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Dokumentenidentifikation DE102004017483B4 03.01.2008
Titel Verfahren zur Isolierung adulter Stammzellen aus differenziertem Gewebe
Anmelder Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V., 80686 München, DE
Erfinder Kruse, Charli, Dr., 23923 Herrnburg, DE
Vertreter v. Bezold & Partner, 80799 München
DE-Anmeldedatum 08.04.2004
DE-Aktenzeichen 102004017483
Offenlegungstag 03.11.2005
Veröffentlichungstag der Patenterteilung 03.01.2008
Veröffentlichungstag im Patentblatt 03.01.2008
IPC-Hauptklasse C12N 5/06(2006.01)A, F, I, 20051017, B, H, DE
IPC-Nebenklasse C12N 5/08(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, DE   

Beschreibung[de]

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolierung adulter Stammzellen aus differenziertem Gewebe.

Hintergrund der Erfindung

Als Stammzellen werden solche Zellen bezeichnet, welche die Fähigkeit besitzen, sich unbegrenzt zu teilen und sich unter geeigneten Umständen bzw. durch geeignete Stimuli in verschiedene Zellarten differenzieren zu können. Stammzellen besitzen das Potenzial, sich in Zellen mit charakteristischer Gestalt und spezialisierten Funktionen zu entwickeln.

Es besteht die allgemeine Ansicht, dass mit der Entwicklung von der befruchteten Eizelle über das embryonale Stadium bis zum adulten Organismus die Potenz der Stammzellen abnimmt. Dieser Eigenschaft entsprechend wird die befruchtete Eizelle als totipotent, embryonale Stammzellen als pluripotent und adulte Stammzellen als multipotent bezeichnet. In den letzten Jahren musste diese Ansicht zumindest teilweise korrigiert werden, da einige Untersuchungen mit adulten Stammzellen ein deutlich höheres Differenzierungsvermögen als bisher angenommen belegen (siehe z.B. WO 02/064748 und WO 02/057430).

WO 02/057430 offenbart adulte Stammzellen aus Darmepithelgewebe, die als pluripotent beschrieben werden und zur Kultivierung eine Feederzellschicht aus Fibroblasten benötigen.

WO 00/78929 und PNAS, 2005, Bd. 97, Nr. 14., S. 7999–8004, Bonner-Weir et al., offenbaren adulte Stammzellen aus Pankreasgewebe, die zwar als pluripotent bezeichnet werden, tatsächlich jedoch nur in die verschiedenen Zelltypen des Pankreas, die von einem einzigen Keimblatt, dem Entoderm, abgeleitet sind, differenzieren können.

In Anbetracht der ethischen Bedenken bezüglich embryonaler Stammzellen wuchs damit das Interesse an neuen adulten Stammzellen mit möglichst großem Differenzierungspotenzial und Eigenschaften, die denjenigen der embryonalen Stammzellen nahekommen.

Allerdings sind die bisher angewandten Verfahren zur Identifizierung, Isolierung und Kultivierung von Stammzellen häufig sehr arbeitsaufwendig, erfordern die Kultivierung mit Feederzellen (WO 02/057430) oder komplexen Medien mit Zusätzen von Wachstumsfaktoren und gewöhnlich das Vorhandensein oder die Einführung von Markern in die Zellen, um die mutmaßlichen Stammzellen von anderen Zellen unterscheiden zu können (WO 02/057430 und WO 02/064748).

Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, neue und besonders einfache Verfahren zur Isolierung und Kultivierung von adulten Stammzellen bereitzustellen.

Diese Aufgabe wird in der vorliegenden Erfindung gelöst durch das Verfahren zur Isolierung und Kultivierung von adulten Stammzellen aus differenziertem Gewebe gemäß Anspruch 1 dieser Anmeldung.

Beschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung beruht auf dem überraschenden Befund, dass durch schonende Entnahme, Aufarbeitung und Kultivierung von differenziertem Gewebe mit einem Gehalt an Stammzellen unter geeigneten Bedingungen eine Trennung von differenziertem Gewebe und adulten Stammzellen dadurch erreicht werden kann, dass das differenzierte Gewebe unter den gewählten Kulturbedingungen im Verlauf einiger Tage abstirbt und die adulten Stammzellen in Kultur verbleiben und sich weiter vermehren. Ein wichtiger Vorteil des Verfahrens liegt insbesondere darin, dass auf überraschend einfache Weise hochreine Stammzellpopulationen gewonnen werden können.

Konkreter ist das erfindungsgemäße Verfahren zur Isolierung von adulten Stammzellen aus differenziertem Gewebe gemäß Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass das Gewebe so schonend zerkleinert wird, dass die Zellverbände in den resultierenden Gewebestückchen weitgehend erhalten bleiben, und das zerkleinerte Gewebe zunächst unter geeigneten Bedingungen in Gewebekulturgefäßen kultiviert wird, wobei der Großteil der differenzierten Zellen schnell im Verlauf weniger Tage abstirbt und sich von den Stammzellen löst, wonach die Stammzellen sich am Boden der Gewebekulturgefäßes festsetzen, und das restliche Gewebe und nicht-adhärente differenzierte Zellen zum Beispiel durch mindestens einen ersten Mediumwechsel weitgehend abgetrennt werden, und ggf. durch weitere Mediumwechsel in Abständen von wenigen Tagen, vorzugsweise etwa etwa 2–3 Tagen, restliche nicht-adhärente Zellen abgetrennt werden.

Das als Ausgangsmaterial verwendete differenzierte Gewebe stammt vorzugsweise von einem Wirbeltier, z.B. einem Fisch, Amphibium, Reptil, Vogel oder Säuger, besonders bevorzugt von einem Primaten, insbesondere einem Menschen.

Dieses Gewebe kann von einem erwachsenen Organismus, juvenilen Organismus oder nicht-humanen fötalen Organismus, vorzugsweise einem post-natalen Organismus, stammen. Der Begriff "adult", wie in der vorliegenden Anmeldung verwendet, bezieht sich somit auf das Entwicklungsstadium des Ausgangsgewebes und nicht auf dasjenige des Donororganismus, aus dem das Gewebe stammt. "Adulte" Stammzellen sind nicht-embryonale Stammzellen.

Vorzugsweise wird das differenzierte Gewebe aus einem Gewebe mit hoher Erneuerungsrate, z.B. Gewebe mit hohem Vigilingehalt, gastro-intestinalem Gewebe, einschließlich Pankreas, Leber, endokrinem oder exokrinem Drüsengewebe, isoliert. Das Drüsengewebe stammt vorzugsweise aus einer Speicheldrüse, Tränendrüse, Schweißdrüse, Talgdrüse, Drüse des Genitaltrakts, einschließlich Prostata, oder aus gastro-intestinalem Gewebe. Besonders bevorzugt stammt das Drüsengewebe aus dem Pankreas oder einer Speicheldrüse, z.B. der Ohrspeicheldrüse oder Unterkieferspeicheldrüse. In einer Ausführungsform handelt es sich dabei um exokrines Gewebe, insbesondere acinäres Gewebe. Aus diesem exokrinen Gewebe konnten sogar pluripotente adulte Stammzellen isoliert werden.

Die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren bereitgestellten Stammzellen sind leicht zu isolieren und in einer stabilen Langzeitkultur ohne Feederzellschicht oder spezielle Zusätze im undifferenzierten Zustand zu halten. Der Begriff Feederzellen, wie in der vorliegenden Anmeldung verwendet, umfasst alle Zellen, die das Wachstum der eigentlich zu kultivierenden Zellen dadurch fördern, dass sie Wachstumsfaktoren freisetzen und/oder eine extrazelluläre Matrix bereitstellen, bzw. die Differenzierung verhindern.

Figurenbeschreibung

1 zeigt schematisch verschiedene Einzelschritte des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Isolierung und Kultivierung von adulten Stammzellen.

Die folgenden Beispiele dienen zur näheren Erläuterung der vorliegenden Erfindung, ohne diese jedoch darauf zu beschränken. Analoge Protokolle sind für eine Vielzahl von Geweben und Donororganismen, einschließlich des Menschen, anwendbar.

Die allgemeinen Arbeitsanweisungen, wie sie für Verfahren zur Kultivierung von tierischen Zellen und insbesondere von Säugetierzellen gebräuchlich sind, sind zu beachten. Eine sterile Umgebung, in der das Verfahren durchgeführt werden soll, ist – auch wenn hierzu keine weitere Beschreibung erfolgt- in jedem Fall einzuhalten. Folgende Puffer und Medien wurden verwendet: HEPES-Stammlösung (pH 7,6) 2,3 83 g HEPES auf 100 ml A. bidest. HEPES-Eagle-Medium (pH 7,4) 90 ml Modified Eagle Medium (MEM) 10 ml HEPES-Stammlösung Isolationsmedium (pH 7,4) 32 ml HEPES-Eagle-Medium

8 ml 5% BSA in A. bidest.

300 &mgr;l 0,1 M CaC12

100 &mgr;l Trasylol (200.000 KIE)
Digestionsmedium (pH 7,4) 20 ml Isolationsmedium

4 ml Kollagenase (Kollagenase NB 8 von Serva)
Inkubationsmedium Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Nährmedium Duibecco's Modified Eagle Medium (DMEM)

DMEM + 4500 mg/l Glucose

+ L-Glutamin

– Pyruvat

+ 20% FKS (inaktiviert) + 1 ml/100 ml Pen/Strep

(10000 E/10000 &mgr;g/ml)

oder

DMEM + 10% Eigenplasma + 1 ml/100 ml

Pen/Strep,

vor Gebrauch auf 37°C erwärmen

Statt fötalem Kalbserum (FKS) im Nährmedium kann gegebenenfalls auch Eigenplasma oder, weniger bevorzugt, Eigenserum des Gewebedonors verwendet werden. Dies ist insbesondere dann von Bedeutung, wenn der Gewebedonor mit dem späteren Empfänger der Stammzellen oder davon abgeleiteten differenzierten Zellen identisch ist. Eine solche autologe Behandlung ist zur Verhinderung einer eventuellen Abstoßungsreaktion bevorzugt.

Das Nährmedium kann als Basismedium statt des verwendeten DMEM-Mediums auch ein anderes für die Kultivierung von eukaryotischen Zellen, insbesondere Säugerzellen, bekanntes, geeignetes Basismedium enthalten, in dem die differenzierten Zellen absterben und sich die gewünschten Stammzellen vermehren. Auch Isolationsmedium, Inkubationsmedium und Differenzierungsmedium können ein anderes übliches und geeignetes Basismedium enthalten.

BEISPIEL 1

Pankreas-Acini wurden von männlichen Sprague-Dawley-Ratten (20–300 g) erhalten, die narkotisiert (CO2) und über die dorsale Aorta ausgeblutet worden waren. Eine Kanüle wurde trasduodenal in den Pankreasgang eingeführt und dem Pankreas wurde von hinten 10 ml Digestionsmedium, enthaltend HEPES-Eagle-Medium (pH 7,4), 0,1 mM HEPES-Puffer (pH, 7,6), 70% (Vol./Vol.) modifiziertes Eagle-Medium, 0,5% (Vol./Vol.) Trasylol (Bayer AG, Leverkusen, Deutschland), 1% (Gew./Vol.) Rinderserumalbumin), 2,4 mM CaCl2 und Kollagenase (0,63 P/mg, Serva, Heidelberg, Deutschland) injiziert.

Vor der Entfernung wurde der Pankreas von anhaftendem Festgewebe, Lymphknoten und Blutgefäßen teilweise befreit. Dann wurde gesundes Pankreasgewebe in Digestionsmedium abgeholt (bei 20°C, geringerer Stoffwechsel), das Pankreasgewebe mit einer Schere sehr fein zerkleinert, oben schwimmendes Fettgewebe abgesaugt und die Gewebesuspension mit Carbogen (Messer, Krefeld, Deutschland) begast, ohne dass die Düse in das Medium mit den Zellen gelangt (Verringerung von mechanischem Streß) und damit auf pH 7,4 eingestellt. Danach wurde die Suspension in einem 25-ml-Erlenmeyerkolben (mit Alufolie bedeckt) unter konstantem Schütteln (150–200 Zyklen pro Minute) bei 37°C in 10 ml Digestionsmedium inkubiert. Nach 15–20 Minuten wurde das oben schwimmende Fett und das Medium abgesaugt und das Gewebe wurde erneut zerkleinert und mit Medium ohne Kollagenase gespült (Vorgang mindestens zweimal wiederholen, vorzugsweise solange bis Zellfraktion transparent), worauf Digestionsmedium zugegeben und erneut etwa 1 Minute lang mit Carbogen begast wurde. Es folgte wiederum eine Digestion mit Kollagenase für 15 Minuten bei 37°C im Schüttler unter Verwendung desselben Puffers. Nach der Digestion wurden die Acini durch sukzessives Hochziehen und Ausstossen durch 10 ml-, 5 ml- und 2 ml-Glaspipetten mit engen Öffnungen dissoziiert und durch ein einlagiges Nylonsieb (Polymon PES-200/45, Angst & Pfister AG, Zürich, Schweiz) mit einer Maschengröße von etwa 250 &mgr;m filtriert. Die Acini wurden zentrifugiert (bei 37°C und 600–800 UpM in einer Beckman-GPR-Zentrifuge, entspricht zwischen 50 und 100 g) und weiter gereinigt durch Waschen in Inkubationsmedium, enthaltend 24,5 mM HEPES (pH 7,5), 96 mM NaCl, 6 mM KCl, 1 mM MgCl2, 2,5 mM NaH2PO4, 0, mM CaCl2, 11,5 mM Glucose, 5 mM Natriumpyruvat, 5 mM Natriumglutamat, 5 mM Natriumfumarat, 1% (Vol./Vol.) modifiziertes Eagle-Medium, 1% (Gew./Vol.) Rinderserumalbumin, mit Carbogen äquilibriert und auf pH 7,4 eingestellt. Die Waschprozedur (Zentrifugation, Absaugen, Resuspension) wurde fünfmal wiederholt. Soweit nicht anders angegeben, wird bei der obigen Isolierung bei etwa 20°C gearbeitet.

Die Acini wurden in Inkubationsmedium resuspendiert und bei 37°C in einer angefeuchten Atmosphäre mit 5% CO2 kultiviert. Das acinäre Gewebe starb dabei schnell (innerhalb von zwei Tagen) ab und die sterbenden differenzierten Zellen lösten sich dabei von den benachbarten Zellen, ohne diese zu schädigen (schonende Isolierung), die nicht absterbenden Stammzellen sanken zu Boden und hefteten sich an. Die differenzierten Acinizellen sind dazu nicht in der Lage. Das Inkubationsmedium wurde am zweiten oder dritten Tag nach dem Aussäen erstmals gewechselt, wobei ein Großteil der frei schwimmenden Acini und acinären Zellen entfernt wurde. Zu diesem Zeitpunkt hatten sich die ersten Stammzellen bzw. deren Vorläufer am Boden festgesetzt und begannen sich zu teilen. Der Mediumwechsel wurde danach an jedem dritten Tag wiederholt und differenzierte acinäre Pankreaszellen wurden bei jedem Mediumwechsel entfernt.

Am siebenten Tag in Kultur wurden die Zellen mit einer Lösung bestehend aus 2 ml PBS, 1 ml Trypsin (+ 0,05 EDTA) und 2 ml Inkubationsmedium passagiert. Dabei lösen sich die Zellen vom Boden der Kulturschale. Die Zellsuspension wurde 5 Minuten bei etwa 1000 UpM (Beckmann GPR-Zentrifuge) zentrifugiert, der Überstand abgesaugt und die Zellen in 2 ml Inkubationsmedium resuspendiert, auf eine mittlere Zellkulturflasche überführt und 10 ml Inkubationsmedium dazugegeben.

Am vierzehnten Tag in Kultur wurden die Zellen erneut, aber diesmal mit 6 ml PBS, 3 ml Trypsin/EDTA und 6 ml Inkubationsmedium, passagiert. Die Zellsuspension wird 5 Minuten bei 1000 UpM zentrifugiert, der überstand abgesaugt und die Zellen in 6 ml Inkubationsmedium resuspendiert, auf 3 mittlere Zellkulturflaschen überführt und jeweils 10 ml Inkubationsmedium dazugegeben.

Am Tag 17 erfolgte ein drittes Passagieren auf insgesamt 6 mittlere Zellkulturflaschen und am Tag 24 ein viertes Passagieren auf insgesamt 12 mittlere Zellkulturflaschen. Spätestens jetzt waren alle primären Zellen bis auf die Stammzellen aus der Zellkultur entfernt.

Die Stammzellen können weiter kultiviert werden und so oft passagiert und ausgesät wie gewünscht. Das Aussäen erfolgt vorzugsweise jeweils in einer Dichte von 2–4 × l05 Zellen/cm2 in Inkubationsmedium.

BEISPIEL 2

Die Isolierung und Kultivierung aus Gewebe der Ohrspeicheldrüse erfolgte analog dem Pankreas-Protokoll mit den folgenden Abweichungen:

  • 1. Das Ohrspeicheldrüsengewebe war eine Mischung von acinärem Gewebe und tubulösem Gewebe.
  • 2. Nachdem Speicheldrüsen weniger Proteasen und Amylasen als Pankreas enthalten, ist es möglich, das Speicheldrüsengewebe vor der Aufarbeitung einige Zeit im Kühlschrank bei etwa 4°C aufzubewahren, ohne dass das Gewebe zu sehr geschädigt wird. Im konkreten Beispielsfall betrug die Aufbewahrungszeit 15 h und brachte keine nachteiligen Folgen für die Isolierung der gewünschten Stammzellen mit sich.

BEISPIEL 3

Zur Isolierung und Kultivierung von humanen adulten Stammzellen wurde humanes Gewebe von erwachsenen Patienten unmittelbar nach einem chirurgischen Eingriff erhalten und sofort aufgearbeitet. Aus dem chirurgisch entfernten Gewebe, z.B. Pankreas- oder Speicheldrüsengewebe, wurde gesundes Gewebe abgetrennt und in Digestionsmedium aufgenommen. Dieses Gewebe wurde dann analog dem für die Ratte beschriebenen Protokoll aufgearbeitet und die Stammzellen in analoger Weise isoliert und kultiviert.

Falls die Stammzellen später für therapeutische Zwecke genutzt werden sollen, sind aus Sicherheitsgründen noch verschiedene Bedingungen zu erfüllen, um eine Gefährdung des zu behandelnden Patienten auszuschließen, insbesondere:

  • – Verwendung von humanem Serum, vorzugsweise Eigenplasma des Patienten, an Stelle von FKS, erforderlichenfalls Aufreinigung des Serums bzw. Plasmas
  • – Ausschluss jeder tierischen Quelle von weiteren Medienzusätzen
  • – höchste Reinheit aller Substanzen, Sterilität von Geräten und Umgebung
  • – Sterilität und Reinheit der Stammzellkultur durch mehrmaliges Passagieren der Stammzellen und Kontrolle auf Kontamination durch Mycoplasmen oder andere Mikrorganismen
  • – sorgfältige Überprüfung des Ausgangsgewebes und der Stammzellen auf Tumorgenizität.


Anspruch[de]
Verfahren zur Isolierung von adulten Stammzellen aus differenziertem Gewebe, dadurch gekennzeichnet, dass

– das Gewebe so schonend zerkleinert wird, dass die Zellverbände in den resultierenden Gewebestückchen weitgehend erhalten bleiben, und

– das zerkleinerte Gewebe zunächst in Gewebekulturgefäßen kultiviert wird, wobei der Großteil der differenzierten Zellen abstirbt und sich von den Stammzellen löst, wonach die Stammzellen sich am Boden der Gewebekulturgefäßes festsetzen, und

– das restliche Gewebe und nicht-adhärente differenzierte Zellen abgetrennt werden.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den verwendeten Isolations- und Kulturmedien um Medien auf der Basis von Modified Eagle Medium (MEM) handelt. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Nährmedium fötales Kalbsserum oder Eigenplasma des Gewebedonors enthält. Verfahren nach einem der Ansprüche 1–3, dadurch gekennzeichnet, dass das Gewebe von einem Wirbeltier, vorzugsweise einem Säuger, stammt. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Gewebe von einem Primaten, insbesondere einem Menschen, stammt. Verfahren nach einem der Ansprüche 1–5, dadurch gekennzeichnet, dass das differenzierte Gewebe ein Gewebe mit hoher Erneuerungsrate ist. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass das differenzierte Gewebe ein Gewebe mit hohem Vigilingehalt, gastro-intestinales Gewebe, einschließlich Pankreas, Leber oder endokrines oder exokrines Drüsengewebe ist. Verfahren nach einem der Ansprüche 1–7, dadurch gekennzeichnet, dass das Gewebe aus einer Speicheldrüse, Tränendrüse, Schweißdrüse, Talgdrüse oder aus dem Pankreas stammt. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Gewebe aus der Ohrspeicheldrüse oder Unterkieferspeicheldrüse stammt. Pluripotente Stammzellen, die in Zellen aller drei Keim blätter differenzieren können, erhalten aus exokrinem Drüsengewebe nach dem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1–5. Stammzellen, erhalten aus differenziertem Gewebe, das aus einer Speicheldrüse, Tränendrüse, Schweißdrüse oder Talgdrüse stammt, nach dem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1–5. Stammzellen nach Anspruch 11, wobei das differenzierte Gewebe aus der Ohrspeicheldrüse oder Unterkieferspeicheldrüse stammt. Stammzellkultur, umfassend die Stammzellen nach einem der Ansprüche 10 bis 12 in einem Kulturmedium, welches die stabile Aufrechterhaltung und Vermehrung der Zellen im wesentlichen ohne Differenzierung erlaubt. Stammzellkultur nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Kulturmedium keine Feederzellschicht umfasst.






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