll, durch ein bekanntes molekularbiologisches Verfahren erfahren für Gene erhalten werden.

Obwohl das lösliche Thrombomodulin, das gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden soll, durch ein bekanntes Verfahren oder durch ein Verfahren hergestellt werden kann, welches diesem entspricht, ist es möglich, hierfür auf Referenzen zu verweisen, zum Beispiel auf Yamamoto et al. (japanisches Patent Kokai Sho 64-6219 A, vergleiche die Beispiele) und das japanische Patent Hei 5-213998 A, das vorstehend angegeben ist. Somit ist es möglich, die DNA zu erhalten, welche für die Aminosäure-Sequenz der SEQ ID Nr. 1 der Sequenzliste codiert, indem das Gen des humanen Thrombomodulins durch ein molekularbiologisches Verfahren für Gene verarbeitet wird, und falls notwendig, das Gen zu modifizieren. Eine solche Mutation kann eine ortsspezifische Mutation des Codons umfassen, das für die Aminosäure an der Position 473 der SEQ ID Nr. 1 der Sequenzliste codiert (insbesondere die Base an der Position 1418), um die DNA zu erhalten, welche für die Aminosäure-Sequenz der SEQ ID Nr. 2 der Sequenzliste codiert, in Übereinstimmung mit dem Verfahren, das in „Methods in Enzymology" 100, 468, 1983, Academic Press beschrieben ist. Zum Beispiel wird die vorstehend erwähnte, ortsspezifische Mutation unter Verwendung eines DNA-Fragments, welches die Basensequenz der SEQ ID Nr. 3 der Sequenzliste enthält, und unter Verwendung einer synthetischen DNA für die Mutation, welche die in der SEQ ID Nr. 5 der Sequenzliste gezeigte Basensequenz enthält, durchgeführt, um die DNA zu erhalten, welche für die Aminosäure-Sequenz der SEQ ID Nr. 2 der Sequenzliste codiert. Die so erhaltene DNA kann anschließend zum Beispiel in Eizellen des chinesischen Hamsters integriert werden, um entsprechend transformierte Zellen zu ergeben, aus denen passend ausgewählte Zellen kultiviert werden und, ausgehend von der Kulturmischung derselben, das lösliche Thrombomodulin, das durch ein bekanntes Verfahren gereinigt wird, erhalten wird. Wie vorstehend erwähnt ist es vorzuziehen, dass die DNA, welche für die Aminosäure-Sequenz der SEQ ID Nr. 1 der Sequenzliste codiert, in die Wirtszelle transfiziert wird. Das Verfahren zur Herstellung des löslichen Thrombomodulins, das gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden soll, soll nicht auf die vorstehend beschriebenen Verfahren beschränkt werden, sondern viele Alternativen können möglich sein, zum Beispiel einschließlich eines Zurückgreifens auf ein Verfahren, bei dem das Thrombomodulin oder das lösliche Thrombomodulin aus einem Gewebe, aus einer Mischung einer Gewebekultur, aus menschlichem Urin und dergleichen mit einer nachfolgenden Reinigung und, falls nötig, mit einer weiteren Behandlung durch ein proteolytisches Enzym extrahiert werden.

Die Isolierung und Reinigung des löslichen Thrombomodulins aus dern Überstand oder von der Kulturmischung nach dem vorstehenden Verfahren kann in einer bekannten Weise durchgeführt werden (siehe zum Beispiel „Fundamental Experimental Methods with Proteins, Enzymes", Ed. Buichi Horio). Die Verwendung einer Ionenaustausch-Chromatographie, die auf der Wechselwirkung zwischen dem Thrombomodulin und einem Träger einer stationären chromatographischen Phase beruht, auf dem eine funktionelle Gruppe mit einer ionischen Ladung angeordnet ist, die umgekehrt zu der des Thrombomodulins ist, ist ebenso vorzuziehen. Ebenso kann eine Affinitäts-Chromatographie, die auf der spezifischen Affinität gegenüber dem Thrombomodulin beruht, in bevorzugter Weise als Beispiel genannt werden. Als ein bevorzugtes Beispiel eines Adsorptionsmittels, das verwendet werden soll, können Antikörper gegen Thrombomodulin und gegen Thrombin aufgezählt werden, welche einen Liganden für das Thrombomodulin darstellen können. Als Beispiele für diese Antikörper können jene Antikörper gegen Thrombomodulin angeführt werden, die in der Lage sind, eine entsprechende Funktion oder ein entsprechendes Epitop zu erkennen, deren Beispiele solche Antikörper umfassen, die zum Beispiel in der japanischen Patent-Veröffentlichung Hei-42920 B, dem japanischen Patent Kokai Sho 64-45398 A und Hei 6-205692 A offenbart sind. Darüber hinaus wurden auch eine Gelfiltrations-Chromatographie und ein Ultrafiltrations-Verfahren in Bezug auf die molekulare Größe des Thrombomodulins verwirklicht. Darüber hinaus kann eine hydrophobe Chromatographie verwendet werden, die auf einer hydrophoben Wechselwirkung zwischen dem Träger einer stationären Phase, auf der eine hydrophobe Gruppe gebunden ist, und der hydrophoben Stelle des Thrombomodulins beruht. Die vorstehend erwähnten Verfahren können in einer geeigneten Kombination eingesetzt werden. Der Grad der Reinigung des löslichen Thrombomodulins kann in geeigneter Weise in Übereinstimmung mit der jeweiligen spezifischen Anwendung ausgewählt werden, obwohl es vorzuziehen ist, das Protein bis zu einem solchen Grad zu reinigen, dass eine einzelne Bande erhalten wird, zum Beispiel in der Gelelektrophorese, vorzugsweise SDS-PAGE, oder bis ein einzelner Peak, zum Beispiel in der Gelpermeations-HPLC oder in der HPLC mit reversen Phasen, erhalten wird.

Um konkrete Beispiele für die Verfahren der Reinigung zu benennen, kann ein Verfahren eingesetzt werden, bei dem die Reinigung dadurch bewirkt wird, dass die Aktivität des Thrombomodulins als ein Parameter berücksichtigt wird, wobei zum Beispiel der Überstand der Kulturmischung mit einer Ionenaustauscher-Säule Q-Sepharose FF behandelt wird, um Fraktionen zu sammeln, die eine Aktivität des Thrombomodulins zeigen, welche anschließend einer weiteren Reinigung durch Diisopropylphosphorylthrombin-Agarose (DIP-TB) unterzogen werden, gefolgt von einer Sammlung derjenigen Fraktionen, die eine höhere Aktivität von Thrombomodulin zeigen, welche anschließend der Gelpermeations-Chromatographie unterzogen werden, um eine Sammlung der Thrombomodulin-aktiven Fraktionen durchzuführen, und um ein reines, lösliches Thrombomodulin-Produkt zu erhalten (siehe Gomi et al., Blood 75, 1396–1399, 1990). Als Parameter für die Aktivität des Thrombomodulins kann zum Beispiel die Aktivität des Thrombomodulins verwendet werden, die Aktivierung von Protein C zu beschleunigen. Als ein Beispiel für ein weiteres Reinigungsverfahren kann das folgende Verfahren ebenso angegeben werden:

Das Thrombomodulin wird einer Ionenaustausch-Chromatographie unter Verwendung eines in geeigneter Weise ausgewählten Ionenaustauscher-Harzes unterzogen, das eine bessere Adsorptions-Leistung in Bezug auf Thrombomodulin aufweist. Ein besonders bevorzugtes Verfahren verwendet Q-Sepharose FF, welche mit einer Pufferlösung von 0,02 M Tris-HCl (pH 7,4) äquilibriert ist, die 0,18 M NaCl enthält. Das zurückgehaltene Thrombomodulin kann nach einem geeigneten Waschschritt eluiert werden, indem zum Beispiel eine Pufferlösung von 0,02 M Tris-HCl (pH 7,4) verwendet wird, die 0,3 M NaCl enthält, um ein Rohprodukt eines Thrombomodulins zu erhalten.

Anschließend kann dieses Produkt einem Reinigungsschritt unterzogen werden, zum Beispiel einer Affinitäts-Chromatographie unter Verwendung eines Harzes, auf dem eine Substanz mit einer spezifischen Affinität gegenüber Thrombomodulin gebunden ist. Als bevorzugte Beispiele können eine Säule mit DIP-Thrombin-Agarose und eine Säule mit gegen Thrombomodulin gerichteten, monoklonalen Antikörpern aufgezählt werden. Die Säule mit DIP-Thrombin-Agarose kann vorausgehend behandelt werden, indem sie zum Beispiel mit einer Pufferlösung von 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), die 100 mM NaCl und 0,5 mM Calciumchlorid enthält, äquilibriert wird, worauf die Säule mit dem vorstehend erwähnten Rohprodukt beladen wird, gefolgt von einem geeigneten Waschschritt mit anschließender Elution, welche zum Beispiel mit einer Pufferlösung von 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), die 1,0 M NaCl und 0,5 mM Calciumchlorid enthält, durchgeführt wird, um ein gereinigtes Produkt eines löslichen Thrombomodulins zu erhalten. Im Fall der Säule mit einem gegen Thrombomodulin gerichteten, monoklonalen Antikörper wird die Säule mit Sepharose 4B (von der Fa. Pharmacia) befüllt, welche in einer solchen Weise behandelt wurde, dass die Sepharose-Teilchen, die vorausgehend mit CNBr aktiviert wurden, mit einer Pufferlösung von 0,1 M NaHCO₃ (pH 8,3), die 0,5 M NaCl enthält, in Kontakt gebracht wurden, und ein gegen Thrombomodulin gerichteter, monoklonaler Antikörper, der darin gelöst ist, zur Bindung dieses gegen Thrombomodulin gerichteten, monoklonalen Antikörpers an die Sepharose-Teilchen veranlasst wird. Anschließend wird die Säule im Voraus zum Beispiel mit einer Pufferlösung von 20 mM Phosphat (pH 7,3), die 1,0 M NaCl enthält, äquilibriert und anschließend in geeigneter Weise gewaschen, ehe das zurückgehaltene Thrombomodulin zum Beispiel mit einer Pufferlösung von 100 mM Glycin-HCl (pH 3,0), die 0,3 M NaCl enthält, eluiert wird.

Die so erhaltene Lösung des gereinigten löslichen Thrombomodulins wird anschließend auf eine Säule aufgetragen, die mit einem Kationenaustauscher-Harz gefüllt ist, vorzugsweise einem stark sauren Kationenaustauscher-Harz, wie zum Beispiel SP-Sepharose FF (von der Fa. Pharmacia), welche im Allgemeinen unter Bedingungen von zum Beispiel einer spezifischen Leitfähigkeit von 25–34 mS/cm und einem pH-Wert von 3–4 äquilibriert wurde, und welche dennoch in Übereinstimmung mit der Salzkonzentration, der Bestimmungsgenauigkeit des pH-Werts und der Art des Moleküls variabel ist. Der vorstehend erwähnte, spezifische Leitfähigkeits-Wert kann stärker bevorzugt in einem Bereich von 30 ± 3 mS/cm liegen, und der pH-Wert kann vorzugsweise in einem Bereich von 3,0 bis 3,7, stärker bevorzugt in einem Bereich von 3,5 ± 0,1 liegen. Obwohl es bevorzugt ist, eine Pufferlösung zu verwenden, die darin ein Salz in einer geeigneten Konzentration gelöst enthält, kann unter vielen verschiedenen Bedingungen eine Pufferlösung von zum Beispiel 50–150 mM mit einem pH-Wert von 3–4, die 0,25–0,32 M, bevorzugt 0,3 ± 0,1 M NaCl enthält, als Beispiel aufgezählt werden. Obwohl es keine Begrenzung für die Art der Pufferlösung gibt, können die Puffersubstanzen zum Beispiel unter anderem aus Glycin-HCl, Zitronensäure-Dinatriumcitrat, Natriumcitrat und Essigsäure ausgewählt werden. Noch konkreter kann eine Pufferlösung von 100 mM Glycin-HCl (pH 3,5), die 300 mM NaCl enthält, als Beispiel genannt werden. Die spezifische Leitfähigkeit kann leicht unter Verwendung eines tragbaren Messgeräts für die Leitfähigkeit (Modell der Reihe P: CM-11P, ein Gerät der Fa. Toa Electronics Ltd., mit einer Standardumsatz-Temperatur von 25 °C) bestimmt werden.

Die wie vorstehend hergestellte Säule wird anschließend gestartet, indem zum Beispiel eine Pufferlösung von 100 mM Glycin-HCl (pH 3,5, spezifische Leitfähigkeit 31 mS/cm), die 300 mM NaCl enthält, hindurchgeleitet wird, worauf eine Eluentenfraktion durch Sammeln des hindurchgelaufenen Eluenten von Beginn des Anstiegs des Absorptionspeaks bei 280 nm von der Absorption für die lediglich leer hindurchgelaufene Fraktion bis zum Ende des Abfalls der Absorption erhalten wird, welche Fraktionen anschließend mit einer geeigneten Pufferlösung neutralisiert werden, wodurch ein hochgradig reines Produkt von löslichem Thrombomodulin erhalten werden kann, das bis zu einem solchen Grad gereinigt ist, dass es im Wesentlichen keinen Gehalt an Substanzen aufweist, die vom Serum oder vom Antikörper stammen. Wie nachfolgend beschrieben, wurde es bestätigt, dass die Entfernung der Substanzen, die aus dem Serum und dem Antikörper stammen, wirksam mit besserer Reproduzierbarkeit durch Verwendung dieser Säule durchgeführt werden kann. Selbstverständlich können sie in geeigneter Weise mittels einer Ultrafiltration entfernt werden.

Darüber hinaus ist es ebenso möglich, den Austausch der Pufferlösung mittels einer Gelfiltration durchzuführen. Zum Beispiel wird eine Säule mit Sephacryl S-300 oder S-200, die mit einer Pufferlösung von 20 mM Phosphat (pH 7,3), die 50 mM NaCl enthält, äquilibriert wurde, mit einem hochgradig reinen Produkt beladen, das durch Ultrafiltration konzentriert wurde, und die Säule wird einer Entwicklung unterzogen, indem sie mit einer Pufferlösung von 20 mM Phosphat (pH 7,3), die 50 mM NaCl enthält, fraktioniert wird, gefolgt vom Sammeln der Fraktionen, welche eine Aktivität für die Beschleunigung der Aktivierung von Protein C durch Thrombin zeigen, wenn sie in Bezug auf eine solche Aktivität überprüft werden, und anschließend wird der Austausch der Pufferlösung durchgeführt, wodurch ein hochgradig reines Produkt erhalten werden kann.

In vielen Reinigungsverfahren sollte die wässrige Injektions-Zubereitung, die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden soll, erhalten werden, ohne dass irgendein besonderes Verfahren, wie zum Beispiel die Zugabe und die Einstellung, notwendig werden würde, wenn eine Lösung, die den Pufferbestandteil (die Pufferbestandteile) und ein grenzflächenaktives Mittel (grenzflächenaktive Mittel) enthält, welche die endgültige Einstellung der Bedingungen des pH-Wertes und dergleichen erlauben, die jenen Bedingungen entsprechen, welche gemäß der vorliegenden Erfindung vorgeschrieben werden, verwendet werden kann. Im Allgemeinen ist jedoch die Durchführung der Zugabe von notwendigen Bestandteilen und dergleichen zu der erhaltenen Lösung des löslichen Thrombomodulins einfach und bequem, und sie ist bevorzugt.

In Bezug auf den Pufferbestandteil (die Pufferbestandteile), die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden sollen, gibt es keine besondere Beschränkung, und ein beliebiger Puffer, der die Einstellung des pH-Werts auf einen Wert im Bereich von 5 bis 7,0 ermöglicht, und der eine puffernde Wirkung innerhalb dieses Bereichs entfaltet, kann verwendet werden. Darüber hinaus liegt ein bevorzugter Bereich des pH-Werts bei 5,5–6,5. Zum Beispiel können eine oder mehrere Arten von Puffersubstanzen, die aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus Phosphorsäure, Carbonsäuren und/oder den wasserlöslichen Salzen derselben besteht, jeweils in einer wirksamen Menge verwendet werden. Als Carbonsäuren und/oder wasserlösliche Salze derselben können zum Beispiel aufgezählt werden: eine oder mehrere Verbindungen, die aus der Gruppe ausgewählt werden, welche aus Essigsäure, Propionsäure, Buttersäure, Valeriansäure, Malonsäure, Bernsteinsäure, Glutarsäure, Weinsäure, Fumarsäure, Äpfelsäure und/oder wasserlöslichen Salzen derselben besteht, wobei eine besondere Bevorzugung für Phosphorsäure, Essigsäure und/oder wasserlösliche Salze derselben gegeben ist. Es gibt keine besondere Beschränkung in Bezug auf wasserlösliche Salze, sofern sie pharmazeutisch erlaubt sind, und sie umfassen zum Beispiel Natrium- und Kaliumsalze.

In Bezug auf den Behälter, der gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden soll, gibt es keine besondere Beschränkung, sofern das Material des Behälters und die Anordnung desselben für eine aseptische Befüllung geeignet sind. Als Beispiele können Glasspritzen (die mit einer Gummikappe und einem Gummistopfen ausgestattet sind, um eine aseptische Befüllung zu ermöglichen), ein Glasgefäß (mit einem Stopfen) und eine Glasampulle genannt werden, sowie jene, die aus plastischen Harzen hergestellt sind. Eine am meisten bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besteht in einer im Voraus abgefüllten Spritzen-Zubereitung, die in einen Spritzenbehälter abgefüllt ist. Eine im Voraus abgefüllte Spritzen-Zubereitung wird hergestellt, indem eine wässrige Injektionslösung im Voraus in einen Spritzenbehälter gefüllt wird, und sie kann in diesem Zustand als solche gelagert und transportiert werden, wobei der Spritzenbehälter mit einer Injektionsnadel ausgestattet sein kann oder nicht. Wenn er keine Injektionsnadel aufweist, wird eine Injektionsnadel üblicherweise bei der Injektion der Flüssigkeit aufgesetzt. Man kann Überlegungen anstellen, die Präparation durch Penetration durch die Haut zu verabreichen, indem ein hoher Druck auf die wässrige Zubereitung in der Spritze selbst ausgeübt wird, ohne Verwendung einer Injektionsnadel. In diesem Fall ist der Auslaß für die Injektion der wässrigen Zubereitung auf der Vorderseite bevorzugt in Form einer engen Öffnung angeordnet. Als Mittel zur Steigerung des inneren Drucks können zum Beispiel eine Druckkraft durch ein komprimiertes Gas (Stickstoff, Helium, Kohlendioxid und dergleichen) und durch eine Feder verwendet werden.

Bei der Auswahl des Pufferbestandteils (der Pufferbestandteile), die eine puffernde Wirkung in dem vorstehend erwähnten pH-Bereich entfalten, kann ein solcher Pufferbestandteil (solche Pufferbestandteile) und eine Menge derselben bevorzugt so ausgewählt werden, dass der pH-Wert der eingefüllten Zubereitung nicht über ein Ausmaß von ± 0,3 verändert wird, bevor und nachdem der Behälter, der für die Füllung bestimmt ist, mit dem zu untersuchenden Pufferbestandteil (den Pufferbestandteilen) befüllt wird, und der so befüllte Behälter wird einer Wärmebehandlung bei 50 °C für 96 Stunden unterzogen, wie in dem nachfolgend beschriebenen Untersuchungsverfahren 1 vorgeschrieben, obwohl der Zustand durch die Art des Pufferbestandteils, durch seine Konzentration und durch das jeweilige, spezifische, zu befüllende Gefäß beeinflusst werden kann. Für übliche Pufferbestandteile, wie sie vorstehend beispielhaft genannt sind, kann die zu verwendende Konzentration folglich in einem Bereich von im Allgemeinen mindestens 0,01 mM, bevorzugt von mindestens 1 mM, im Allgemeinen bis zu höchstens 1000 mM, vorzugsweise höchstens 200 mM, insbesondere bevorzugt höchstens 25 mM oder höchstens 20 mM liegen. Es ist bevorzugt, dass der Glasbehälter im Voraus einer Schwefelbehandlung unterzogen wird. Die Glasspritze kann mit einer Silikonbeschichtung auf ihrer inneren Oberfläche behandelt werden.

In einer Ausführungsform der Zubereitung der Pufferlösung, die auf Phosphat beruht, für die wässrige Injektions-Zubereitung gemäß der vorliegenden Erfindung wurde eine wässrige Lösung von Natriumdihydrogenphosphat (NaH₂PO₄ oder sein 12-Hydrat) mit einer vorherbestimmten Konzentration sowie eine wässrige Lösung von Dinatriumhydrogenphosphat (Na₂HPO₄ oder sein Dihydrat) ebenso mit einer vorherbestimmten Konzentration miteinander in einer definierten Menge vermischt, um den pH-Wert auf den beabsichtigten Wert einzustellen. In alternativer Weise ist es ebenso möglich, eine wässrige Lösung von Natriumhydroxid tropfenweise zu einer wässrigen Lösung von Natriumdihydrogenphosphat von einer definierten Konzentration zu geben, um den pH-Wert der erhaltenen Lösung auf den beabsichtigten Wert einzustellen. Es ist ebenso möglich, verdünnte Chlorwasserstoffsäure oder verdünnte Phosphorsäure tropfenweise zuzugeben, um eine genaue Einstellung des pH-Werts zu bewirken. Im Falle einer Pufferlösung aus dem Salz einer Carbonsäure, die typischerweise durch einen Acetatpuffer repräsentiert wird, werden eine wässrige Lösung von Essigsäure mit einer vorherbestimmten Konzentration und eine wässrige Lösung von Natriumacetat ebenfalls mit einer vorherbestimmten Konzentration miteinander in einer definierten Menge vermischt, um den pH-Wert auf den beabsichtigten Wert einzustellen. In alternativer Weise ist es ebenso möglich, eine wässrige Lösung von Natriumhydroxid mit einer definierten Konzentration tropfenweise zu einer wässrigen Lösung von Essigsäure mit einer definierten Konzentration zu geben, um den pH-Wert auf den beabsichtigten Wert einzustellen. Es ist ebenso möglich, die tropfenweise Zugabe einer verdünnten Essigsäure zu verwenden, um eine genaue Einstellung des pH-Werts zu bewirken.

Die wässrige Injektions-Zubereitung gemäß der vorliegenden Erfindung besitzt üblicherweise einen pH-Wert im Bereich von 5,0 bis 7,0, vorzugsweise im Bereich von von 5,5 bis 6,5. Insbesondere bevorzugt besitzt sie einen pH-Wert von etwa 6,0. Ein bevorzugter pH-Bereich liegt zum Beispiel bei 5,5–6,0.

Wenn die Konzentration einer Phosphat-Pufferlösung innerhalb eines breiten Bereichs von 0,2 bis 200 mM schwankt, wurde ein großer Einfluss auf die Abnahme der Aktivität der wässrigen Thrombomodulin-Zubereitung bei einem pH-Wert von 7,3 beobachtet, wobei die nachgewiesene Abnahme bezüglich der Aktivität umso größer war, je höher die Konzentration der Pufferlösung war. Zum Beispiel wird die verbleibende Aktivität der Zubereitung umso mehr bei einer Konzentration von 200 mM herabgesetzt. Im Falle der Phosphat-Pufferlösung kann jedoch eine günstige Eigenschaft in Bezug auf die Hitzestabilität (die Langzeit-Stabilität) der wässrigen Thrombomodulin-Zubereitung erhalten werden, wenn eine strenge Kontrolle des pH-Werts innerhalb des Bereichs von 5–7,0 erfolgt. Es ist vorzuziehen, den pH-Wert auf 5,5–6,5, insbesondere auf etwa 6,0 einzustellen. Wenn die Einstellung des pH-Werts auf einen Wert so nahe wie möglich bei 7,0 verwirklicht wird, kann ein Einfluss auf die Hitzestabilität der wässrigen Thrombomodulin-Zubereitung hervorgerufen werden, auch durch eine geringe Schwankung des pH-Wertes, und somit sollte eine solche pH-Einstellung vorzugsweise vermieden werden.

Im Falle einer Acetat-Pufferlösung wurde kein Einfluss der Konzentration der Pufferlösung auf die Eigenschaft der Thrombomodulin-Zubereitung gefunden, auch wenn die Konzentration der Pufferlösung innerhalb eines großen Bereichs von 0,2 bis 200 mM schwankte. In einer Pufferlösung in einer Kombination von Phosphat und Acetat wird eine günstige Eigenschaft in Bezug auf die Hitzestabilität in einem pH-Bereich von 5,0 bis 7,0 erzielt.

In einer Pufferlösung eines Salzes einer Carbonsäure, das von Acetat verschieden ist, wird eine Hitzestabilität, die mit derjenigen der Acetat-Pufferlösung vergleichbar ist, in demselben Konzentrations-Bereich und in demselben pH-Bereich wie jene der Acetat-Pufferlösung verwirklicht. Wenn ein Bestandteil eines Acetatpuffers und/oder ein Bestandteil eines Puffers aus dem Salz einer Carbonsäure zu einer Phosphat-Pufferlösung gegeben wird, wird eine vergleichbare Hitzestabilität erzielt.

Als grenzflächenaktives Mittel, das gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden soll, ist ein nicht-ionisches grenzflächenaktives Mittel bevorzugt, zum Beispiel Polysorbate, wie z.B Polysorbat 80 (mit dem Handelsnamen „Tween 80") und Polysorbat 20 (mit dem Handelsnamen „Tween 20"); polyoxyethylierte, hydrierte Rhizinusöle, wie zum Beispiel polyoxyethyliertes, hydriertes Rhizinusöl 60 (mit dem Handelsnamen „HCO-60" und dem Handelsnamen „Cremophor RH 60") und polyoxyethyliertes, hydriertes Rhizinusöl 50 (mit den Handelsnamen „HCO-50" und „Cremophor RH 50"), polyoxyethylierte Rhizinusöle (mit den Handelsnamen „CO-60TX", „CO-50TX" und „Cremophor EL", und dergleichen), Polymere aus Ethylenoxid und Propylenoxid, wie zum Beispiel Polyoxyethylen(160)-Polyoxypropylen(30)-Glykol (mit dem Handelsnamen „Pluronic F68" und dergleichen) und Sorbitan-Sesquioleat. Es ist möglich, mindestens eines der grenzflächenaktiven Mittel aus der vorstehend angegebenen Gruppe auszuwählen, mit der Möglichkeit, sie in Kombination zu verwenden.

Wie im Falle der Stabilität bezüglich des Schüttelns kann eine die Trübung verhindernde Wirkung durch die Zugabe von mindestens 0,01 Gew.-% Polysorbat 80 (mit dem Handelsnamen „Tween 80") und von mindestens 0,1 Gew.-% polyoxyethyliertem, hydrierten Rhizinusöl (mit dem Handelsnamen „HCO-60") und Polyoxyethylen(160)-Polyoxypropylen(30)-Glykol (mit dem Handelsnamen „Pluronic F68") erzielt werden. Das Polysorbat 80 (Handelsname „Tween 80") ergibt eine die Trübung verhindernde Wirkung bei einer Zugabe von nur 0,01 Gew.-% und ist besonders bevorzugt.

In Bezug auf die Konzentration des grenzflächenaktiven Mittels, das gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden soll, können üblicherweise eine Konzentration von vorzugsweise mindestens 0,001 Gew.-%, bevorzugt von mindestens 0,01 Gew.-%, jedoch eine Konzentration von nicht mehr als 1 Gew.-%, bevorzugt von nicht mehr als 0,1 Gew.-% als Beispiele genannt werden.

Die wässrige Thrombomodulin-Zubereitung gemäß der vorliegenden Erfindung kann über die vorstehend genannten konstituierenden Bestandteile hinaus weitere Zusatzstoffe, einschließlich isotonischer Mittel (wie zum Beispiel Natriumchlorid und dergleichen) und Konservierungsmittel (wie zum Beispiel p-Hydroxybenzoesäureester und dergleichen) als dritte Bestandteile enthalten.

Es gibt keine besondere Beschränkung, was die praktische Art der Verarbeitung der zusätzlichen Bestandteile in der wässrigen Thrombomodulin-Zubereitung betrifft, wie vorstehend angegeben, und es kann ein solches Verfahren verwendet werden, bei dem sie unmittelbar zu der wässrigen Lösung gegeben werden, die das Thrombomodulin enthält, oder sie können im Voraus in Wasser, in dem Wasser für die Injektion oder in einer geeigneten Pufferlösung gelöst werden, und die erhaltene Lösung wird zu der Lösung des Thrombomodulins gegeben.

In einer bevorzugten Ausführungsform bei der Herstellung der wässrigen Thrombomodulin-Zubereitung wird zum Beispiel eine Spritze, eine Ampulle oder ein Fläschchen mit einer Lösung des Thrombomodulins in Wasser, in dem Wasser für die Injektion oder in einer geeigneten Pufferlösung bei einer Konzentration von 0,05 mg oder mehr, bevorzugt von 0,1 mg oder mehr, insbesondere bevorzugt von 1 mg oder mehr pro 1 ml befüllt. Obwohl die obere Grenze für den Thrombomodulin-Gehalt nicht in besonderer Weise begrenzt ist, kann eine Konzentration des Thrombomodulins zum Beispiel von nicht mehr als 15 mg, bevorzugt von nicht mehr als 10 mg, insbesondere bevorzugt von nicht mehr als 6 mg pro 1 ml als Beispiel genannt werden. Eine Menge von zum Beispiel 0,3–10 ml einer wässrigen Lösung, die das Thrombomodulin bei der vorstehenden Konzentration sowie weitere zusätzliche Bestandteile enthält, wird aseptisch durch ein herkömmliches Verfahren in den vorstehend erwähnten Behälter gefüllt, wodurch ein pharmazeutisches Produkt einer wässrigen Injektions-Zubereitung des Thrombomodulins erhalten werden kann. Zur Sterilisierung des Behälters können gemäß der gewöhnlichen Praxis, zum Beispiel das Erhitzen im trockenen Zustand, das Autoklavieren und die Sterilisation mit &ggr;-Strahlung verwendet werden. Zum Beispiel können eine Bedingung von mehr als 250 °C für mehr als 30 Minuten bei dem Erhitzen im trockenen Zustand, von mehr als 121 °C für mehr als 20 Minuten beim Autoklavieren, und eine Bestrahlung mit &ggr;-Strahlen bei einer Dosis von 20–60 kGy (kilograys) verwendet werden. Für die Sterilisation wird das Erhitzen im trockenen Zustand üblicherweise für eine Ampulle und ein Fläschchen verwendet, die aus Glas hergestellt sind, und das Autoklavieren wird für den Gummistopfen des Fläschchens verwendet. Zur Sterilisierung der Spritze wird üblicherweise eine Sterilisation mit &ggr;-Strahlung verwendet, obwohl das Autoklavieren ebenso möglich ist. Die wässrige Lösung des Thrombomodulins, die in den Behälter gefüllt werden soll, wird im Allgemeinen vorzugsweise durch ein Sterilfilter mit der Porengröße von 0,22 oder 0,2 &mgr;m geleitet. Die wässrige Injektions-Zubereitung des Thrombomodulins gemäß der vorliegenden Erfindung wird durch aseptisches Befüllen eines sterilisierten Behälters mit der aseptisch filtrierten wässrigen Lösung des Thrombomodulins hergestellt. Es ist ebenso vorzuziehen, dass die so erhaltene wässrige Injektions-Zubereitung von Thrombomodulin in einem Päckchen oder in einem Karton verpackt wird.

Die wässrige Injektions-Zubereitung von Thrombomodulin gemäß der vorliegenden Erfindung kann vorzugsweise als eine im Voraus abgefüllte Spritzen-Zubereitung, wie vorstehend angegeben, vorliegen, obwohl sie in einer Ampulle oder in einem Fläschchen gelagert werden kann. Im Falle der Herstellung in einer Ampulle ist es vorzuziehen, eine Ampulle zu verwenden, die einer Behandlung mit Schwefel unterzogen wurde. Eine mit Schwefel behandelte Ampulle wird erhalten, indem das Ampullengefäß mit SO₂-Gas in Kontakt gebracht wird, oder bevorzugt dadurch, dass eine wässrige Lösung von Ammoniumsulfat auf die innere Wand des Ampullengefäßes gesprüht wird, und das so besprühte Gefäß einer Hitzebehandlung unterzogen wird. Als Beispiel kann üblicherweise ein Sprüh-Verfahren mit einer Lösung von 1–10 % Ammoniumsulfat mit einer anschließenden Hitzebehandlung bei einer Temperatur von 630–700 °C erwähnt werden. Im Allgemeinen wird das so behandelte Ampullengefäß vor einer weiteren Behandlung, zum Beispiel auf einer Waschmaschine für Ampullen oder dergleichen, durch eine Ultraschallbehandlung im feuchten Zustand mit einem anschließenden Waschschritt mit Wasser behandelt, gefolgt von einer Sterilisation durch Erhitzen im trockenen Zustand bei einer Temperatur von 300–350 °C für einige Minuten, ehe der Behälter mit der Injektions-Zubereitung befüllt wird.

Nunmehr wird die Beschreibung auf das Verfahren der zweiten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung gerichtet, nämlich das Verfahren, bei dem die wässrige Injektions-Zubereitung von Thrombomodulin, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie als eine wässrige Lösung mit einem pH-Wert im Bereich von 5 bis 7,0 hergestellt wird, und dass sie ein lösliches Thrombomodulin in einer wirksamen Menge und einen Pufferbestandteil enthält, der eine puffernde Wirkung in einem pH-Bereich zwischen 5 und 7,0 entfaltet, und dass sie aus einer im Voraus abgefüllten Spritzen-Zubereitung besteht, die aseptisch in ein Spritzengefäß abgefüllt wird, so dass jeglicher Gasraum darin im Wesentlichen ausgeschlossen wird, in einer flüssigen Form über einen langen Zeitraum gelagert und transportiert wird.

Die Definitionen für das lösliche Thrombomodulin, den Pufferbestandteil und die wässrige Injektions-Zubereitung von Thrombomodulin sind dieselben wie vorstehend beschrieben.

In Bezug auf das Spritzengefäß, das gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden soll, kann die Verwendung einer im Handel erhältlichen Injektionsspritze bevorzugt sein, und im Allgemeinen kann ein Spritzengefäß für eine im Voraus abgefüllte Spritze mit einem Innendurchmesser von etwa 8,6 mm, etwa 6,3 mm oder etwa 4,6 mm als Beispiel genannt werden. Obwohl der Durchmesser in Übereinstimmung mit der Füllmenge der wässrigen Lösung des Thrombomodulins ausgewählt wird, ist eine solche Spritze mit einem Innendurchmesser von etwa 4,6 mm am meisten bevorzugt in Bezug auf die Stabilität bezüglich des Schüttelns, obwohl das Spritzengefäß mit einem Innendurchmesser von etwa 6,3 mm eine ausreichende Anwendung ermöglicht. In Bezug auf das Spritzengefäß mit einem Innendurchmesser von etwa 8,6 mm ist es notwendig, den Anteil des Gasraumes in dem Gefäß, wenn es mit der wässrigen Zubereitung befüllt wird, bei höchstens 50 Vol.-% zu halten. Somit kann das Spritzengefäß mit einem Innendurchmesser von etwa 8,6 mm seine Stabilität bezüglich des Schüttelns gewährleisten, sofern der Anteil des Gasraumes darin, nachdem das Spritzengefäß mit der wässrigen Zubereitung befüllt wurde, bei höchstens 50 Vol.-% gehalten wird.

Die wässrige Injektions-Zubereitung von Thrombomodulin kann aufgrund der Oberflächenspannung derselben nicht, entsprechend der spezifischen Gestalt und der inneren Größe des Gefäßes, im Wesentlichen dem Schütteln unterzogen werden. Im Zusammenhang dieser Beschreibung bezeichnet der Begriff „Bereich, der dem Schütteln unterzogen wird" einen Bereich des Gefäßes, an dem die wässrige Injektions-Zubereitung von Thrombomodulin, die in dem Gefäß vorhanden ist, in eine erhebliche Schüttelbewegung gebracht werden kann, wenn das Gefäß unter den Bedingungen einer Amplitude von 5 cm und einer Frequenz von 180 UpM bei einer Temperatur von 25 °C geschüttelt wird. Der Begriff „Anteil des Gasraumes" in dem Gefäß ist ein Wert, der durch Teilung der Volumendifferenz, die aus der Subtraktion des Volumens der wässrigen Injektions-Zubereitung des Thrombomodulins, die in dem Bereich vorhanden ist, der dem Schütteln unterzogen wird, von dem Volumen des Bereichs, der dem Schütteln unterzogen wird, berechnet wird, durch das Volumen des Bereichs des Gefäßes, der dem Schütteln unterzogen wird, berechnet wird, ausgedrückt als prozentualer Wert. Die Menge der wässrigen Injektions-Zubereitung des Thrombomodulins, die in dem Bereich vorhanden ist, der dem Schütteln unterzogen wird, nämlich die bewegliche Menge der wässrigen Injektions-Zubereitung in dem Gefäß, kann zum Beispiel durch Wiederholung eines Experiments zur Bestimmung und Messung der Menge der wässrigen Zubereitung in dem Gefäß bestätigt werden, welche sich in dem Gefäß abwärts bewegt hat, nachdem das Gefäß, das mit der wässrigen Injektions-Zubereitung von Thrombomodulin befüllt wurde, für 5 Sekunden in einem solchen Zustand gehalten wurde, dass die senkrechte Achse und die waagerechten Achsen des Gefäßes festgehalten wurden, nachdem es für 2 Minuten unter den vorstehend angegebenen Bedingungen geschüttelt wurde. Dadurch ist es auch möglich, gleichzeitig den Bereich, der dem Schütteln unterzogen wird, zu bestätigen, so dass dessen Volumen bestimmt werden kann. Falls eine Spritze mit einer einfachen Form verwendet wird, besteht der dem Schütteln unterzogene Bereich selbstverständlich aus dem Raum, der von der Spritze und dem Stopfen (und der Kappe) selbst begrenzt wird. Im Falle einer Spritze mit einem Innendurchmesser von etwa 4,6 mm tritt kein erhebliches Schütteln auf, und es ist unnötig, den Anteil des Gasraumes in Betracht zu ziehen.

Üblicherweise wird das Spritzengefäß, das mit einer Kappe abgedichtet wird, mit der wässrigen Injektions-Zubereitung von Thrombomodulin in einer gewöhnlichen Art befüllt, und anschließend mit einem Stopfen verschlossen. Für das Einpassen des Stopfens in das Spritzengefäß kann zum Beispiel das Verfahren des Einpassens des Stopfens mittels Vakuum und die Verwendung eines Luftdurchlasses (oder einer Manschette) angewendet werden.

Wenn das Spritzengefäß durch das Vakuum-Einpassen des Stopfens abgedichtet wird, kann der Anteil des Gasraums verhältnismäßig leicht auf einen Wert von zum Beispiel nicht mehr als 15 Vol.-% eingestellt werden. Daher ist unter dem Begriff „dass jeglicher Gasraum im Wesentlichen ausgeschlossen ist", der gemäß der vorliegenden Erfindung als eine bevorzugte Ausführungsform vorgeschrieben ist, so zu verstehen, dass üblicherweise der Anteil des Gasraumes nicht mehr als 15 Vol.-% beträgt. Es ist ebenso bevorzugt, dass der Anteil des Gasraumes nicht mehr als 10 Vol.-% beträgt, stärker bevorzugt ist es, dass er nicht mehr als 5 Vol.-% beträgt. Bei einem Spritzengefäß für eine im Voraus abgefüllte Spritze, die für die subkutane Injektion oder für die intramuskuläre Injektion vorgesehen ist, (die gewöhnlicherweise ein Fassungsvermögen von einigen ml, vorzugsweise von nicht mehr als 2 ml, stärker bevorzugt von nicht mehr als 1 ml, insbesondere bevorzugt von nicht mehr als 0,5 ml aufweist), und die einen Innendurchmesser von mindestens etwa 8,6 mm aufweist, kann eine im Voraus abgefüllte Spritzen-Zubereitung, die eine überlegene Stabilität bezüglich des Schüttelns zeigt, leicht erhalten werden, sofern der Anteil des Gasraumes unterhalb des vorstehend angegebenen Wertes bleibt.

Abgesehen von dem vorstehend erläuterten Spritzen-Gefäß können Fläschchen und Ampullen ebenso als Gefäße verwendet werden, wenn die Verarbeitung eines grenzflächenaktiven Mittels in Betracht gezogen wird. Gewöhnliche Fläschchen und Ampullen besitzen verhältnismäßig große Innendurchmesser, und daher ist es verhältnismäßig schwierig, sie zu verkleinern und den Anteil des Gasraumes einzustellen. Daher sollte die Verwendung von Fläschchen und Ampullen vorzugsweise vermieden werden, wenn der Anteil des Gasraumes genau eingestellt werden soll.

Die wie vorstehend hergestellte wässrige Injektions-Zubereitung von Thrombomodulin zeigt eine Langzeit-Stabilität, und somit kann sie die Leistung erbringen, mindestens etwa 80% ihrer ursprünglichen Aktivität über einen Zeitraum von 12 Monaten, vorzugsweise von 18 Monaten, bei 5 °C aufrecht zu erhalten. In manchen Fällen kann sie die Lagerung und den Transport über einen langen Zeitraum ermöglichen, auch wenn er zwei Jahre überschreitet, vorzugsweise bis zu drei Jahre, solange bestimmte weitere Bedingungen eingehalten werden.

Die wässrige Injektions-Zubereitung von Thrombomodulin gemäß der vorliegenden Erfindung wird kein Auftreten einer Trübung erfahren, auch unter der Bedingung des Schüttelns mit einer Amplitude von 5 cm bei einer Frequenz von 180 UpM bei 25 °C für einen Monat. Somit kann die wässrige Injektions-Zubereitung von Thrombomodulin gemäß der vorliegenden Erfindung, die solche ausreichenden Stabilitäten wie vorstehen angegeben zeigt, in Form einer Flüssigkeit über einen langen Zeitraum gelagert und transportiert werden.

Die Bedingungen für die Lagerung und den Transport, auf welche die wässrige Injektions-Zubereitung von Thrombomodulin gemäß der vorliegenden Erfindung trifft, können eine Temperatur umfassen, die höher ist als jene, bei der sie einfriert, jedoch nicht höher als Raumtemperatur, und falls ein konkretes Beispiel angegeben werden soll, kann sie 0 °C bis 20 °C betragen, und vorzugsweise bei etwa 5 °C liegen. Die zulässige Dauer hierfür kann sich im Allgemeinen über 12 Monate, vorzugsweise über 18 Monate, stärker bevorzugt über zwei Jahre erstrecken.

Die wässrige Injektions-Zubereitung von Thrombomodulin gemäß der vorliegenden Erfindung gewährleistet Verabreichungsformen für die subkutane und intramuskuläre Injektion. Somit besteht der vierte Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung in einem Verfahren zur Anwendung der im Voraus abgefüllten Spritzen-Zubereitung von Thrombomodulin für die Verabreichung an einen Patienten über eine subkutane oder intramuskuläre Injektion.

Der fünfte Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung betrifft eine dauerhafte wässrige Injektions-Zubereitung von Thrombomodulin, das als einen aktiven Bestandteil ein lösliches Thrombomodulin enthält, das an den Patienten durch subkutane oder intramuskuläre Injektion bei einer Häufigkeit der Verabreichung von einmal innerhalb von 2 bis 5 Tagen verabreicht wird.

Da das Thrombomodulin auf der Oberfläche der Endothelzellen der Gefäße vorkommt, und da der Wirkungsort desselben auf die Blutgefäße beschränkt ist, wurde es akzeptiert, dass die Verabreichung von Thrombomodulin durch intravenöse Injektion eine direkte Wirkung zustande bringt und am meisten bevorzugt ist. Zum Beispiel offenbart die japanische Patent-Veröffentlichung Sho 64-6219 ein Beispiel einer intravenösen Tropf-Injektion desselben.

Es ist jedoch nötig, eine medizinische Zubereitung und so weiter zu entwickeln, die in herkömmlicher Weise nicht zu finden ist, und die in Übereinstimmung mit dem Zustand des Patienten und mit der praktischen Einfachheit der Handhabung eine geeignete Wahl ermöglicht.

In den Berichten und Veröffentlichungen, die bisher erschienen sind, wurde es nicht immer aufgeklärt, dass Thrombomodulin an einen Patienten vorsätzlich auf eine Weise verabreicht wurde, die von der intravenösen Injektion verschieden ist. Daher haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung Untersuchungen vorgenommen und zum ersten mal gefunden, dass eine Konzentration von Thrombomodulin im Blut aufgebaut werden kann, wenn das lösliche Thrombomodulin, das aus der Aminosäure-Sequenz aufgebaut ist, welche aus den Aminosäure-Resten von der Position Nr. 19 bis zur Position Nr. 516 der SEQ ID Nr. 1 der Sequenzliste zusammengesetzt ist, (ein lösliches Thrombomodulin, das durch Transfektion des DNA-Segments in die Wirtszelle erhalten wurde, dessen DNA für die Aminosäure-Sequenz der SEQ ID Nr. 1 der Sequenzliste codiert), an einen Patienten durch subkutane Injektion verabreicht wird, und dass insbesondere diese Thrombomodulin-Konzentration im Blut über einen bemerkenswert längeren Zeitraum aufrecht erhalten wird, im Vergleich mit dem löslichen Thrombomodulin, das aus der Aminosäure-Sequenz aufgebaut ist, die aus den Resten von der Position Nr. 367 bis zur Position Nr. 480 der SEQ ID Nr. 1 der Sequenzliste zusammengesetzt ist.

Daher wird eine bevorzugte, nachhaltige, medizinische Zubereitung von Thrombomodulin gemäß der vorliegenden Erfindung bereitgestellt.

Es kann ebenso günstig sein, dass ein Lokalanästhetikum darüber hinaus in der vorstehend erwähnten, dauerhaften, medizinischen Zubereitung eingearbeitet ist. Ein darüber hinaus gehender Gehalt eines Konservierungsmittels ist ebenso bevorzugt.

Bevorzugte Beispiele für ein lokalanästhetisches Mittel umfassen Procain-Hydrochlorid und Benzylalkohol. Die Menge der Verabreichung eines lokalanästhetischen Mittels kann zum Beispiel üblicherweise im Bereich von 0,5–10%, vorzugsweise von 1–5% liegen, bezogen auf das Gesamtgewicht der Injektions-Zubereitung.

Falls es notwendig ist, ist es zulässig, dass die Injektions-Zubereitung Aminosäuren, Salze, Kohlenhydrate, grenzflächenaktive Mittel, Albumin, Gelatine, und dergleichen enthält, wie es in der japanischen Patent-Veröffentlichung Sho 64-6219 A und Hei 6-321805 A und dergleichen offenbart ist. Die Zugabe eines Konservierungsmittels ist ebenfalls günstig, deren bevorzugte Beispiele para-Hydroxybenzoesäureester umfassen, wie zum Beispiel p-Hydroxybenzoesäuremethylester, p-Hydroxybenzoesäureethylester und Mischungen von p-Hydroxybenzoesäureestern. Die Menge des Konservierungsmittels kann zum Beispiel üblicherweise im Bereich von 0,01 bis 1,0 %, bevorzugt von 0,1 bis 0,3 % liegen, bezogen auf das Gewicht der Injektions-Zubereitung.

Im Falle des löslichen Thrombomodulins, das in der nachhaltigen medizinischen Zubereitung gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden soll, kann jedes lösliche Thrombomodulin ohne eine besondere Beschränkung eingearbeitet werden, wobei einem löslichen Thrombomodulin, das aus der Aminosäure-Sequenz aufgebaut ist, die aus den Aminosäure-Resten von der Position Nr. 19 bis zur Position Nr. 516 der SEQ ID Nr. 1 der Sequenzliste zusammengesetzt ist, einem löslichen Thrombomodulin, das aus der Aminosäure-Sequenz aufgebaut ist, die aus den Amionsäure-Resten von der Position Nr. 19 bis zur Position Nr. 516 der SEQ ID Nr. 2 der Sequenzliste zusammengesetzt ist, einem löslichen Thrombomodulin, das durch Transfektion des DNA-Segments in eine Wirtszelle erhalten wird, dessen DNA für die Aminosäure-Sequenz der SEQ ID Nr. 1 der Sequenzliste codiert, und einem löslichen Thrombomodulin, das durch Transfektion des DNA-Segments in eine Wirtszelle erhalten wird, dessen DNA für die Aminosäure-Sequenz der SEQ ID Nr. 2 der Sequenzliste codiert, der Vorzug gegeben wird.

Die Nachhaltigkeit der medizinischen Zubereitung gemäß der vorliegenden Erfindung kann in günstiger Weise durch die Tatsache veranschaulicht werden, dass die Halbwertszeit der Konzentration im Blut (T_1/2) mindestens 16 Stunden beträgt, und dass die mittlere Retentionszeit (mean retention time, MRT) im Plasma mindestens 36 Stunden beträgt.

Es ist bevorzugt, dass die nachhaltige medizinische Zubereitung gemäß der vorliegenden Erfindung in Form einer wässrigen Injektions-Zubereitung bereitgestellt wird. Obwohl die nachhaltige medizinische Zubereitung gemäß der vorliegenden Erfindung in Form eines gefriergetrockneten Produktes verteilt werden kann, das bei seiner Verabreichung in Wasser aufgelöst werden muss, ist es am bequemsten, eine im Voraus abgefüllte Spritzen-Zubereitung, die durch aseptisches Befüllen eines Spritzen-Gefäßes mit der vorstehend beschriebenen, wässrigen Injektions-Zubereitung von Thrombomodulin hergestellt wird, als eine Medizin für die subkutane oder intramuskuläre Injektion als solche zu verwenden.

Die Art des praktischen Vorgehens für die Verarbeitung der Zusatzstoffe bei der Herstellung der haltbaren Zubereitung gemäß der vorliegenden Erfindung ist nicht in besonderer Weise beschränkt. Somit können die Zusatzstoffe zum Beispiel einer wässrigen Lösung von Thrombomodulin beigemischt werden, oder sie werden im Voraus in Wasser, in dem Wasser für die Injektion oder in einer geeigneten Pufferlösung gelöst, und die erhaltenen Lösungen werden anschließend in einem geeigneten Verhältnis zusammengebracht, ehe die wässrige Injektions-Zubereitung hergestellt wird. Zum Beispiel wird eine wässrige Lösung, die 0,05–15 mg, vorzugsweise 0,1–6 mg des löslichen Thrombomodulins zusammen mit den vorstehend erwähnten Zusatzstoffen pro 1 ml Wasser, Wasser für die Injektion oder eines geeigneten Puffers enthält, zum Beispiel in ein Spritzen-Gefäß, in ein Fläschchen oder ggf. in eine Ampulle in einer Menge von zum Beispiel 0,5–10 ml eingefüllt, und die dadurch formulierte Zubereitung dient als solche für die wässrige Injektions-Zubereitung von Thrombomodulin, oder im Falle eines Fläschchens oder einer Ampulle kann die formulierte Zubereitung darüber hinaus der Gefriertrocknung unterzogen werden. Üblicherweise kann die so erhaltene, haltbare medizinische Zubereitung ein lösliches Thrombomodulin in einer Menge von zum Beispiel 0,01 bis 100 mg enthalten.

Die Häufigkeit der Verabreichung der wässrigen Injektions-Zubereitung von Thrombomodulin gemäß der vorliegenden Erfindung kann bei 1 bis 3 Verabreichungen pro Tag liegen, wie es herkömmlicherweise der Fall ist, obwohl es möglich ist, zum Beispiel eine Häufigkeit einer Verabreichung von einmal innerhalb von 2–5 Tagen zu wählen. Insbesondere im Falle einer subkutanen oder intramuskulären Injektion ist die Häufigkeit der Verabreichung, zum Beispiel bei einmaliger Verabreichung innerhalb von 2–5 Tagen, aufgrund ihrer Dauerhaftigkeit bevorzugt. In Bezug auf die Dosierung pro Verabreichung kann üblicherweise eine Dosierung für eine einzelne Verabreichung von höchstens 1 mg des löslichen Thrombomodulins pro kg Körpergewicht als Beispiel für eine Einspritzung in das Blutgefäß genannt werden, obwohl es zulässig ist, die maximal zulässige Dosis durch eine intravenöse Tropf-Injektion zu verabreichen. In Bezug auf die minimale Dosierung kann üblicherweise eine Menge von mindestens 0,001 mg, bevorzugt von mindestens 0,005 mg pro 1 kg Körpergewicht als Beispiel genannt werden. Die obere Grenze der Dosierung für eine einzelne subkutane oder intramuskuläre Injektion wird durch die maximale lösliche Menge des aktiven Bestandteils in einer Injektionsmenge der Trägerflüssigkeit bestimmt. Eine typische Dosierung, die für die subkutane oder intramuskuläre Injektion vorgesehen ist, beträgt im Allgemeinen einige ml, vorzugsweise höchstens 2 ml, stärker bevorzugt höchstens 1 ml, insbesondere bevorzugt höchstens 0,5 ml. Somit kann eine Dosierung, ausgedrückt durch das Gewicht des löslichen Thrombomodulins für eine einzelne Verabreichung durch subkutane oder intramuskuläre Injektion üblicherweise zum Beispiel 20 mg oder weniger betragen, wobei die minimale wirksame Menge für eine einzelne Verabreichung zum Beispiel mindestens 0,001 mg pro 1 kg Körpergewicht, vorzugsweise mindestens 0,005 mg pro 1 kg Körpergewicht betragen kann, wie vorstehend angegeben.

Die haltbare Zubereitung von Thrombomodulin gemäß der vorliegenden Erfindung kann ihre Haltbarkeit durch die Verabreichung nicht nur auf dem subkutanen, sondern auch auf dem intramuskulären Weg erweisen, wobei der Vorzug der subkutanen Injektion gegeben wird.

Gemäß der vorliegenden Erfindung ist es möglich, die Haltbarkeit merklich zu verlängern, in der die Konzentration des Thrombomodulins im Blut aufrecht erhalten wird, was zu einer möglichen Herabsetzung der Häufigkeit der Verabreichung führt, wodurch eine medizinische Zubereitung von löslichem Thrombomodulin bereitgestellt wird, die in einer geringeren Menge wirksam ist, im Vergleich mit jener einer herkömmlichen Zubereitung für die intravenöse Injektion. Eine solche medizinische Zubereitung kann den Schmerz des Patienten bei der Injektion herabsetzen und somit ggf. die Injektion durch den Patienten selbst ermöglichen, so dass dies zum therapeutischen Nutzen des Patienten erheblich beiträgt.

Die Untersuchung in Bezug auf die akute Toxizität der wässrigen Injektions-Zubereitung des löslichen Thrombomodulins gemäß der vorliegenden Erfindung hat ergeben, dass kein Todesfall bei der Verabreichung an Gruppen von jeweils fünf männlichen und weiblichen SD-Ratten durch intravenöse Injektion bei einer Dosis von 180 mg/kg als Dosisgewicht von Thrombomodulin aufgetreten ist. Ebenso wurde kein Todesfall bei der Verabreichung durch subkutane Injektion bei der gleichen Dosis von 180 mg/kg beobachtet.

1 zeigt die zeitliche Schwankung der Konzentration von löslichem Thrombomodulin im Plasma nach der Verabreichung von löslichem Thrombomodulin an Ratten. In der Graphik bezeichnet die Angabe „IV" die intravenöse Injektion und die Angabe „SC" bezeichnet die subkutane Injektion.

Weitere Informationen in der SEQ ID Nr. 1 der Sequenzliste betreffen die teilweisen Aminosäure-Sequenzen von humanem Thrombomodulin.

Weitere Informationen in der SEQ ID Nr. 2 der Sequenzliste betreffen die teilweisen Aminosäure-Sequenzen von humanem Thrombomodulin.

Weitere Informationen in der SEQ ID Nr. 3 der Sequenzliste betreffen die teilweisen Basen-Sequenzen des humanen Thrombomodulin-Gens.

Weitere Informationen in der SEQ ID Nr. 4 der Sequenzliste betreffen die teilweisen Basen-Sequenzen des humanen Thrombomodulin-Gens.

Weitere Informationen in der SEQ ID Nr. 5 der Sequenzliste betreffen die synthetische DNA für die Mutation.

Nachfolgend wird die vorliegende Erfindung konkret anhand von Beispielen und Vergleichsbeispielen beschrieben, wobei angemerkt wird, dass die vorliegende Erfindung nicht darauf beschränkt ist.

Die löslichen Thrombomoduline, die in den Beispielen verwendet werden sollen, werden in Übereinstimmung mit dem Verfahren von Yamamoto et al. erhalten (das Verfahren ist in Beispiel 10 der Beschreibung der japanischen Patent-Veröffentlichung Sho 64-6219 veröffentlicht). Somit wurde die DNA der SEQ ID Nr. 3 der Sequenzliste in eine Zelle aus dem Eierstock des chinesischen Hamsters (Chinese hamster ovary, CHO) integriert, um eine transformierte Zelle herzustellen, und durch die Kultivierung dieser transformierten Zellen wurden lösliche Thrombomoduline hergestellt.

11 Liter des Kulturüberstandes, der in Referenzbeispiel 1 erhalten wurde, und der bei –20 °C eingefroren wurde, wurden aufgetaut und durch ein Membranfilter mit einer Porengröße von 0,2 &mgr;m (Millipack 20, ein Produkt der Fa. Millipore) filtriert.

Der filtrierte Kulturüberstand wurde auf eine Q-Sepharose-Säule (geliefert von der Fa. Pharmacia, mit einem Durchmesser von 90 mm und einer Höhe von 6,5 cm) aufgetragen, die mit einer Pufferlösung von 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), die 150 mM NaCl enthielt, äquilibriert worden war. Anschließend wurde die Säule mit 20 mM Acetat-Puffer, der 180 mM NaCl enthielt, gewaschen, und danach wurde sie weiter mit einer Puffer-Lösung von 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), die 180 mM NaCl enthielt, gewaschen, gefolgt von einer Elution mit einer Puffer-Lösung von 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), die 300 mM NaCl enthielt, worauf die Eluat-Fraktion vom Anstieg des Absorptionspeaks bei 280 nm bis zur Elution des 0,5-fachen des Säulenvolumens als ein erstes gereinigtes Produkt gesammelt wurde.

400 ml der Eluatfraktion, die in Referenzbeispiel 2 erhalten wurde, wurden gegen eine Puffer-Lösung von 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), die 100 mM NaCl und 0,5 mM Calciumchlorid enthielt, dialysiert. Nach der Dialyse wurde die so dialysierte Lösung auf eine DIP-Thrombin-Agarose-Säule (06-148-1035, geliefert von der Fa. Paese Lorei, mit einem Durchmesser von 50 mm und einer Höhe von 6 cm) aufgetragen, die mit einer Puffer-Lösung von 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), die 100 mM NaCl und 0,5 mM CaCl₂ enthielt, äquilibriert worden war. Nach dem Waschen mit einer Puffer-Lösung von 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), die 200 mM NaCl und 0,5 mM CaCl₂ enthielt, wurde die Elution mit einer Puffer-Lösung von 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), die 1,0 M NaCl und 0,5 mM CaCl₂ enthielt, begonnen, wobei die Eluatfraktion vom Anstieg des Absorptionspeaks bei 280 nm bis zum Abfallen desselben als das gereinigte Hauptprodukt gesammelt wurde.

Die Affinitäts-Säule wurde wie folgt hergestellt: Somit wurde der gegen Thrombomodulin gerichtete, monoklonale Antikörer B durch Reinigung des Kulturüberstandes erhalten, der sich aus der Kultivierung eines Hybridoms, das diesen Antikörper produziert, oder durch Reinigung der abdominalen Flüssigkeit ergibt, welche sich aus der Kultivierung eines Hybridoms im Peritoneum von einem histokompatiblen Tier, wie zum Beispiel von nackten Mäusen, mittels einer Isolierung und Reinigungs-Vorschrift ergibt, wie zum Beispiel durch Aussalzen, Ionenaustausch-Chromatographie oder durch die Verwendung einer Protein A-Säule. Anschließend wurde der so gereinigte, gegen Thrombomodulin gerichtete, monoklonale Antikörper B in einer Puffer-Lösung von 0,1 M NaHCO₃ (pH 8,3) gelöst, die 0,5 M NaCl enthielt, und die Lösung wurde mit einer CNBr-aktivierten Sepharose 4B in Kontakt gebracht (52-1153-00-AI, ein Produkt von Pharmacia), um den gegen Thrombomodulin gerichteten, monoklonalen Antikörper B dazu zu veranlassen, mit der Sepharose 4B zu koppeln, um eine Sepharose 4B zu ergeben, die mit einem gegen Thrombomodulin gerichteten, monoklonalen Antikörper (_ Antikörper B) gekoppelt ist, in Übereinstimmung mit den Verfahren aus dem Handbuch von Pharmacia (Affinitäts-Chromatographie: Prinzipien und Verfahren). Diese Sepharose 4B, die mit einem gegen Thrombomodulin gerichteten Antikörper (= Antikörper B) gekoppelt ist, wurde in eine Säule gefüllt, um eine Säule mit dem monoklonalen Antikörper (= Antikörper B) herzustellen.

400 ml der Eluatfraktion, die in Referenzbeispiel 2 erhalten wurde, wurden auf die Säule mit dem monoklonalen Antikörper (Antikörper B) (mit einem Durchmesser von 50 mm und einer Höhe von 6 cm) aufgetragen, die zuvor mit einer Puffer-Lösung von 20 mM Phosphat (pH 7,3), die 1,0 M NaCl enthielt, äquilibriert worden war. Anschließend wurden 20 mM Phosphat-Puffer (pH 7,3), der 1,0 M NaCl enthielt, durch die Säule geleitet, gefolgt von einem Waschschritt mit einer Pufferlösung von 100 mM Acetat (pH 5,0), worauf die Elution unter Verwendung einer Puffer-Lösung von 100 mM Glycin-HCl (pH 3,0), die 0,3 M NaCl enthielt, begonnen wurde, wobei die Eluatfraktion vom Anstieg des Absorptionspeaks bei 280 nm bis zum Abfallen desselben als das gereinigte Hauptprodukt gesammelt wurde.

200 ml des Eluats, das in Referenzbeispiel 3 erhalten wurde, wurden mit einer Puffer-Lösung von 100 mM Glycin-HCl (pH 3,5) verdünnt, und der pH-Wert der so verdünnten Lösung wurde auf 3,5 unter Verwendung einer Pufferlösung von 1,0 M Glycin-HCl (pH 2,0) eingestellt. Dieses verdünnte und bezüglich des pH-Werts eingestellte Eluat wurde auf eine SP-Sepharose-Säule (geliefert von Pharmacia, mit einem Durchmesser von 26 mm und einer Höhe von 3 cm) aufgetragen, welche zuvor mit einer Pufferlösung von 100 mM Glycin-HCl (mit einer spezifischen Leitfähigkeit von 31 mS/cm, pH 3,5), die 300 mM NaCl enthielt, äquilibriert worden war. Der Waschschritt wurde unter Verwendung einer Pufferlösung von 100 mM Glycin-HCl (die gleiche wie vorstehend angegeben), die 300 mM NaCl enthielt, begonnen, und die Eluatfraktion vom Anstieg des Absorptionspeaks bei 280 nm bis zum Abfallen desselben wurde gesammelt, und sie wurde sofort mit einer Pufferlösung von 500 mM Phosphat (pH 7,3) auf einen pH von 7,0 neutralisiert, welche als ein Produkt von hoher Reinheit diente.

180 ml des Eluats, das in Referenzbeispiel 4 erhalten wurde, wurden mit einer Pufferlösung von 1,0 M Glycin-HCl (pH 2,0) behandelt, um dessen pH-Wert auf 3,5 einzustellen, und sie wurden anschließend auf eine SP-Sepharose-Säule (geliefert von Pharmacia, mit einem Durchmesser von 26 mm und einer Höhe von 3 cm) aufgetragen, die zuvor mit einer Pufferlösung von 100 mM Glycin-HCl (die gleiche wie vorstehend angegeben), die 300 mM NaCl enthielt, äquilibriert worden war. Der Waschschritt wurde unter Verwendung einer Pufferlösung von 100 mM Glycin-HCl (die gleiche wie vorstehend angegeben), die 300 mM NaCl enthielt, begonnen, und die Eluatfraktion wurde vom Anstieg des Absorptionspeaks bei 280 nm bis zum Abfallen desselben gesammelt, und sie wurde sofort mit einer Pufferlösung von 500 mM Phosphat (pH 7,3) auf einen pH-Wert von 7,0 neutralisiert, welche als ein Produkt von hohem Reinheitsgrad diente.

200 ml des Eluats, das in Referenzbeispiel 3 erhalten wurde, wurden mit einer Pufferlösung von 100 mM Glycin-HCl (pH 3,5) verdünnt, und der pH der so verdünnten Lösung wurde auf 3,5 unter Verwendung einer Pufferlösung von 1,0 M Glycin-HCl (pH 2,0) eingestellt. Dieses verdünnte und bezüglich des pH-Werts eingestellte Eluat wurde auf eine SP-Sepharose-Säule (geliefert von Pharmacia, mit einem Durchmesser von 26 mm und einer Höhe von 3 cm) aufgetragen, die zuvor mit einer Pufferlösung von 100 mM Glycin-HCl (pH 3,5), die 100 mM NaCl enthielt, äquilibriert worden war. Die Säule wurde unter Verwendung einer Pufferlösung von 100 mM Glycin-HCl (pH 3,5), die 100 mM NaCl enthielt, gewaschen, und sie wurde mit einer Pufferlösung von 100 mM Glycin-HCl (pH 3,5) eluiert, wobei die Eluatfraktion vom Anstieg des Adsorptionspeaks bei 280 nm bis zum Abfallen desselben gesammelt wurde, und sofort mit einer Pufferlösung von 500 mM Phosphat (pH 7,3) auf einen pH-Wert von 7,0 neutralisiert wurde, welche als ein Produkt von hoher Reinheit diente.

180 ml des Eluats, das in Referenzbeispiel 4 erhalten wurde, wurden mit einer Pufferlösung von 100 mM Glycin-HCl (pH 3,5) verdünnt, und der pH-Wert der so verdünnten Lösung wurde auf 3,5 unter Verwendung einer Pufferlösung von 1,0 M Glycin-HCl (pH 2,0) eingestellt. Dieses verdünnte und bezüglich des pH-Werts eingestellte Eluat wurde durch eine SP-Sepharose-Säule (geliefert von Pharmacia, mit einem Durchmesser von 26 mm und einer Höhe von 3 cm) hindurchgeleitet, welche zuvor mit einer Pufferlösung von 100 mM Glycin-HCl (pH 3,5), die 100 mM NaCl enthielt, äquilibriert worden war. Diese Säule wurde unter Verwendung einer Pufferlösung von 100 mM Glycin-HCl (pH 3,5), die 100 mM NaCl enthielt, gewaschen, und sie wurde mit einer Pufferlösung von 100 mM Glycin-HCl (pH 3,5), die 300 mM NaCl enthielt, eluiert, worauf die Eluatfraktion vom Anstieg des Absorptionspeaks bei 280 nm bis zum Abfallen desselben gesammelt wurde, und sofort mit einer Pufferlösung von 500 mM Phosphat (pH 7,3) auf einen pH-Wert von 7,0 neutralisiert wurde, welche als ein Produkt von hoher Reinheit diente.

Das hochgradig gereinigte Produkt, das in Referenzbeispiel 5 erhalten wurde, wurde unter Verwendung einer Hohlfaser aus Polysulfon (geliefert von Asahi Chemical Industry Co., Ltd.) konzentriert, wobei jede Hohlfaser eine Länge von 1 m aufweist und mit einer Pufferlösung von 20 mM Phosphat (pH 7,3), die 50 mM NaCl enthielt, behandelt wurde, um eine Befeuchtung derselben zu veranlassen, wodurch die entsprechenden Mengen von konzentrierten Flüssigkeiten jeweils in einer Menge von 5 ml erhalten wurden.

Jeweils 5 ml des konzentrierten, hochgradig gereinigten Produktes, das in Referenzbeispiel 6 erhalten wurde, wurden jeweils auf Sephacryl S-300 Säulen (geliefert von der Fa. Pharmacia, mit einem Durchmesser von 16 mm und einer Höhe von 90 cm) aufgetragen, die zuvor mit einer Pufferlösung von 20 mM Phosphat (pH 7,3), die 50 mM NaCl enthielt, äquilibriert worden war. Diese Säule wurde durch eine Entwicklung mit einer Pufferlösung von 20 mM Natriumphosphat (pH 7,3), die 50 mM NaCl enthielt, behandelt, wodurch eine fraktionierte Elution bewirkt wurde. Jede Fraktion wurde in Bezug auf die Aktivität des Thrombomodulins anhand der Beschleunigung der Aktivierung des Proteins C durch Thrombin in Übereinstimmung mit dem Bestimmungs-Verfahren 1 überprüft, worauf die Fraktionen, welche eine solche Aktivität aufwiesen, gesammelt wurden, so dass hochgradig gereinigte Produkte mit einer ausgetauschten Pufferlösung erhalten wurden.

In den nachfolgend angegebenen Beispielen und Vergleichsbeispielen wurden jeweils die hochgradig gereinigten Produkte des Thrombomodulins, die der Reihe nach in den Referenzbeispielen 2, 4, 5 (2), 6 und 7 gereinigt wurden, verwendet. Zur Einstellung der Konzentration der Pufferlösung und für die Verwendung eines Puffer-Bestandteils, der von einer Natriumphosphat-Pufferlösung verschieden ist, wurde der Pufferbestandteil durch Dialyse des hochgradig gereinigten Produktes, das wie vorstehend erhalten wurde, gegen die jeweilige Pufferlösung ausgetauscht. Durch die weitere Zugabe einer Pufferlösung mit einer geeigneten Konzentration wurde die Konzentration des Thrombomodulins eingestellt. Die Einstellung des pH-Werts wurde durch die Zugabe einer geeigneten Menge von verdünnter Chlorwasserstoffsäure oder einer Lösung von Natriumhydroxid bewerkstelligt.

Es wurde bestätigt, dass das erhaltene Thrombomodulin in Wasser für die Injektion mit mindestens einer Konzentration von 6 mg/ml löslich ist. Es wurde ebenso bestätigt, dass das Molekulargewicht desselben 66.000 ± 10.000 Dalton (im nicht-reduzierten Zustand) beträgt, wie durch die nachfolgend angegebenen Verfahren bestimmt:

Unter Verwendung eines Elektrophorese-Gels mit einem Gradienten (ein SDS-Polyacrylamid-Gel mit einem Gradienten mit dem Handelsnamen PAGEL, 5/20 % der Fa. Atto; eine Gelgröße von 90 × 73 × 1,0 mm) wurde eine elektrophoretische Analyse im nichtreduzierten Zustand bei 25 °C bei einem konstanten Strom von 20 mA für 90 Minuten durchgeführt, bei dem ein Molekulargewichts-Standard [ein Satz für die Elektrophorese für Proteine mit einem geringen Molekulargewicht: ein Produkt von Pharmacia, das in einem einzelnen Fläschchen folgende Proteine enthielt: Phosphorylase B (Molekulargewicht = 94.000), Rinderserumbalbumin (Molekulargewicht = 67.000), Ovalbumin (Molekulargewicht = 43.000), Carboanhydrase (Molekulargewicht = 30.000), Trypsin-Inhibitor (Molekulargewicht = 20.100), &agr;-Lactalbumin (Molekulargewicht = 14.400) und Saccharose] zur Bestimmung des Molekulargewichts von Thrombomodulin verwendet wurde. Die Färbung wurde durch Verwendung von Coomassie Brilliant Blue bewirkt.

Eine Lösung von Thrombomodulin, das aus der Aminosäure-Sequenz der Aminosäure-Reste von der Position 367 bis zur Position 480 der SEQ ID Nr. 1 der Sequenzliste aufgebaut ist, wurde in der folgenden Weise erhalten: Somit wurde ein Plasmid, das in Übereinstimmung mit dem in Beispiel 1-(1)-(b) der japanischen Patent-Veröffentlichung Hei 5-213998 A angegebenen Verfahren erhalten wurde, in eine Zelle transfiziert, die im Beispiel 1-(2) desselben beschrieben ist, gefolgt von einer Reinigung durch die Verfahren, die in Beispiel 3-(3) desselben angegeben sind, wobei der Austausch einer Pufferlösung bewirkt wurde, um ein hochgradig gereinigtes Produkt von löslichem Thrombomodulin zu ergeben.

Es wurde bestätigt, dass das erhaltene Thrombomodulin in Wasser für die Injektion mit mindestens einer Konzentration von 6 mg/ml löslich ist. Es wurde darüber hinaus bestätigt, dass das Molekulargewicht desselben 25.000 ± 5.000 (im nicht-reduzierten Zustand) beträgt, wie durch die nachfolgend angegebenen Verfahren bestimmt:

Zur Einstellung der Konzentration der Pufferlösung und für die Verwendung eines Puffer-Bestandteils, der von einer Natriumphosphat-Pufferlösung verschieden ist, wurde der Pufferbestandteil durch Dialyse des hochgradig gereinigten Produktes, das wie vorstehend erhalten wurde, gegen die jeweilige Pufferlösung ausgetauscht. Durch die weitere Zugabe einer Pufferlösung mit einer geeigneten Konzentration wurde die Konzentration des Thrombomodulins eingestellt. Die Einstellung des pH-Werts wurde durch die Zugabe einer geeigneten Menge von verdünnter Chlorwasserstoffsäure oder einer Lösung von Natriumhydroxid bewerkstelligt.

Ein lösliches Thrombomodulin, das aus der Aminosäure-Sequenz der Aminosäure-Reste von der Position 19 bis zur Position 516 der SEQ ID Nr. 2 der Sequenzliste aufgebaut ist, wurde in der folgenden Weise erhalten: Somit wurde das Verfahren, das in „Methods in Enzymology" 100, 468, 1983, Academic Press, beschrieben ist, eingeschlagen, wobei ein DNA-Segment mit einer Basen-Sequenz der SEQ ID Nr. 3 der Sequenzliste einer ortsspezifischen Mutation unterzogen wurde, bei der eine synthetische DNA mit der Basen-Sequenz der SEQ ID Nr. 5 der Sequenzliste für die Mutation zu einer DNA verwendet wurde, die für die Aminosäure-Sequenz der SEQ ID Nr. 2 der Sequenzliste codiert, gefolgt von den Verfahren der Referenzbeispiele 1 bis 7, um das vorstehend identifizierte lösliche Thrombomodulin zu erhalten.

Es wurde bestätigt, dass das so erhaltene Thrombomodulin in Wasser für die Injektion mit mindestens einer Konzentration von 6 mg/ml löslich ist. Es wurde darüber hinaus bestätigt, dass das Molekulargewicht desselben 66.000 ± 10.000 Dalton (im nicht-reduzierten Zustand) beträgt, wie durch die nachfolgend angegebenen Verfahren bestimmt:

Zur Einstellung der Konzentration der Pufferlösung und für die Verwendung eines Puffer-Bestandteils, der von einer Natriumphosphat-Pufferlösung verschieden ist, wurde der Pufferbestandteil durch Dialyse des hochgradig gereinigten Produktes, das wie vorstehend erhalten wurde, gegen die jeweilige Pufferlösung ausgetauscht. Durch die weitere Zugabe einer Pufferlösung mit einer geeigneten Konzentration wurde die Konzentration des Thrombomodulins eingestellt. Die Einstellung des pH-Werts wurde durch die Zugabe einer geeigneten Menge von verdünnter Chlorwasserstoffsäure oder einer Lösung von Natriumhydroxid bewerkstelligt.

Eine wässrige Lösung wurde hergestellt, indem die Konzentration des löslichen Thrombomodulins von Referenzbeispiel 7 auf 1 mg/ml und die Konzentration der Natriumphosphat-Pufferlösung auf 0,2 mM eingestellt wurden, wozu NaCl und Polysorbat 80 (Tween 80) gegeben wurden, so dass deren Konzentrationen auf 150 mM bzw. 0,01 % eingestellt wurden, worauf der pH-Wert der Lösung auf 6,0 eingestellt wurde. Die in Ampullen abgefüllten Produkte der wässrigen Injektions-Zubereitung, welche das lösliche Thrombomodulin enthält, wurden durch Abfüllen von jeweils 2 ml der vorstehend erhaltenen, wässrigen Lösung in Ampullen von 2 ml Fassungsvermögen (mit einem Innendurchmesser von 12 mm) und durch Verschließen der Ampullen hergestellt. Der Ausdruck „Anteil des Gasraums" in dem „Bereich, der dem Schütteln unterzogen wird" betrug für dieses Produkt etwa 35 Vol.-%.

Eine wässrige Lösung wurde hergestellt, indem die Konzentration des löslichen Thrombomodulins von Referenzbeispiel 7 auf 1 mg/ml und die Konzentration der Natriumphosphat-Pufferlösung auf 0,2 mM eingestellt wurden, wozu NaCl und polyoxyethyliertes, hydriertes Rhizinusöl (mit dem Handelsnamen HCO-60) gegeben wurden, so dass deren Konzentrationen auf 150 mM bzw. 0,1 % eingestellt wurden, worauf der pH-Wert der Lösung auf 6,0 eingestellt wurde. Die in Ampullen abgefüllten Produkte der wässrigen Injektions-Zubereitung, welche das lösliche Thrombomodulin enthält, wurden durch Abfüllen von jeweils 2 ml der vorstehend erhaltenen, wässrigen Lösung in Ampullen von 2 ml Fassungsvermögen und durch Verschließen der Ampullen hergestellt (Anteil des Gasraumes = 35 %).

Eine wässrige Lösung wurde hergestellt, indem die Konzentration des löslichen Thrombomodulins von Referenzbeispiel 7 auf 1 mg/ml und die Konzentration der Natriumacetat-Pufferlösung auf 20 mM eingestellt wurden, wozu NaCl und Polysorbat 80 (Tween 80) gegeben wurden, so dass deren Konzentrationen auf 150 mM bzw. 0,01 % eingestellt wurden, worauf der pH-Wert der Lösung auf 6,0 eingestellt wurde. Die in Ampullen abgefüllten Produkte der wässrigen Injektions-Zubereitung, welche das lösliche Thrombomodulin enthält, wurden durch Abfüllen von jeweils 2 ml der vorstehend erhaltenen, wässrigen Lösung in Ampullen von 2 ml Fassungsvermögen und durch Verschließen der Ampullen hergestellt (Anteil des Gasraumes = 35 %).

Eine wässrige Lösung wurde hergestellt, indem die Konzentration des löslichen Thrombomodulins von Referenzbeispiel 7 auf 1 mg/ml und die Konzentration der Natriumacetat-Pufferlösung auf 20 mM eingestellt wurden, wozu NaCl und polyoxyethyliertes, hydriertes Rhizinusöl (mit dem Handelsnamen HCO-60) gegeben wurden, so dass deren Konzentrationen auf 150 mM bzw. 0,1 % eingestellt wurden, worauf der pH-Wert der Lösung auf 6,0 eingestellt wurde. Die in Ampullen abgefüllten Produkte der wässrigen Injektions-Zubereitung, welche das lösliche Thrombomodulin enthält, wurden durch Abfüllen von jeweils 2 ml der vorstehend erhaltenen, wässrigen Lösung in Ampullen von 2 ml Fassungsvermögen und durch Verschließen der Ampullen hergestellt (Anteil des Gasraumes = 35 %).

Eine wässrige Lösung wurde hergestellt, indem die Konzentration des löslichen Thrombomodulins von Referenzbeispiel 7 auf 1 mg/ml und die Konzentration der Natriumacetat-Pufferlösung auf 200 mM eingestellt wurden, wozu NaCl und Polysorbat 80 (Tween 80) gegeben wurden, so dass deren Konzentrationen auf 150 mM bzw. 0,01 % eingestellt wurden, worauf der pH-Wert der Lösung auf 6,0 eingestellt wurde. Die in Ampullen abgefüllten Produkte der wässrigen Injektions-Zubereitung, welche das lösliche Thrombomodulin enthält, wurden durch Abfüllen von jeweils 2 ml der vorstehend erhaltenen, wässrigen Lösung in Ampullen von 2 ml Fassungsvermögen und durch Verschließen der Ampullen hergestellt (Anteil des Gasraumes = 35 %).

Eine wässrige Lösung wurde hergestellt, indem die Konzentration des löslichen Thrombomodulins von Referenzbeispiel 7 auf 1 mg/ml und die Konzentration der Natriumacetat-Pufferlösung auf 20 mM eingestellt wurden, wozu NaCl und Polysorbat 80 (Tween 80) gegeben wurden, so dass deren Konzentrationen auf 150 mM bzw. 0,01 % eingestellt wurden, worauf der pH-Wert der Lösung auf 5,5 eingestellt wurde. Die in Ampullen abgefüllten Produkte der wässrigen Injektions-Zubereitung, welche das lösliche Thrombomodulin enthält, wurden durch Abfüllen von jeweils 2 ml der vorstehend erhaltenen, wässrigen Lösung in Ampullen von 2 ml Fassungsvermögen und durch Verschließen der Ampullen hergestellt (Anteil des Gasraumes = 35 %).

Eine wässrige Lösung wurde hergestellt, indem die Konzentration des löslichen Thrombomodulins von Referenzbeispiel 7 auf 1 mg/ml und die Konzentration der Natriumacetat-Pufferlösung auf 20 mM eingestellt wurden, wozu NaCl und Polysorbat 80 (Tween 80) gegeben wurden, so dass deren Konzentrationen auf 150 mM bzw. 0,01 % eingestellt wurden, worauf der pH-Wert der Lösung auf 5,0 eingestellt wurde. Die in Ampullen abgefüllten Produkte der wässrigen Injektions-Zubereitung, welche das lösliche Thrombomodulin enthält, wurden durch Abfüllen von jeweils 2 ml der vorstehend erhaltenen, wässrigen Lösung in Ampullen von 2 ml Fassungsvermögen und durch Verschließen der Ampullen hergestellt (Anteil des Gasraumes = 35 %).

Eine wässrige Lösung wurde hergestellt, indem die Konzentration des löslichen Thrombomodulins von Referenzbeispiel 7 auf 1 mg/ml und die Konzentration der Natriumacetat-Pufferlösung auf 2 mM eingestellt wurden, wozu NaCl und Polysorbat 80 (Tween 80) gegeben wurden, so dass deren Konzentrationen auf 150 mM bzw. 0,01 % eingestellt wurden, worauf der pH-Wert der Lösung auf 6,0 eingestellt wurde. Die in Ampullen abgefüllten Produkte der wässrigen Injektions-Zubereitung, welche das lösliche Thrombomodulin enthält, wurden durch Abfüllen von jeweils 2 ml der vorstehend erhaltenen, wässrigen Lösung in Ampullen von 2 ml Fassungsvermögen und durch Verschließen der Ampullen hergestellt (Anteil des Gasraumes = 35 %).

Eine wässrige Lösung wurde hergestellt, indem die Konzentration des löslichen Thrombomodulins von Referenzbeispiel 7 auf 1 mg/ml und die Konzentration der Natriumacetat-Pufferlösung auf 2 mM eingestellt wurden, wozu NaCl und Polysorbat 80 (Tween 80) gegeben wurden, so dass deren Konzentrationen auf 150 mM bzw. 0,01 % eingestellt wurden, worauf der pH-Wert der Lösung auf 5,5 eingestellt wurde. Die in Ampullen abgefüllten Produkte der wässrigen Injektions-Zubereitung, welche das lösliche Thrombomodulin enthält, wurden durch Abfüllen von jeweils 2 ml der vorstehend erhaltenen, wässrigen Lösung in Ampullen von 2 ml Fassungsvermögen und durch Verschließen der Ampullen hergestellt (Anteil des Gasraumes = 35 %).

Eine wässrige Lösung wurde hergestellt, indem die Konzentration des löslichen Thrombomodulins von Referenzbeispiel 7 auf 1 mg/ml und die Konzentration der Natriumacetat-Pufferlösung auf 2 mM eingestellt wurden, wozu NaCl und Polysorbat 80 (Tween 80) gegeben wurden, so dass deren Konzentrationen auf 150 mM bzw. 0,01 % eingestellt wurden, worauf der pH-Wert der Lösung auf 5,0 eingestellt wurde. Die in Ampullen abgefüllten Produkte der wässrigen Injektions-Zubereitung, welche das lösliche Thrombomodulin enthält, wurden durch Abfüllen von jeweils 2 ml der vorstehend erhaltenen, wässrigen Lösung in Ampullen von 2 ml Fassungsvermögen und durch Verschließen der Ampullen hergestellt (Anteil des Gasraumes = 35 %).

Eine wässrige Lösung wurde hergestellt, indem die Konzentration des löslichen Thrombomodulins von Referenzbeispiel 7 auf 1 mg/ml und die Konzentration der Natriumacetat-Pufferlösung auf 0,2 mM eingestellt wurden, wozu NaCl und Polysorbat 80 (Tween 80) gegeben wurden, so dass deren Konzentrationen auf 150 mM bzw. 0,01 % eingestellt wurden, worauf der pH-Wert der Lösung auf 6,0 eingestellt wurde. Die in Ampullen abgefüllten Produkte der wässrigen Injektions-Zubereitung, welche das lösliche Thrombomodulin enthält, wurden durch Abfüllen von jeweils 2 ml der vorstehend erhaltenen, wässrigen Lösung in Ampullen von 2 ml Fassungsvermögen und durch Verschließen der Ampullen hergestellt (Anteil des Gasraumes = 35 %).

Eine wässrige Lösung wurde hergestellt, indem die Konzentration des löslichen Thrombomodulins von Referenzbeispiel 7 auf 1 mg/ml und die Konzentration der Natriumacetat-Pufferlösung auf 0,2 mM eingestellt wurden, wozu NaCl und Polysorbat 80 (Tween 80) gegeben wurden, so dass deren Konzentrationen auf 150 mM bzw. 0,01 % eingestellt wurden, worauf der pH-Wert der Lösung auf 5,5 eingestellt wurde. Die in Ampullen abgefüllten Produkte der wässrigen Injektions-Zubereitung, welche das lösliche Thrombomodulin enthält, wurden durch Abfüllen von jeweils 2 ml der vorstehend erhaltenen, wässrigen Lösung in Ampullen von 2 ml Fassungsvermögen und durch Verschließen der Ampullen hergestellt (Anteil des Gasraumes = 35 %).

Eine wässrige Lösung wurde hergestellt, indem die Konzentration des löslichen Thrombomodulins von Referenzbeispiel 7 auf 1 mg/ml und die Konzentration der Natriumacetat-Pufferlösung auf 0,2 mM eingestellt wurden, wozu NaCl und Polysorbat 80 (Tween 80) gegeben wurden, so dass deren Konzentrationen auf 150 mM bzw. 0,01 % eingestellt wurden, worauf der pH-Wert der Lösung auf 5,0 eingestellt wurde. Die in Ampullen abgefüllten Produkte der wässrigen Injektions-Zubereitung, welche das lösliche Thrombomodulin enthält, wurden durch Abfüllen von jeweils 2 ml der vorstehend erhaltenen, wässrigen Lösung in Ampullen von 2 ml Fassungsvermögen und durch Verschließen der Ampullen hergestellt (Anteil des Gasraumes = 35 %).

Eine wässrige Lösung wurde hergestellt, indem die Konzentration des löslichen Thrombomodulins von Referenzbeispiel 7 auf 1 mg/ml und die Konzentration der Natriumphosphat-Pufferlösung auf 200 mM eingestellt wurden, wozu NaCl und Polysorbat 80 (Tween 80) gegeben wurden, so dass deren Konzentrationen auf 150 mM bzw. 0,01 % eingestellt wurden, worauf der pH-Wert der Lösung auf 6,0 eingestellt wurde. Die in Ampullen abgefüllten Produkte der wässrigen Injektions-Zubereitung, welche das lösliche Thrombomodulin enthält, wurden durch Abfüllen von jeweils 2 ml der vorstehend erhaltenen, wässrigen Lösung in Ampullen von 2 ml Fassungsvermögen und durch Verschließen der Ampullen hergestellt (Anteil des Gasraumes = 35 %).

Eine wässrige Lösung wurde hergestellt, indem die Konzentration des löslichen Thrombomodulins von Referenzbeispiel 7 auf 1 mg/ml und die Konzentration der Natriumphosphat-Pufferlösung auf 200 mM eingestellt wurden, wozu NaCl und Polysorbat 80 (Tween 80) gegeben wurden, so dass deren Konzentrationen auf 150 mM bzw. 0,01 % eingestellt wurden, worauf der pH-Wert der Lösung auf 5,0 eingestellt wurde. Die in Ampullen abgefüllten Produkte der wässrigen Injektions-Zubereitung, welche das lösliche Thrombomodulin enthält, wurden durch Abfüllen von jeweils 2 ml der vorstehend erhaltenen, wässrigen Lösung in Ampullen von 2 ml Fassungsvermögen und durch Verschließen der Ampullen hergestellt (Anteil des Gasraumes = 35 %).

Eine wässrige Lösung wurde hergestellt, indem die Konzentration des löslichen Thrombomodulins von Referenzbeispiel 7 auf 1 mg/ml und die Konzentration der Natriumphosphat-Pufferlösung auf 20 mM eingestellt wurden, wozu NaCl und Polysorbat 80 (Tween 80) gegeben wurden, so dass deren Konzentrationen auf 150 mM bzw. 0,01 % eingestellt wurden, worauf der pH-Wert der Lösung auf 6,0 eingestellt wurde. Die in Ampullen abgefüllten Produkte der wässrigen Injektions-Zubereitung, welche das lösliche Thrombomodulin enthält, wurden durch Abfüllen von jeweils 2 ml der vorstehend erhaltenen, wässrigen Lösung in Ampullen von 2 ml Fassungsvermögen und durch Verschließen der Ampullen hergestellt (Anteil des Gasraumes = 35 %).

Eine wässrige Lösung wurde hergestellt, indem die Konzentration des löslichen Thrombomodulins von Referenzbeispiel 7 auf 1 mg/ml und die Konzentration der Natriumphosphat-Pufferlösung auf 20 mM eingestellt wurden, wozu NaCl und Polysorbat 80 (Tween 80) gegeben wurden, so dass deren Konzentrationen auf 150 mM bzw. 0,01 % eingestellt wurden, worauf der pH-Wert der Lösung auf 5,0 eingestellt wurde. Die in Ampullen abgefüllten Produkte der wässrigen Injektions-Zubereitung, welche das lösliche Thrombomodulin enthält, wurden durch Abfüllen von jeweils 2 ml der vorstehend erhaltenen, wässrigen Lösung in Ampullen von 2 ml Fassungsvermögen und durch Verschließen der Ampullen hergestellt (Anteil des Gasraumes = 35 %).

Eine wässrige Lösung wurde hergestellt, indem die Konzentration des löslichen Thrombomodulins von Referenzbeispiel 7 auf 1 mg/ml und die Konzentration der Natriumphosphat-Pufferlösung auf 2 mM eingestellt wurden, wozu NaCl und Polysorbat 80 (Tween 80) gegeben wurden, so dass deren Konzentrationen auf 150 mM bzw. 0,01 % eingestellt wurden, worauf der pH-Wert der Lösung auf 6,0 eingestellt wurde. Die in Ampullen abgefüllten Produkte der wässrigen Injektions-Zubereitung, die das lösliche Thrombomodulin enthält, wurden durch Abfüllen von jeweils 2 ml der vorstehend erhaltenen, wässrigen Lösung in Ampullen von 2 ml Fassungsvermögen und durch Verschließen der Ampullen hergestellt (Anteil des Gasraumes = 35 %).

Eine wässrige Lösung wurde hergestellt, indem die Konzentration des löslichen Thrombomodulins von Referenzbeispiel 7 auf 1 mg/ml und die Konzentration der Natriumphosphat-Pufferlösung auf 2 mM eingestellt wurden, wozu NaCl und Polysorbat 80 (Tween 80) gegeben wurden, so dass deren Konzentrationen auf 150 mM bzw. 0,01 % eingestellt wurden, worauf der pH-Wert der Lösung auf 5,0 eingestellt wurde. Die in Ampullen abgefüllten Produkte der wässrigen Injektions-Zubereitung, welche das lösliche Thrombomodulin enthält, wurden durch Abfüllen von jeweils 2 ml der vorstehend erhaltenen, wässrigen Lösung in Ampullen von 2 ml Fassungsvermögen und durch Verschließen der Ampullen hergestellt (Anteil des Gasraumes = 35 %).

Eine wässrige Lösung wurde hergestellt, indem die Konzentration des löslichen Thrombomodulins von Referenzbeispiel 7 auf 1 mg/ml eingestellt wurde, und die Konzentrationen der Natriumphosphat-Pufferlösung und der Natriumacetat-Pufferlösung auf 20 mM bzw. 20 mM eingestellt wurden, wozu NaCl und Polysorbat 80 (Tween 80) gegeben wurden, so dass deren Konzentrationen auf 150 mM bzw. 0,01 % eingestellt wurden, worauf der pH-Wert der Lösung auf 7,0 eingestellt wurde. Die in Ampullen abgefüllten Produkte der wässrigen Injektions-Zubereitung, welche das lösliche Thrombomodulin enthält, wurden durch Abfüllen von jeweils 2 ml der vorstehend erhaltenen, wässrigen Lösung in Ampullen von 2 ml Fassungsvermögen und durch Verschließen der Ampullen hergestellt (Anteil des Gasraumes = 35 %).

Eine wässrige Lösung wurde hergestellt, indem die Konzentration des löslichen Thrombomodulins von Referenzbeispiel 7 auf 1 mg/ml eingestellt wurde, und die Konzentrationen der Natriumphosphat-Pufferlösung und der Natriumacetat-Pufferlösung auf 20 mM bzw. 20 mM eingestellt wurden, wozu NaCl und Polysorbat 80 (Tween 80) gegeben wurden, so dass deren Konzentrationen auf 150 mM bzw. 0,01 % eingestellt wurden, worauf der pH-Wert der Lösung auf 6,5 eingestellt wurde. Die in Ampullen abgefüllten Produkte der wässrigen Injektions-Zubereitung, welche das lösliche Thrombomodulin enthält, wurden durch Abfüllen von jeweils 2 ml der vorstehend erhaltenen, wässrigen Lösung in Ampullen von 2 ml Fassungsvermögen und durch Verschließen der Ampullen hergestellt (Anteil des Gasraumes = 35 %).

Eine wässrige Lösung wurde hergestellt, indem die Konzentration des löslichen Thrombomodulins von Referenzbeispiel 7 auf 1 mg/ml eingestellt wurde, und die Konzentrationen der Natriumphosphat-Pufferlösung und der Natriumacetat-Pufferlösung auf 20 mM bzw. 20 mM eingestellt wurden, wozu NaCl und Polysorbat 80 (Tween 80) gegeben wurden, so dass deren Konzentrationen auf 150 mM bzw. 0,01 % eingestellt wurden, worauf der pH-Wert der Lösung auf 6,0 eingestellt wurde. Die in Ampullen abgefüllten Produkte der wässrigen Injektions-Zubereitung, welche das lösliche Thrombomodulin enthält, wurden durch Abfüllen von jeweils 2 ml der vorstehend erhaltenen, wässrigen Lösung in Ampullen von 2 ml Fassungsvermögen und durch Verschließen der Ampullen hergestellt (Anteil des Gasraumes = 35 %).

Eine wässrige Lösung wurde hergestellt, indem die Konzentration des löslichen Thrombomodulins von Referenzbeispiel 7 auf 1 mg/ml eingestellt wurde, und die Konzentrationen der Natriumphosphat-Pufferlösung und der Natriumacetat-Pufferlösung auf 20 mM bzw. 20 mM eingestellt wurden, wozu NaCl und Polysorbat 80 (Tween 80) gegeben wurden, so dass deren Konzentrationen auf 150 mM bzw. 0,01 % eingestellt wurden, worauf der pH-Wert der Lösung auf 5,5 eingestellt wurde. Die in Ampullen abgefüllten Produkte der wässrigen Injektions-Zubereitung, welche das lösliche Thrombomodulin enthält, wurden durch Abfüllen von jeweils 2 ml der vorstehend erhaltenen, wässrigen Lösung in Ampullen von 2 ml Fassungsvermögen und durch Verschließen der Ampulle hergestellt (Anteil des Gasraumes = 35 %).

Eine wässrige Lösung wurde hergestellt, indem die Konzentration des löslichen Thrombomodulins von Referenzbeispiel 7 auf 1 mg/ml eingestellt wurde, und die Konzentrationen der Natriumphosphat-Pufferlösung und der Natriumacetat-Pufferlösung auf 20 mM bzw. 20 mM eingestellt wurden, wozu NaCl und Polysorbat 80 (Tween 80) gegeben wurden, so dass deren Konzentrationen auf 150 mM bzw. 0,01 % eingestellt wurden, worauf der pH-Wert der Lösung auf 5,0 eingestellt wurde. Die in Ampullen abgefüllten Produkte der wässrigen Injektions-Zubereitung, welche das lösliche Thrombomodulin enthält, wurden durch Abfüllen von jeweils 2 ml der vorstehend erhaltenen, wässrigen Lösung in Ampullen von 2 ml Fassungsvermögen und durch Verschließen der Ampullen hergestellt (Anteil des Gasraumes = 35 %).

Eine wässrige Lösung wurde hergestellt, indem die Konzentration des löslichen Thrombomodulins von Referenzbeispiel 7 auf 1 mg/ml und die Konzentration der Natriummalonat-Pufferlösung auf 20 mM eingestellt wurden, wozu NaCl und Polysorbat 80 (Tween 80) gegeben wurden, so dass deren Konzentrationen auf 150 mM bzw. 0,01% eingestellt wurden, worauf der pH-Wert der Lösung auf 6,0 eingestellt wurde. Die in Ampullen abgefüllten Produkte der wässrigen Injektions-Zubereitung, welche das lösliche Thrombomodulin enthält, wurden durch Abfüllen von jeweils 2 ml der vorstehend erhaltenen, wässrigen Lösung in Ampullen von 2 ml Fassungsvermögen und durch Verschließen der Ampullen hergestellt (Anteil des Gasraumes = 35 %).

Eine wässrige Lösung wurde hergestellt, indem die Konzentration des löslichen Thrombomodulins von Referenzbeispiel 7 auf 1 mg/ml und die Konzentration der Natriumsuccinat-Pufferlösung auf 20 mM eingestellt wurden, wozu NaCl und Polysorbat 80 (Tween 80) gegeben wurden, so dass deren Konzentrationen auf 150 mM bzw. 0,01 % eingestellt wurden, worauf der pH-Wert der Lösung auf 6,0 eingestellt wurde. Die in Ampullen abgefüllten Produkte der wässrigen Injektions-Zubereitung, welche das lösliche Thrombomodulin enthält, wurden durch Abfüllen von jeweils 2 ml der vorstehend erhaltenen, wässrigen Lösung in Ampullen von 2 ml Fassungsvermögen und durch Verschließen der Ampullen hergestellt (Anteil des Gasraumes = 35 %).

Eine wässrige Lösung wurde hergestellt, indem die Konzentration des löslichen Thrombomodulins von Referenzbeispiel 7 auf 1 mg/ml und die Konzentration der Natriumglutarat-Pufferlösung auf 20 mM eingestellt wurden, wozu NaCl und Polysorbat 80 (Tween 80) gegeben wurden, so dass deren Konzentrationen auf 150 mM bzw. 0,01 % eingestellt wurden, worauf der pH-Wert der Lösung auf 6,0 eingestellt wurde. Die in Ampullen abgefüllten Produkte der wässrigen Injektions-Zubereitung, welche das lösliche Thrombomodulin enthält, wurden durch Abfüllen von jeweils 2 ml der vorstehend erhaltenen, wässrigen Lösung in Ampullen von 2 ml Fassungsvermögen und durch Verschließen der Ampullen hergestellt (Anteil des Gasraumes = 35 %).

Eine wässrige Lösung wurde hergestellt, indem die Konzentration des löslichen Thrombomodulins von Referenzbeispiel 7 auf 1 mg/ml und die Konzentration der Natriumtartrat-Pufferlösung auf 20 mM eingestellt wurden, wozu NaCl und Polysorbat 80 (Tween 80) gegeben wurden, so dass deren Konzentrationen auf 150 mM bzw. 0,01 % eingestellt wurden, worauf der pH-Wert der Lösung auf 6,0 eingestellt wurde. Die in Ampullen abgefüllten Produkte der wässrigen Injektions-Zubereitung, welche das lösliche Thrombomodulin enthält, wurden durch Abfüllen von jeweils 2 ml der vorstehend erhaltenen, wässrigen Lösung in Ampullen von 2 ml Fassungsvermögen und durch Verschließen der Ampullen hergestellt (Anteil des Gasraumes = 35 %).

Eine wässrige Lösung wurde hergestellt, indem die Konzentration des löslichen Thrombomodulins von Referenzbeispiel 7 auf 1 mg/ml und die Konzentration der Natriumfumarat-Pufferlösung auf 20 mM eingestellt wurden, wozu NaCl und Polysorbat 80 (Tween 80) gegeben wurden, so dass deren Konzentrationen auf 150 mM bzw. 0,01 % eingestellt wurden, worauf der pH-Wert der Lösung auf 6,0 eingestellt wurde. Die in Ampullen abgefüllten Produkte der wässrigen Injektions-Zubereitung, welche das lösliche Thrombomodulin enthält, wurden durch Abfüllen von jeweils 2 ml der vorstehend erhaltenen, wässrigen Lösung in Ampullen von 2 ml Fassungsvermögen und durch Verschließen der Ampullen hergestellt (Anteil des Gasraumes = 35 %).

Eine wässrige Lösung wurde hergestellt, indem die Konzentration des löslichen Thrombomodulins von Referenzbeispiel 7 auf 1 mg/ml und die Konzentration der Natriummalat-Pufferlösung auf 20 mM eingestellt wurden, wozu NaCl und Polysorbat 80 (Tween 80) gegeben wurden, so dass deren Konzentrationen auf 150 mM bzw. 0,01 % eingestellt wurden, worauf der pH-Wert der Lösung auf 6,0 eingestellt wurde. Die in Ampullen abgefüllten Produkte der wässrigen Injektions-Zubereitung, welche das lösliche Thrombomodulin enthält, wurden durch Abfüllen von jeweils 2 ml der vorstehend erhaltenen, wässrigen Lösung in Ampullen von 2 ml Fassungsvermögen und durch Verschließen der Ampullen hergestellt (Anteil des Gasraumes = 35 %).

Eine wässrige Lösung wurde hergestellt, indem die Konzentration des löslichen Thrombomodulins von Referenzbeispiel 7 auf 1 mg/ml und die Konzentration der Natriumpropionat-Pufferlösung auf 20 mM eingestellt wurden, wozu NaCl und Polysorbat 80 (Tween 80) gegeben wurden, so dass deren Konzentrationen auf 150 mM bzw. 0,01 % eingestellt wurden, worauf der pH-Wert der Lösung auf 6,0 eingestellt wurde. Die in Ampullen abgefüllten Produkte der wässrigen Injektions-Zubereitung, welche das lösliche Thrombomodulin enthält, wurden durch Abfüllen von jeweils 2 ml der vorstehend erhaltenen, wässrigen Lösung in Ampullen von 2 ml Fassungsvermögen und durch Verschließen der Ampullen hergestellt (Anteil des Gasraumes = 35 %).

Eine wässrige Lösung wurde hergestellt, indem die Konzentration des löslichen Thrombomodulins von Referenzbeispiel 7 auf 1 mg/ml und die Konzentration der Natriumcitrat-Pufferlösung auf 20 mM eingestellt wurden, wozu NaCl und Polysorbat 80 (Tween 80) gegeben wurden, so dass deren Konzentrationen auf 150 mM bzw. 0,01 % eingestellt wurden, worauf der pH-Wert der Lösung auf 6,0 eingestellt wurde. Die in Ampullen abgefüllten Produkte der wässrigen Injektions-Zubereitung, welche das lösliche Thrombomodulin enthält, wurden durch Abfüllen von jeweils 2 ml der vorstehend erhaltenen, wässrigen Lösung in Ampullen von 2 ml Fassungsvermögen und durch Verschließen der Ampullen hergestellt (Anteil des Gasraumes = 35 %).

Eine wässrige Lösung wurde hergestellt, indem die Konzentration des löslichen Thrombomodulins von Referenzbeispiel 7 auf 1 mg/ml eingestellt wurde, und die Konzentrationen der Natriumphosphat-Pufferlösung und der Natriumpropionat-Pufferlösung auf 20 mM bzw. 20 mM eingestellt wurden, wozu NaCl und Polysorbat 80 (Tween 80) gegeben wurden, so dass deren Konzentrationen auf 150 mM bzw. 0,01 % eingestellt wurden, worauf der pH-Wert der Lösung auf 6,0 eingestellt wurde. Die in Ampullen abgefüllten Produkte der wässrigen Injektions-Zubereitung, welche das lösliche Thrombomodulin enthält, wurden durch Abfüllen von jeweils 2 ml der vorstehend erhaltenen, wässrigen Lösung in Ampullen von 2 ml Fassungsvermögen und durch Verschließen der Ampullen hergestellt (Anteil des Gasraumes = 35 %).