Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine Vorrichtung und ein Verfahren zum Behandeln eines Proteinkristalls mit einer Flüssigkeit und insbesondere auf eine Vorrichtung und ein Verfahren zum Einbringen von Liganden und/oder Inhibitoren in eine Proteinkristallstruktur.

In der Proteinkristallographie kommt es häufig vor, daß vor der kristallographischen Messung Liganden oder Inhibitoren in eine Proteinstruktur bzw. einen Proteinkristall eingebracht werden sollen. Ziel ist es dabei, die kristallographische Struktur eines Proteins ohne und mit Ligand oder Inhibitor zu vergleichen und die räumliche Anordnung des Liganden oder Proteins zu ermitteln. Liganden können hierbei alle an eine Protein oder Polypeptid bindenden Moleküle oder Substanzen sein, die bspw. inhibitorische Wirkung oder auch agonistische Wirkung auf die Funktion des Proteins haben können. Ggf. können Liganden organisch-chemische Moleküle sein oder auch (modifizierte) Antikörper oder Antikörperfragmente, native Bindungspartner oder Fragmente, ggf. modifiziert, vom kristallisierten Protein. Weiterhin werden regelmäßig auch Schwermetallatom-Derivate in der Proteinkristallographie benötigt, um die entsprechende Phaseninformationen zu erhalten. Ein Ligand i.S. der vorliegenden Erfindung kann daher auch ein an das kristallisierte Protein bindendes Schwermetallatom(salz) sein.

Folgende Druckschriften aus dem Stand der Technik sind bekannt:

DE 33 31 816 A1 betrifft eine Ätzvorrichtung für Metall- und Halbleiterscheiben, die einen Aufnahmebereich für Scheiben aufweist sowie pneumatischen Zerstäuberdüsen einer Sprühdosen-Anordnung, die einen Ätznebel erzeugen können. Die Ätzvorrichtung kann bei der Herstellung von Drucksensoren aus Halbleiterscheiben angewendet werden.

In US 6,503,320 B1 wird eine Vorrichtung zur Blockierung eines Kältestroms von flüssigem Stickstoff, der in einem Verfahren zum Auftauen und erneuten Einfrieren eines Proteinkristalls erzeugt wird, offenbart.

US 6,408,047 B1 beschreibt ein automatisiertes Hochdurchsatz-Verfahren mittels eines Roboters zur röntgenkristallographischen Untersuchung von Proben.

US 5,737,385 A betrifft ein automatisiertes System für die Untersuchung von oberflächennahen Materialeigenschaften von Proben mittels Röntgendiffraktometrie. Das automatisierte System umfasst eine drehbare Probenhalterung, eine Vorrichtung, um die Proben mit chemischen Lösungen zu behandeln sowie eine Röntgenquelle.

In DE 199 00 346 A1 wird eine Präzisions-Probendrehvorrichtung an einem Diffraktometer offenbart, welches für Röntgen- bzw. Synchrotronstreuversuche verwendet werden kann.

DE 39 27 345 A1 betrifft ein Verfahren zur Strukturbestimmung eines Peptids, das mit einem Protein kovalent verknüpft ist, mittels Röntgenkristallographie oder Kernresonanzspektrokopie.

DE 197 27 437 A1 betrifft kristalline Schwermetall-Clusterverbindungen und deren kristallographische Daten sowie deren Verwendung in der Röntgenstrukturanalyse.

EP 1 172 646 A1 offenbart ein Verfahren zur Untersuchung des Kristallisationsverhaltens von Analyten unter verschiedenen Bedingungen mittels Röntgendiffraktometrie.

EP 1 308 542 A2 beschreibt eine Apparatur und ein Verfahren zur automatisierten Kristallisation von Proteinen. Proteinkristalle werden anschließend automatisch röntgenkristallographisch analysiert.

EP 1 353 166 A2 betrifft ein automatisiertes Verfahren, um die Kristallisation biologischer Proben mittels Röntgenkristallographie zu analysieren.

EP 1 338 684 A2 offenbart eine Apparatur und ein Verfahren, um ein Biopolymer, beispielsweise ein Protein, zu kristallisieren.

US 6,404,849 B1 beschreibt eine Apparatur und ein Verfahren, um einen Kristall an einer Halterung zu befestigen, den Kristall auszurichten und die Struktur des Kristalls röntgenkristallographisch zu bestimmen.

US 6,417,007 B1 betrifft das automatisierte Ernten von Proteinkristallen aus einer flüssigen Umgebung und das anschließende Schockgefrieren der geernteten Kristalle zur sicheren Aufbewahrung.

US 2003/0072683 A1 offenbart ein Matrix-Robotersystem zum Mischen und Verteilen von verschiedenen Stammlösungen in Lochplatten, um eine Kristallkernbildung zu induzieren.

US 2002/0142483 A1 betrifft Dispensiervorrichtungen zum Aufbringen von flüssigen Proben auf Substrate, die insbesondere zum Transport von Proben auf Mikroarrays sowie für massenspektrometrische Analysen geeignet sind. Mittels der beschriebenen Dispensiervorrichtungen können Tropfen im Nanoliter- oder Pikoliter-Maßstab auf Materialien auf der Substratoberfläche aufgebracht werden.

In US 2003/0049642 A1 wird eine Vorrichtung sowie ein Verfahren zum Screening der Kristallisationskernbildung beschrieben. Das dort offenbarte Verfahren umfasst die Bildung eines frei schwebenden Tropfens durch einen akustischen Levitator sowie das Aufbringen mindestens einer Substanz auf den frei schwebenden Tropfen mit einer piezoelektrischen Durchfluss-Dispensiervorrichtung sowie die anschließende Detektion einer Kristallisationskernbildungs-Tendenz.

US 2002/0191048 A1 betrifft Verfahren zur Optimierung der Protein-Kristallisation. Dazu werden durch akustische Deposition Flüssigkeitstropfen auf einer Substratoberfläche abgelegt.

Ein im Stand der Technik bekanntes Verfahren zum Einbringen von Liganden, bspw. Inhibitoren, ist das sogenannte „Soaking" mit einem Puffer, der aus der Kristallisationslösung sowie dem Liganden besteht. Falls ein in den Kristall zu „soakender" Ligand schlecht oder nur schwerlöslich sind, können dem Puffer zur Erhöhung der Löslichkeit desselben weitere Substanzen als Löslichkeitsverbesserer zugesetzt werden. Beispielsweise kann es sich um Lösungsmittel wie DMSO (Dimethylsulfoxid), TFE, Ethanol, 2-Nitropropan oder andere organische Lösungsmittel, insbesondere chlorierte Lösungsmittel, ggf. auch Emulgatoren handeln.

Das „Soaking"-Verfahren besitzt verschiedene Nachteile. So besteht ein Nachteil darin, daß die Kristalle beim „Soaking" einer anderen Umgebung ausgesetzt werden müssen, wodurch der Kristall Schaden erleiden kann, d.h. insbesondere, dass die Mikrostruktur des Kristalls nach dem „Soaking" Unregelmäßigkeiten aufweist, die das Diffraktionsvermögen des Kristalls beeinträchtigen. Sollen z.B. schwerlösliche Inhibitoren oder Liganden in die Proteinkristallstruktur eingebracht werden, so benötigt man sehr hohe Konzentrationen an Lösungsmittel. Gerade hohe Lösungsmittelkonzentrationen führen aber häufig zur Zerstörung der fragilen Proteinkristalle, wie zuvor erwähnt.

Darüber hinaus besteht ein weiterer Nachteil des herkömmlichen „Soaking"-Verfahrens in dem hohen Zeitaufwand des Verfahrens. Dieser ist zum einen durch die unter Umständen zahlreichen (repetitiven) „Soaking"-Prozesse bedingt, die, ggf. unter Veränderung der Konzentrationsverhältnisse des zu „soakenden" Liganden durchlaufen werden müssen, um überhaupt eine geeignete, die Liganden oder Inhibitoren enthaltende, also komplexierte Proteinkristallstruktur (Cokristall) zu erhalten, und zum anderen dadurch, daß bereits ein einzelner Soaking-Prozeß bereits sehr zeitaufwendig sein kann, da bspw. die Diffusionskinetik beachtet werden muß.

Ein weiterer Nachteil des „Soaking"-Verfahrens besteht darin, daß röntgenkristallographische Untersuchungen oder Untersuchungen des Proteinkristalls mit Synchrotronstrahlung während des „Soaking"-Verfahrens technisch nicht möglich sind.

Die Aufgabe der Erfindung besteht nun darin, eine Vorrichtung und ein Verfahren zur Behandlung eines Proteinkristalls mit einer Substanz zu schaffen, die im Vergleich zu bisherigen Vorrichtungen und Verfahren unter anderem eine schonendere Behandlung von Proteinkristallen und die einfachere und/oder effizientere Herstellung von komplexierten Proteinkristallen sowie die einfache Herstellung von bisher nur schwer oder überhaupt nicht herstellbaren komplexierten Proteinkristallen erlauben.

Diese Aufgabe wird durch eine Vorrichtung zum Behandeln eines Proteinkristalls mit einer Flüssigkeit mit einer Halterung zur Befestigung des Proteinkristalls und einem Mikrodosiersystem gelöst, das im Verhältnis zur Halterung so angeordnet ist, daß damit Mikro-Tropfen einer Flüssigkeit, die bspw. Lösungsmittel und mindestens einen Ligandentyp aufweist, auf den in der Halterung befestigten Proteinkristall aufgebracht werden können.

Durch das Auftropfen von Mikro-Tropfen mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung lässt sich eine wesentlich schonendere Behandlung von Proteinkristallen mit bestimmten aufzubringenden Substanzen, die in einer Lösung enthalten sind, erreichen. Diese Substanzen können Liganden, bspw. Inhibitoren, Substrate oder Reaktanden, sein. Bei den Liganden wird es sich typischerweise um Agonisten, Substrate oder Antagonisten der kristallisierten Proteine handeln.

Gemäß einer besonders vorteilhaften Ausgestaltung ist bei der erfindungsgemäßen Vorrichtung zum Behandeln eines Proteinkristalls mit mindestens einer Substanz die Kristallhalterung so ausgebildet, daß durch die Halterung ein Gasstrom geführt werden kann, der auf den in der Halterung befestigten Proteinkristall gerichtet ist. Dadurch kann der Proteinkristall während der Behandlung durch die Mikro-Tropfen in einer definierten Umgebung gehalten werden.

Falls die Substanz in der aufzutropfenden Flüssigkeit aus gelösten Liganden, bspw. Inhibitoren, besteht, die in die Kristallstruktur des Proteinkristalls eingebracht werden sollen, so kann dem Gasstrom auch gemäß einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform ein Lösungsvermittler (s. obige Ausführungen) beigemischt werden, der insbesondere bei schwerlöslichen Liganden die Diffusion durch den Proteinkristall bzw. die Bindung an die kristallisierten Proteine wesentlich erleichtern kann.

Es ist ferner besonders vorteilhaft, daß die erfindungsgemäße Vorrichtung auch auf einem Goniometerkopf im Röntgenstrahl oder in einem Synchrotron befestigt werden kann, so daß der zeitliche Ablauf der Veränderung der kristallisierten Proteinstruktur, z.B. infolge der Ligandenbindung während des Auftropfens der Mikro-Tropfen, im Meßgerät beobachtet werden kann.

Die Aufgabe der Erfindung wird ferner durch ein Verfahren zum Behandeln eines Proteinkristalls mit einer Flüssigkeit gelöst, bei dem der Proteinkristall befestigt wird und bei dem dann Mikro-Tropfen der Flüssigkeit, enthaltend eine Lösung und mindestens Liganden einer Art, auf den Proteinkristall aufgebracht werden.

Weitere vorteilhafte Ausführungen der erfindungsgemäßen Vorrichtung und des erfindungsgemäßen Verfahrens ergeben sich aus den abhängigen Ansprüchen.

Bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden nachfolgend unter Bezug auf die beiliegende Zeichnung näher erläutert. Es zeigen

1 eine teilweise im Schnitt dargestellte Ansicht einer Ausführungsform einer erfindungsgemäßen Vorrichtung zum Behandeln eines Proteinkristalls mit einer Lösung,

2 ein Gehäuse eines Steuergeräts zur Steuerung eines bei einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung verwendeten Mikrodosiersystems,

3 zeigt ein Flüssigkeitszufuhrsystem für ein Mikrodosiersystem, das bei einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung verwendet werden kann.

Die Erfindung wird im folgenden an der Behandlung von Proteinkristallen beschrieben.

1 zeigt eine erste Ausführungsform einer erfindungsgemäßen Vorrichtung zum Behandeln eines Proteinkristalls. Dabei ist links in der 1 eine Halterung 1 dargestellt, die dazu dient, einen Proteinkristall 2 zu befestigen. Die in der 1 dargestellte Halterung, die in ihrer generischen Art auch als „free mounting system" bezeichnet wird, ist bereits aus dem Stand der Technik bekannt und z.B. in der Deutschen Patentschrift DE 198 42 797 C1 beschrieben worden. Diese Druckschrift wird insoweit vollumfänglich in die Offenbarung der vorliegenden Anmeldung einbezogen.

Die Halterung 1, die in der 1 in einer Schnittansicht von der Seite dargestellt ist, besteht im wesentlichen aus einem Trägerblock 3, der ein einschiebbares Einsatzteil 4 aufweist, das in eine Öffnung des Trägerblocks 3 eingeschoben werden kann. Am Einsatzteil ist eine Haltekapillare 5 angebracht, an deren freiem Auflageende der Proteinkristall 2 gehalten wird. Die Haltekapillare besteht vorzugsweise aus einer Mikropipette, in der über eine in der 1 nicht dargestellte und mit dem anderen Ende der Mikropipette verbundene Pumpvorrichtung ein Unterdruck erzeugt wird, der dazu dient, den Proteinkristall 2 an dem freien Auflageende zu halten. Das linke Ende 8 des Einsatzteils ist so ausgebildet, daß daran die Halterung 1 an einem Goniometerkopf einer Röntgen- oder Synchrotronbestrahlungsanlage befestigt werden kann.

In einer Röntgen- oder Synchrotronbestrahlungsanlage kann die Beugung von Röntgenstrahlen beim Durchgang durch das Kristallgitter des Proteinkristalls ausgenutzt werden, um aus dem Beugungsbild auf die räumliche Anordnung der Atome und Moleküle in dem kristallisierten Protein zu schließen bzw. die Struktur durch mathematische Operationen zu errechnen. Die erforderlichen Röntgenstrahlen können z.B. durch Beschuß von Kupfer oder anderen Materialien mit Elektronen erzeugt werden (bspw. CuK&agr;-Strahlung). Alternativ kann die Röntgenstrahlung auch in einem Synchrotron, d.h. einem Teilchenbeschleuniger, erzeugt werden, bei dem die Röntgenstrahlung von auf Kreisbahnen beschleunigten Elektronen emittiert wird. Das Synchrotron besitzt trotz des größeren apparativen Aufwands eine Reihe von Vorteilen gegenüber der herkömmlichen Erzeugung von Röntgenstrahlung durch Elektronenbeschuß von Metallen. So besitzen die durch Synchrotrone erzeugten Röntgenstrahlen eine höhere Intensität und können in verschiedenen Wellenlängen gewählt werden. Auch besteht auf diese Weise die Möglichkeit, „weißes" Röntgenlicht einzusetzen und damit den Kristall mit Röntgenblitzen, die Röntgenstrahlen aller Wellenlängen aufweisen, zu beschießen.

Darüber hinaus lassen sich die Messungen mit dem Synchrotron wesentlich schneller als mit herkömmlichen Röntgenbestrahlungsanlagen durchführen.

In die Halterung 1 ist ferner ein Gaskanal 6 integriert, dessen Mündungsende 7 auf das freie Auflageende der Haltekapillare 5 gerichtet ist, an dem der Proteinkristall 2 befestigt ist. Dabei wird der am Auflageende angebrachte Proteinkristall 2 vollständig vom Gasstrom aus dem Gaskanal 6 umschlossen, so daß eine definierte Gasatmosphäre um den Proteinkristall herum erzeugt werden kann. Der Gaskanal 6 ist an seinem in der 1 als offen dargestellten Ende mit einem Gaserzeugungsmittel und einem Gasmischmittel verbunden, mit dem die Zusammensetzung des Gasstroms variabel eingestellt werden kann. Falls das um den Proteinkristall herum befindliche Gas Luft ist, kann das Gasmischmittel z.B. dazu dienen, die Luftfeuchtigkeit auf einen vorherbestimmten optimalen Wert einzuregeln. Es kann darüber hinaus auch ein Temperatureinstellmittel vorgesehen sein, mit dem die Temperatur des Gasstroms gemessen und auf einen bestimmten vorgebbaren Wert eingeregelt werden kann. Auch können andere gasförmige Substanzen dem Gasstrom beigemischt werden, so dass bspw. der Stickstoff- oder Sauerstoffgehalt der Luft modifiziert, bspw. erhöht, werden kann.

In der älteren Patentanmeldung DE 102 32 172 A1 mit dem Titel „Vorrichtung und Verfahren zur Erzeugung einer definierten Umgebung für partikelförmige Proben" ist bereits eine Vorrichtung und ein Verfahren beschrieben, mit dem sich eine hochgenaue und langzeitstabile Feuchteeinstellung eines durch die oben beschriebene Halterung geführten feuchten Gasstroms am Ort des partikelförmigen Kristalls erreichen läßt. Diese Druckschrift wird daher insoweit ebenfalls vollumfänglich in die Offenbarung der vorliegenden Anmeldung einbezogen.

Über dem Proteinkristall ist ein Mikroskop mit Videosystem 10 angebracht, mit dem der Proteinkristall während der Behandlung mit der Substanz beobachtet werden kann. Ggf. kann infolge der Beobachtung über das Videosystem der Behandlungsmodus modifiziert oder auch die Behandlung eingestellt werden.

Die in der 1 dargestellte erfindungsgemäße Vorrichtung zum Behandeln eines Proteinkristalls mit einer Substanz umfaßt darüber hinaus ein Mikrodosiersystem 11, das rechts in der 1 in einer Seitenansicht im Schnitt dargestellt ist.

Das Mikrodosiersystem 11 umfaßt eine sogenannte Piezopipette 12, die in einem Stativ 15 gehalten wird und so auf den Proteinkristall 2 ausgerichtet ist, daß dieser mittels der Piezopipette mit Tropfen beschossen werden kann. Die Piezopipette ist in der 1 aus Gründen der Anschaulichkeit in einem vergrößerten Maßstab im Verhältnis zur Halterung 1 dargestellt. Die Piezopipette ist so angeordnet, daß die Spitze der Piezopipette einen Abstand von typischerweise 3 mm zu dem Proteinkristall aufweist. Vorzugsweise liegt dieser Abstand in einem Bereich von 1–5 mm, kann jedoch unter besonderen Umständen auch größer oder kleiner gewählt werden.

Die Piezopipette 12 besteht aus einer Glaskapillare 13, die z.B. aus Borosilicatglas bestehen kann. Die Durchmesser der Öffnung der Glaskapillare ist einer der Faktoren, die die Größe der von der Piezopipette abgegebenen Mikro-Tropfen beeinflussen und kann z.B. in einem Bereich zwischen 5 und 50 Mikrometer liegen. Die Glaskapillare 13 ist von einem piezoelektrischen Element 14 umschlossen, das aus einem Material besteht, das einen piezoelektrischen Effekt zeigt. Es kann sich bei diesem Material z.B. um einen Piezokristall handeln. Das piezoelektrische Element 14 ist darüber hinaus über zwei Kabel 16 mit einem Steuergerät 17 elektrisch verbunden, mit dem eine Spannung an das piezoelektrische Element 14 angelegt werden kann. Wird ein Spannungspuls durch das Steuergerät 17 an das piezoelektrische Element 14 angelegt, so wird das piezoelektrische Element 14 und mit diesem auch die Glaskapillare 13 kontrahiert und ein Tropfen aus der Öffnung der Piezopipette herausgeschossen. Über das Steuergerät 17 können unterschiedlich geformte Spannungspulse an die Piezopipette angelegt werden können, deren Formen die Form und Größe der Mikro-Tropfen und deren Frequenz die Frequenz der Mikro-Tropfen beeinflussen.

In der 2 ist ein Gehäuse eines möglichen Steuergeräts zur Steuerung der Piezopipette dargestellt, wobei die einzelnen Steuerungsmöglichkeiten anhand der in der 2 dargestellten Schalter und Steuerelemente des Steuergeräts erläutert werden sollen. Das Steuergerät weist zunächst drei verschiedene LCD-Anzeigen 20, 21 und 22 auf. Auf der ersten LCD-Anzeige 20 wird der aktuelle Wert für den Spannungspegel der Impulsausgangsspannung für das Piezopipettensteuersignal angezeigt. Dieser Wert läßt sich über einen Drehregler 23 variabel einstellen. Auch die Impulsweite des Pipettenansteuersignals, die auf der zweiten LCD-Anzeige 21 in Mikrosekunden angezeigt wird, läßt sich mittels eines zweiten Drehreglers 24 einstellen. Schließlich ist ein dritter Drehregler 25 vorgesehen, um die Frequenz der an die Piezopipette angelegten Spannungsimpulse einzustellen, die auf der dritten LCD-Anzeige 22 angezeigt wird. Diese Frequenz, die bis zu einige kHz betragen kann (z.B. 2 kHz) entspricht der Frequenz, mit der die Mikro-Tropfen aus der Piezopipette auf den Proteinkristall geschleudert werden. Der Einstellbereich der Frequenz kann z.B. in einem Bereich zwischen 1 Hz und 6 kHz liegen. Die Höhe der Impulsausgangsspannung und die Weite der Spannungsimpulse müssen zunächst so eingestellt werden, daß es überhaupt zu einer Tropfenerzeugung mit der Piezopipette kommt. Darauf wird die Frequenz gewählt, die für den jeweiligen Proteinkristallbehandlungsprozeß ideal ist. Die Frequenz kann natürlich auch während des Proteinkristallbehandlungsprozesses laufend variiert werden.

Das Steuergerät weist ferner zwei Eingänge 26 auf, an denen die beiden Verbindungskabel der Piezopipette angeschlossen werden. Ferner sind ein Netzkabel 27 sowie ein Netzanschluß 28 zur Stromversorgung des Steuergeräts vorgesehen. Über den weiteren Signaleingang 29 können von anderen elektrischen Geräten vorgegebene Spannungsimpulsfolgen angelegt werden, um die Mikro-Tropfenerzeugung auszulösen und die Mikro-Tropfenfolge und -form von außen zu steuern. Das kann z.B. sinnvoll sein, wenn es ein zentrales Steuergerät gibt, das sowohl die Tropfenerzeugung als auch andere Parameter der Proteinkristallbehandlung wie den über die Kristallhalterung zugeführten Gasstrom, die Zusammensetzung des Gasstroms (z.B. seinen Feuchtegehalt), die Temperatur des Gasstroms, eine angeschlossene Röntgenbestrahlungsanlage etc. steuert und die verschiedenen Steuerungsparameter in einer vorherbestimmten Weise zueinander synchronisiert.

Der Schalter 30 ist dazu vorgesehen, den Piezopipettenbetrieb ein- und auszuschalten. Über den weiteren Schalter 31 kann zwischen Einzelspannungsimpulsbetrieb und kontinuierlichem Spannungsimpulsbetrieb umgeschaltet werden, d.h. zwischen Einzeltropfenerzeugung und kontinuierlicher Tropfenerzeugung. Für die Einzeltropfenerzeugung kann ferner ein Taster 32 vorgesehen sein, über den einzelne Spannungsimpulse an die Piezopipette angelegt werden können, wenn es gewünscht ist, einzelne Tropfen per Handbetrieb auf den Proteinkristall zu schießen.

Der Schalter 33 dient schließlich dazu zwischen verschiedenen Impulsformen der an die Piezopipette 12 angelegten Spannungsimpulse variieren zu können. In der Schalterstellung A kann z.B. ein vorgegebener Standard-Rechteckspannungsimpuls mit vorherbestimmter Dauer und Höhe erzeugt werden, während in der Schalterstellung B ein Rechteckspannungsimpuls erzeugt werden kann, dessen Dauer und Höhe variabel eingestellt werden kann. Es ist natürlich bei anderen Ausführungen auch denkbar, daß Spannungsimpulse angelegt werden, die von der Rechteckform abweichen. Die Impulsform der Spannungsimpulse wird nun so gewählt, daß eine optimale Tropfenerzeugung in Hinblick auf den zu behandelnden Proteinkristall gewährleistet ist.

Verschiedene Größen der Mikro-Tropfen, die z.B. für verschiedene Proteinkristallgrößen geeignet sein können, können über die Variation der Spannungspulsweiten und Spannungspulshöhen eingestellt werden, die die an die Piezopipette angelegten Spannungen aufweisen.

Die Glaskapillare 13 der Piezopipette 12 ist typischerweise über eine Zuleitung 18 mit einem in der 1 nicht dargestellten Vorratsgefäß verbunden, das die Lösung enthält, die auf den Proteinkristall getropft werden soll. Diese Lösung enthält die Substanz oder die Substanzen, mit der bzw. denen der Proteinkristall behandelt werden soll. Die Oberkante des Flüssigkeitsspiegels der sich im Vorratsgefäß befindenden Flüssigkeit sollte dabei etwas höher als die Unterkante der Pipettendüse eingestellt werden. Alternativ dazu kann die Flüssigkeit bei einer Ausführungsform ohne Vorratsgefäß aber auch direkt über die Auslaßöffnung der Piezopipette in die Piezopipette gesaugt werden, um sie dann später wieder abgeben zu können. Es kann auch eine Temperiervorrichtung um das Vorratsgefäß herum angeordnet sein, um die in denn Vorratsgefäß sich befindende Flüssigkeit auf eine gewünschte Temperatur zu bringen. Gemäß einer Ausführungsform kann vor dem Aufbringen der Lösung auf den Proteinkristall der pH-Wert und/oder die Ionenstärke (bzw. spezifische Salzkonzentrationen) der Lösung gemäß den im Stand der Technik bekannten Verfahren auf einen gewünschten Wert eingestellt werden.

Unter Mikro-Tropfen im Sinne der vorliegenden Erfindung sollen Tropfen zu verstehen sein, deren Volumen kleiner als 1 nl ist, wobei das Volumen der Mikro-Tropfen vorzugsweise zwischen 1 nl (nanoliter) und 1 pl (picoliter), noch weiter bevorzugt zwischen 100 pl und 20 pl und noch stärker bevorzugt zwischen 20 pl und 4 pl liegt. Aus diesen Größen lassen sich über die Volumensformel die entsprechenden geeigneten Durchmesser der Tropfen errechnen, wenn man näherungsweise davon ausgeht, daß die Tropfen kugelförmig sind. Die gewünschte Tropfengröße kann erfindungsgemäß eingestellt werden.

Die Mikro-Tropfen der auf den Proteinkristall aufzubringenden Flüssigkeit sind dabei vorzugsweise kleiner als das Volumen des Proteinkristalls ist. Ein typisches Proteinkristallvolumen kann dabei z.B. in einer Großenördnung von 1 nl liegen.

Das Volumen der im speziellen Fall verwendeten Mikro-Tropfen wird in Abhängigkeit vom Volumen des Proteinkristalls gewählt. Dabei betragen die Volumen der Mikrotropfen weniger als 50 %, z.B. 1 bis 20 %, des Proteinkristallvolumens und vorzugsweise von 1, stärker bevorzugt von 5 bis 10 % des Proteinkristallvolumens.

Die Tropfenerzeugung mittels einer Piezopipette ist nur ein Beispiel für eine Mikrodosiervorrichtung. Es können auch andere Vorrichtungen verwendet werden, die in der Lage sind, Mikro-Tropfen zu erzeugen.

So kann z.B. auch ein Mikrodosiersystem verwendet werden, das eine Kapillare und ein in der Kapillare angeordnetes Mikroventil umfaßt. Dabei wird die Flüssigkeit unter Druck aus einem Vorratsgefäß auf das Mikroventil gepreßt, das von einem Steuergerät elektrisch innerhalb eines kurzen Zeitintervalls geöffnet und danach wieder geschlossen wird, um die Tropfen zu erzeugen. Die Begrenzung der Tropfengröße ergibt sich hier durch die noch steuerbare Öffnungsdauer des Ventils.

Als Mikrodosiersystem kann bei einer anderen Ausführungsform auch ein Zerstäuber dienen. Ein Zerstäuber hat allerdings gegenüber den oben beschriebenen Lösungen den Nachteil, daß das Ausrichten der Tropfen auf den Proteinkristall schwieriger ist. Daher wird vorteilhafter Weise dem Zerstäuber ein Mittel nachgeordnet, das die Orientierung der aus dem Zerstäuber erhaltenen Mikro-Tropfen auf den Proteinkristall sicherstellt.

Es ist gemäß einer weiteren Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung auch denkbar, daß die Mikrodosier-Vorrichtung aus einem „Loop", bspw. einer Schlaufe, besteht, mit dem einzelne Tropfen (oder nur ein Tropfen) auf den Proteinkristall durch bspw. Abschütteln oder Abtropfenlassen von dem „Loop" aufgebracht werden. Es muß allerdings bei dieser Lösung der erfindungsgemäßen Aufgabe sichergestellt sein, daß die aufgebrachten Tropfenvolumina klein genug für die Proteinkristalle (im Sinn der voranstehend offenbarten Volumenverhältnisse von Proteinkristall zu Tropfen) sind.

Auch alle weiteren technischen Möglichkeiten, Mikro-Tropfen entsprechender Größe zu erzeugen, sind Lösungen im Sinne der vorliegenden Erfindung.

Bei einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird ein Proteinkristall zunächst an dem freien Auflagenende der Haltekapillare 2 befestigt. Anstelle der Haltekapillare 2 kann auch ein sogenannter „Loop", also eine Art Schlaufe, verwendet werden, in dem der Proteinkristall befestigt ist. Der Proteinkristall ist dabei frei von jeglicher Oberflächenlösung und damit zugänglich für Lösungen, die von außen direkt mittels des Mikrodosiersystems aufgebracht werden können. Durch die Halterung 1 wird nun typischerweise eine Gasatmosphäre um den Proteinkristall 2 herum erzeugt, indem ein Gasstrom definierter Zusammensetzung und Temperatur durch den Gaskanal 6 der Halterung 1 geführt wird. Bei dem beschriebenen Verfahren wird es sich typischerweise um einen Luftstrom, ggf. unter Beimischung anderer gasförmiger Substanzen, mit einem geregelten Feuchtigkeitsgehalt (d.h. Wassergehalt) und einer geregelten Temperatur handeln.

In die Kristallstruktur des Proteinkristalls soll nun ein Inhibitor eingebracht werden, der Bestandteil einer Substanz ist, die der Lösung zugesetzt wurde, die sich in dem Vorratsgefäß befindet, das mit der Piezopipette verbunden ist. Es hat sich durch Experimente gezeigt, daß lokal auf die Oberfläche des Proteinkristalls aufgebrachte Lösungen (wie bspw. DMSO) mit hoher Inhibitor-Konzentration den Proteinkristall in der Regel nicht schädigen. Nun werden durch das Steuergerät 17 elektrische Spannungspulse an die Piezopipette 12 angelegt und Mikro-Tropfen mit der Inhibitor-Lösung auf den Proteinkristall 2 geschleudert. Durch das Aufspritzen einzelner Mikro-Tropfen bleibt der den Proteinkristall umströmende Gasstrom praktisch unbeeinflußt, so daß der Proteinkristall in seiner stabilen definierten Umgebung verbleibt. Die Erhaltung einer stabilen Umgebung ist insbesondere für die relativ instabilen Proteinkristalle, die durch geringe Gitterkräfte zusammengehalten werden, wichtig, damit die Proteinkristalle nicht zerstört werden, bevor sie z.B. einer röntgenkristallographischen Untersuchung unterzogen werden. Die Feuchtigkeit des den Proteinkristall umgebenden Luftstroms kann nun im Zusammenspiel mit der Größe und Frequenz der über die Mikrodosiervorrichtung auf den Proteinkristall aufgebrachten Tropfen so eingestellt werden, daß der Proteinkristall möglichst sein Volumen nur wenig ändert, indem ein Gleichgewicht zwischen Abdampfen von Flüssigkeit vom Proteinkristall und Zuwachs an Flüssigkeit durch Auftropfen von Flüssigkeit mittels der Mikrodosiervorrichtung erreicht wird. Dadurch wird der Proteinkristall nur minimal belastet und es kann ein schonendes Einbringen des/der Liganden über die lokal aufgetragenen Mikrotropfen erreicht werden. Dieser Vorgang der Einstellung der optimalen Luftfeuchtigkeit bzw. der optimalen Auftropffrequenz durch die Mikrodosiervorrichtung kann über ein Regelelement automatisch geregelt werden, daß entsprechende Änderungen der Feuchtigkeit des Luftstroms und/oder der Auftropffrequenz vornimmt, wenn sich das gemessene Volumen des Proteinkristalls ändert.

Während des Proteinkristallbehandlungsprozesses kann der Proteinkristall gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung auch mit gepulstem Licht bestrahlt werden, z.B. über ein Stroboskop, um mittels des Videosystems in regelmäßigen Abständen eine Vermessung des Volumens des Tropfens durchführen zu können.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist es auch denkbar, daß der Proteinkristall, der sich in dem Gasstrom definierter Zusammensetzung befindet, von einer Lösung umgeben ist, so daß die durch die Mikrodosiervorrichtung aufgebrachten Tropfen nicht direkt auf den Proteinkristall, sondern in die den Proteinkristall umgebende Lösung gegeben werden.

Die erfindungsgemäße Vorrichtung bzw. das erfindungsgemäße Verfahren erweisen sich auch dann besonders vorteilhaft, wenn Liganden, bspw. Inhibitoren oder andere Stoffe, in einen Proteinkristall eingebracht werden sollen, die selbst in einer wäßrigen Lösung nur schwer zu lösen sind. Tatsächlich erweist sich eine Reihe von Liganden als in wäßrigen Systemen ausgesprochen schwer löslich, so daß mit dem in der Beschreibungseinleitung beschriebenen klassischen „Soaking"-Verfahren diese Liganden/Inhibitoren nicht in den Proteinkristall eingebracht werden können, da die Konzentration der Liganden/Inhibitoren in der wäßrigen Lösung zu gering ist. Wird nun mittels des Mikrodosiersystems eine wäßrige Lösung, in der diese Liganden und/oder Inhibitoren gelöst sind, auf den Proteinkristall aufgetropft, so verdunstet das Wasser nach jedem Auftropfen vollständig, während der Ligand auf bzw. im Proteinkristall verbleibt. Durch wiederholte Auftropfzyklen können so größere Mengen des (schwer löslichen) Liganden auf den Proteinkristall aufgebracht werden. Der Ligand akkumuliert sich so allmählich auf bzw. im Proteinkristall, bis eine ausreichende Menge des Liganden in den Proteinkristall eingebracht ist und eine zufriedenstellende Ligand-Protein-Komplexbildung (also die Besetzung des Proteinkristalls an den Bindungsstellen der kristallisierten Proteine ausreichend ist, eine Elektronendichte für den Liganden zu bestimmen) erreicht ist.

Der Vorteil bei diesem Verfahren liegt auch darin, daß die Proteinkristalle nicht mit einem weiteren Lösungsmittel versetzt werden müssen und so die Behandlung der empfindlichen Proteinkristalle schonender wird. Außerdem besteht derart nicht die Gefahr, daß der Ligand aufgrund seiner geringen Löslichkeit auf dem Proteinkristall bzw. in den Lösungsmittelkanälen präzipitiert. Bei diesem Verfahren kann die Menge an durch das Mikrodosiersystem aufzutropfender Lösung durch die Konzentration der Lösung sowie einer Abschätzung der Molarität des Proteins im Proteinkristall berechnet werden. Ein weiterer Vorteil des Verfahrens besteht darin, daß man mit Wasser als dem einzigen Lösungsmittel für den Liganden im Vergleich zu anderen Lösungsmitteln oder Flüssigkeiten besonders kleine Tropfengrößen erzielen kann, was insbesondere bei kleinen Proteinkristallen wichtig ist, da erfindungsgemäß die Tropfengröße kleiner als die Größe des Proteinkristalls sein sollte.

Die erfindungsgemäße Vorrichtung zum Behandeln eines Proteinkristalls mit einem Substrat kann auch in einer Röntgenbestrahlungsanlage oder Synchrotronbestrahlungsanlage verwendet werden, so daß es möglich wird, während der Behandlung des Proteinkristalls mit der Substanz Beugungsbilder des Proteinkristalls aufzunehmen und so den Behandlungsprozeß, d.h. die sukzessive Besetzung der Bindungsstellen des Proteinkristalls, „online" zu beobachten. Hierzu kann die Halterung 1 z.B. an einem Goniometer einer Röntgen- oder Synchrotron-Bestrahlungsanlage befestigt werden. Der Proteinkristall kann vor der röntgenkristallographischen Untersuchung auch eingefroren werden, was in der Regel unter Verwendung von flüssigem Stickstoff erfolgt (sogenannte Cryo-Kristallographie). Hierdurch werden bei röntgenkristallographischen Untersuchungen die Intensitäten der Reflexe des Beugungsbildes ermittelt und schließlich unter Verwendung der Phaseninformation, z.B. aus isomorpher Ersetzung oder MAD („multiple anomalous scattering"), die Elektronendichte der Struktur ermittelt werden.

Selbstverständlich können auch andere physikalische, insbesondere spektroskopische, Messungen mit Hilfe der erfindungsgemäßen Vorrichtung an dem Proteinkristall durchgeführt werden. So kann die erfindungsgemäße Vorrichtung z.B. auch mit einer Anlage zur Aufnahme einer Absorptionsspektrums kombiniert werden, um das Absorptionsspektrum des Proteinkristalls aufzunehmen.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung kann auch oder nur dem durch die Halterung 1 geführten Gasstrom ein Lösungsvermittler beigefügt werden, der sich für die in den Proteinkristall einzubringende Substanz eignet, also z.B. ein Lösungsvermittler für einen schwerlöslichen Liganden. Hierzu kann zusätzlich ein Verdampfer vorgesehen sein, um den Lösungsvermittler vor der Einleitung in den Gaskanal 9 der Halterung 1 zu verdampfen. Auch kann eine Vorrichtung vorgesehen sein, die dazu dient, die Konzentration des Lösungsvermittlers im Gasstrom variabel einzustellen und den erforderlichen Bedingungen anzupassen. So läßt sich eine im Gegensatz zum klassischen „Soaking"-Prozeß sehr schonende Zufuhr von Lösungsvermittler zu dem Proteinkristall erreichen. Während der Zufuhr des den Lösungsvermittler enthaltenden Gasstroms kann dann über die Piezopipette die Ligandenlösung auf den Proteinkristall in Mikro-Tropfenform aufgebracht werden. Insgesamt ergibt sich also erfindungsgemäß die Möglichkeit nur der als Mikrotropfen aufzubringenden Ligandenlösung Lösungsvermittler oder nur dem zugeführten Gasstrom beizumischen. Ggf. können beide Alternativen auch kombiniert werden, so dass sowohl im Mikrotropfen als auch im Gasstrom der Lösungsmittelvermittler (gleich oder verschieden) zugesetzt werden.

Auf erfindungsgemäße Weise lassen sich damit Liganden an den Proteinkristall binden, die mit klassischen „Soaking"-Prozessen nicht gebunden werden können. Zudem ist ein solches erfindungsgemäßes Verfahren im Vergleich zu bisherigen „Soaking"-Prozessen mit geringerem Zeitaufwand verbunden, da wegen der schonenderen Proteinkristallbehandlung weniger Versuche unternommen werden müssen, um die Proteinkristallbehandlung erfolgreich zum Abschluß zu bringen.

Die erfindungsgemäße Vorrichtung sowie das erfindungsgemäße Verfahren eignen sich aber nicht nur zum Einbringen von Liganden in Proteinkristalle. Es können auch eine Reihe von anderen Behandlungsmethoden mit anderen Lösungen an Proteinkristallen auf die erfindungsgemäße Art durchgeführt werden.

Auch kann die über die Mikro-Tropfen mittels des Mikrodosiersystems aufgebrachte Lösung mehrere verschiedene Substanzen enthalten, mit denen der Proteinkristall behandelt werden soll. Es kann sich dabei zum Beispiel um mehrere Liganden, bspum w. mehrere Substrate oder um ein Substrat und um einen katalytisch wirkenden Liganden, handeln, die in einer Lösung gelöst sind, die mittels einer Piezopipette auf den Proteinkristall aufgebracht werden soll.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform kann die Piezopipette auch mit einem speziellen Flüssigkeitzufuhrsystem versehen sein, mit dem es möglich ist, die Zufuhr verschiedener Flüssigkeiten in die Piezopipette zeitlich in gewünschter Weise zu steuern. In der 3 ist ein solches Flüssigkeitszufuhrsystem darstellt. Das in der 3 dargestellte Flüssigkeitszufuhrsystem umfaßt eine Präzessionsspritze 40, die aus einem Zylinder 41 besteht, in dem ein über einen (in der 3 nicht dargestellten) Motor angetriebener Kolben 42 hin- und herlaufen kann. Wenn der Kolben nach unten läuft, können verschiedene Flüssigkeiten aus den Flüssigkeitsbehältern 43, 44, 45 oder 46 in den Zylinder gesaugt werden, wenn eines der entsprechenden elektrisch ansteuerbaren Ventile 47, 48, 49 bzw. 50 geöffnet wird und zusätzlich das vor dem Zylinder liegende elektrisch steuerbare Ventil 51 geöffnet wird. Wird das Ventil 51 dann wieder geschlossen, das am Auslaß des Zylinders liegende elektrisch steuerbare Ventil 52 geöffnet und der Kolben 42 nach oben getrieben, so kann die angesaugte Flüssigkeit über die zur Piezopipette führende Flüssigkeitszufuhrleitung 53 zur Piezopipette geführt werden, um dann schließlich in Tropfenform auf den Proteinkristall gegeben werden zu können.

Die Behälter 45 und 46 können z.B. zwei verschiedene Lösungen mit verschiedenen Liganden enthalten, die mit dem Protein des zu betropfenden Proteinkristall einen Komplex bilden sollen. Die Behandlung des Proteinkristalls kann dabei z.B. so erfolgen, daß zunächst die Lösung 1 aus dem Behälter 45 und danach die Lösung 2 aus dem Behälter 46 auf den Proteinkristall aufgetropft wird. Zwischen den beiden Lösungen kann eine Reinigungslösung durch die Leitungen gespült werden, die sich in dem Behälter 44 befindet. Der weitere Behälter 47 dient als Abfallbehälter, um Flüssigkeitsmengen aufzunehmen, die nicht mehr benötigt werden und aus dem Zufuhrsystem entfernt werden müssen. Durch geeignete zeitliche Ansteuerung der Ventile 47–52 und des Kolbens 42 können nun der Piezopipette die gewünschten Lösungen in der gewünschten Menge zugeführt werden.

Ein weiteres Beispiel zur Anwendung eines erfindungsgemäßen Verfahrens ist das sogenannte „Back-Soaking", bei dem bestimmte an die Kristallstruktur des Proteins bereits gebundene Substanzen durch andere Substanzen ausgetauscht werden, es wird also ein Cokristall erneut mit dem Ziel einer Substitution „gesoakt". So kann z.B. ein Ligand durch einen anderen Liganden, der sich in der Lösung befindet, die über Mikro-Tropfen auf den Proteinkristall aufgebracht wird, ersetzt werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann ferner auch dazu verwendet werden, in sehr schonender Weise sogenannte „Cryo-Puffer" auf einen Proteinkristall (komplexiert oder nicht-komplexiert) aufzubringen. Viele Proteinkristalle müssen vor der röntgenkristallographischen Untersuchung aus Stabilitätsgründen eingefroren werden, was, wie oben beschrieben, in der Regel unter Verwendung von flüssigem Stickstoff durchgeführt wird. Die Cryo-Puffer werden während des Einfrierprozesses verwendet, um die Eisbildung zu verhindern, die zur Zerstörung des Proteinkristalls führen würde. Beispiele für Cryo-Puffer sind Glycerin oder 2-Methyl-2,4-pentanediol (MPD). Die Cryo-Puffer können in das Vorratsgefäß der Piezopipette gefüllt werden und dann in ähnlicher Weise wie die Ligandenlösung mit der Mikrodosiervorrichtung auf den Proteinkristall gespritzt werden.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung können auch mehrere Mikrodosiersysteme, z.B. mehrere Piezopipetten, verwendet werden, mit denen jeweils unterschiedliche oder auch identische Substanzen (bspw. an zwei verschiedenen, lokal abgegrenzten Bereichen des Proteinkristalls) auf den Proteinkristall aufgebracht werden. Eine solche Anordnung kann z.B. von Vorteil sein, wenn zwei verschiedene Liganden in eine Proteinkristallstruktur eingebracht werden sollen. Die Liganden werden dann in verschiedenen Lösungen gelöst, die in die beiden Flüssigkeitsvorratsbehälter zweier Piezopipetten gegeben werden. Über die beiden Piezopipetten werden dann die beiden Lösungen mit den verschiedenen Liganden in Mikro-Tropfenform auf den Proteinkristall aufgebracht. Dabei können über das mit einer Piezopipette jeweils verbundene Steuergerät, das die Tropfenerzeugung steuert, unterschiedliche Spannungsimpulse und Spannungspulsfolgen an die Piezopipetten angelegt werden, um so eine optimale Form und Frequenz der Mikro-Tropfen zu erreichen, die für den jeweiligen Liganden ideal ist.

Die Verwendung von zwei Mikrodosiersystemen, mit denen getrennt zwei verschiedene Substanzen aufgebracht werden, die erst auf dem Proteinkristall zusammentreffen, ist insbesondere auch dann vorteilhaft, wenn das kristallisierte Protein Katalysatorfunktion für die beiden Substanzen, die beide als Reaktanden im kristallisierten Protein gebunden werden, hat. Erfolgt das Aufspritzen der beiden Reaktanden separat durch zwei Mikrodosiersysteme während der Röntgenbestrahlung des Proteinkristalls, kann die Reaktion der Reaktanden unter katalytischem Einsatz der kristallisierten Proteine verfolgt werden. Eine Voraussetzung für eine derartige röntgenkristallographische Untersuchung ist natürlich die Stabilität des Proteinkristalls, d.h., daß der Proteinkristall seine Struktur nicht durch strukturelle Umlagerungen der kristallisierten Proteine verlieren darf, da er dadurch auch sein Diffraktionsvermögen verlieren würde.

Auch das sogenannte „Cryo-Soaking" läßt sich mit dem erfindungsgemäßen Verfahren in besonders vorteilhafter Weise durchführen. Das „Cryo-Soaking" ist durch die Kombination aus Ligandenzugabe und gleichzeitigem Einfrieren eines Proteinkristalls gekennzeichnet. So können z.B. Übergangszustände des Proteinkristalls eingefroren und dann röntgenkristallographisch untersucht werden. Auch hierzu kann ein System verwendet werden, das mit mehreren Mikrodosiersystemen arbeitet, wobei über das eine Mikrodosiersystem z.B. der oben beschriebene Cryo-Puffer und über das andere Mikrodosiersystem eine Lösung in Mikro-Tropfenform auf den Proteinkristall gegeben werden, die den in den Proteinkristall einzubringenden Liganden enthält.

Eine weitere Anwendung wäre etwa das Aufspritzen von Reaktanden, die in bestimmter Weise mit dem Proteinkristall reagieren.

Es ist gemäß einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens auch denkbar, daß dem durch die Halterung für den Proteinkristall geführten Gasstrom gewisse Substanzen zugefügt werden, mit denen der Proteinkristall behandelt werden soll. So könnte z.B. beim „Soaking" dem Gasstrom ein in die Proteinkristallstruktur einzubringender Ligand beigemengt werden, während mit dem Mikrodosiersystem Lösungsmittel für diesen Liganden aufgetropft wird oder eine Lösung aufgetropft, in der ein weiterer Ligand gelöst ist, der gleichzeitig mit dem über den Gasstrom zugeführten Liganden in die Kristallstruktur des Proteinkristalls eingebaut werden soll. Das Lösungsmittel für den Liganden kann natürlich zusätzlich auch über den Gasstrom dem Proteinkristall zugeführt werden. Hierzu kann ein Verdampfer eingesetzt werden, um das Lösungsmittel vorher in die Gasphase zu überführen. Auch ein Ligand, der über den Gasstrom zugeführt werden soll, kann über den Verdampfer dem Gasstrom zugeführt werden. Auch beim oben beschriebenen Cryo-Soaking kann z.B. über den Gasstrom Lösungsmittel mit Ligand dem Proteinkristall zugeführt werden, während über das Mikrodosiersystem ein Cryo-Puffer auf den Mikrokristall aufgetropft wird.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann ein erfindungsgemäßes Verfahren im Wege des Hochdurchsatzes auch zur Identifikation von Verbindungen genutzt werden, die Komplexbildungseigenschaften aufweisen. Hierzu sind erfindungsgemäße Verfahren geeignet, wobei ein Proteinkristall, wie bspw. in der DE 198 42 797 C1 oder in 1 gezeigt montiert wird und (a) ein potentieller Ligand in Mikrotropfen einer Flüssigkeit nach einem erfindungsgemäßen Verfahren auf den Proteinkristall aufgebracht wird, (b) in einem zeitlichen Abstand von variabler Länge Beugungsintensitäten gemessen werden, wobei mindestens eine Aufnahme, vorzugsweise 2 bis 10 Aufnahmen, zu jedem Zeitpunkt aufgenommen werden, und (c) diese im zeitlichen Abstand gemessenen Beugungsintensitäten, die typischerweise verschiedene Akkumulierungszustände des potentiellen Liganden auf dem Proteinkristall widerspiegeln, miteinander in ihrer zeitlichen Abfolge verglichen werden. Hierbei ist es besonders bevorzugt, wenn der Proteinkristall in einer Orientierung während aller Beugungsaufnahmen verbleibt. Auf diesem Weg wird es erfindungsgemäß möglich mit nur einem Proteinkristall und einzelnen Röntgenaufnahmen (ohne einen vollständigen Datensatz aufnehmen zu müssen), die Komplexbildung nachzuweisen und damit die Testsubstanz als Liganden oder als nicht-bindend zu identifizieren. Mit zunehmender Komplexbildung nimmt nämlich die Korrelation zum völlig unbesetzten Ausgangszustand des Proteinkristalls ab, weswegen (im zeitlichen Abstand wachsende) Intensitätsunterschiede des Reflexe die Komplexbildung indizieren. Ein derartiges Verfahren kann als Hochdurchsatzverfahren durchgeführt werden, da eine nichtbindende Substanz verworfen werden kann und mit einer anderen Substanz das Verfahren gemäß Schritten (a) bis (c) wiederholt werden kann. Innerhalb von wenigen Minuten kann erfindungsgemäß eine Testsubstanz als Ligand identifiziert oder als nichtbindend verworfen werden.

Die vorliegende Erfindung wird durch die 4 und 5 näher erläutert:

4: Der kovalent gebundene Inhibitor sowie einzelne Aminosäuren in der Umgebung des Aktiven Zentrums des Thrombins um Ser195 sind als stick-Modell dargestellt. Sauerstoffatome sind rot, Schwefelatome gelb, Stickstoffatome blau und Kohlenstoffatome grau dargestellt. Der Inhibitor ist zusätzlich von seiner 2F_o–F_c-Elektronendichte (kontouriert bei 1&sgr;) überlagert. Der Inhibitor ist in seiner Elektronendichte eindeutig definiert.

In der experimentell bestimmten Elektronendichte ist deutlich die kovalente Bindung des PMSFs am Ser195 zu erkennen (4), die sich von der des ursprünglich im Kristall gebundenen Benzamidins signifikant unterscheidet. Damit wurde der Beweis geführt, daß der Ansatz des Auftropfens von Picoliter-Tropfen auf einen Proteinkristall unter Verwendung des Free Mounting Systems funktioniert

5: Das Spaltprodukt Pro-Ile des Inhibitors Diprotin A sowie einzelne Aminosäuren in der Umgebung des Aktiven Zentrums der DPIV um Ser630 sind als stick-Modell dargestellt. Sauerstoffatome sind rot, Stickstoffatome blau und Kohlenstoffatome grau dargestellt. Der Inhibitor sowie Ser630, das kovalent an den Inhibitor gekoppelt ist, ist zusätzlich von seiner 2F_o–F_c-Elektronendichte (kontouriert bei 1&sgr;) überlagert. Der Inhibitor ist in seiner Elektronendichte eindeutig definiert (5).

Vom eingesetzten Tripeptid mit der Sequenz Ile-Pro-Ile ist das C-terminale Isoleucin abgespalten, während das Dipeptid kovalent mit Ser630 weiterhin verknüpft ist und nicht abgespalten wird. Insofern verhält sich Diprotin A eher wie ein Suizid-Substrat und nicht wie ein Inhibitor.

Die vorliegende Erfindung wird durch die nachfolgenden Ausführungsbeispiele näher beschrieben.

Ein Thrombin-Kristall wurde bei der zuvor ermittelten Startfeuchte von 93 % mit einem „Loop" auf dem Free Mounting System montiert. Überschüssiger Reservoirpuffer wurde aus dem „Loop" vorsichtig unter dem Mikroskop mit einem Filterpapierstreifen entfernt. Die Stabilität bzw. die Konstanz der Größe des Kristalls wurde mit Hilfe des Videosystems kontrolliert.

Darauf wurde die Piezopipette mit einer 100 mM Lösung von PMSF, einem Liganden (Inhibitor) von Thrombin, in Isopropanol befüllt. Es wurde hier eine hochkonzentrierte PMSF-Lösung in einem organischen Lösungsmittel verwendet.

Anschließend wurde der Kristall mit einzelnen Tropfen („single shot" Modus) der Lösung „beschossen". Das insgesamt aufgetropfte Volumen entsprach ungefähr dem Volumen des Kristalls, also ca. 300 pl. Bei der sehr hohen eingesetzten PMSF-Konzentration entspricht dies ca. einem 3–4-fachen molaren Überschuß des Inhibitors. Dabei wurde nach jedem Auftropfen die Projektion der Fläche des Kristalls beobachtet und bis zum nächsten Auftropfen so lang gewartet, bis die Fläche wieder konstant blieb. Die einzelnen Parameter des Experiments sind Tabelle 1 zu entnehmen. Tabelle 1 Startfeuchte [% r.h.] 93 Größe der aufgebrachten Tropfen [pl] ca. 30 Anzahl der augebrachten Tropfen 10 Spannung [V] 39,1 Pulsweite [&mgr;s] 450

Nach Abschluß des Auftropfens wurde der Kristall mit PFPE-Öl (Perfluoropolyether) benetzt und in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Der röntgenkristallographische Datensatz wurde auf einer rotierenden Kupferanode aufgenommen. Die Prozessierung der Daten erfolgte mit den Programmen XDS und XSCALE, Verfeinerung und manueller Modellbau wurden mit den Programmen CNX und O durchgeführt. Die Statistiken von Datensammlung, Prozessierung und Verfeinerung sind in Tabelle 2 angegeben. Trotz des Auftropfens des reinen Lösungsmittels wurde die Diffraktionsqualität des Kristalls nicht beeinträchtigt, wie insbesondere anhand des Wertes von R_meas zu erkennen ist. Tabelle 2 Inhibitor PMSF Strahlungsquelle Rotierende Kupferanode Wellenlänge [Å] 1,5418 Detektor MAR Imageplate Temperatur [K] 100 Raumgruppe C2 Zellparameter: a ≠ b ≠ c [Å] 70,8; 72,8; 72,7 &agr; = &ggr; = 90°; &bgr; 99,77 [°] Auflösung [Å] 2,57 Unabhängige 10892 Reflexe I/&sgr;¹ 7,3 (2,9) Vollständigkeit¹ 91,7 (94,5) [%] R_meas ^1,2 [%] 11,8 (40,4) R_cryst ¹[%] 19,8 R_free ² [%] 26,4

• ¹ Werte in Klammer gelten für die äußerste Auflösungsschale
• ² R_meas = &Sgr; |I_obs – <I>|/&Sgr; <I>

Eine graphische Darstellung der Ergebnisse der röntgenkristallographischen Untersuchung ist 4 zu entnehmen.

Die Kristalle der DPIV zeigen im nativen Zustand ein nur sehr eingeschränktes Streuverhalten. Erst durch Feuchte-Optimierung mit dem „Free Mounting System" lässt sich die erreichbare Auflösung der Kristalle aber entscheidend verbessern. Im optimierten Zustand bei reduzierter Feuchte zeichnen sich die Kristalle zudem durch eine erhöhte Stabilität aus und sind somit besser für „Soaking"-Experimente durch das Auftropfen geeignet.

Im vorliegenden Experiment wurde ein Kristall der DPIV bei der zuvor bestimmten Startfeuchte von 97 % mit dem „Free Mounting System" montiert. Zur Optimierung wurde die Feuchte in einem Gradient von 0,5 % Feuchteänderung pro 60 s auf 89 % r.h. abgesenkt. Die Transformation des Kristalls, die durch eine deutliche Verbesserung der Auflösung gekennzeichnet ist, beginnt bereits bei 94 % r.h. und erreicht bei 89 % r.h. ihr Maximum. Während des Auftropfens wurde daher die Feuchte konstant gehalten.

Als Ligand wurde eine Inhibitor-Lösung von wässriger Diprotin A Lösung (50 mM) verwendet. Bei Verwendung einer wässrigen Lösung sind im Vergleich zu organischen Lösungsmitteln kleinere Tropfengrößen zu erreichen, wodurch der Kristall noch schonender behandelt wird. Während des Auftropfens der Lösung wurde permanent die Fläche des Kristalles beobachtet und erst dann der nächste Tropfen aufgetragen, wenn die Fläche sich nicht mehr änderte. Die Gesamt-Menge an aufgetropften Inhibitor entspricht einem ca. 10-fachen molaren Überschuß. Die einzelnen Parameter des Experiments sind Tabelle 3 zu entnehmen. Tabelle 3 Startfeuchte [% r.h.] 97 Feuchte-Gradient 0,5 %/60 s Optimum der Feuchte [%] 89 Größe der aufgebrachten Tropfen [pl] ca. 5–10 Anzahl der aufgebrachten Tropfen 80 Spannung [V] 39,2 Pulsweite [&mgr;s] 10

Nach Beendigung des Auftropfen wurde der Kristall unter Verwendung von PFPE-Öl (Perfluoropolyether) als Cryo-Protectant in flüssigem Stickstoff eingefroren. Die anschließende röntgenkristallographische Datensatzaufnahme erfolgte auf einer rotierende Kupferanode. Prozessiert wurden die Daten mit den Programmen XDS und XSCALE, Verfeinerung und manueller Modellbau wurden mit den Programmen CNX und O durchgeführt. Die Statistiken von Datensammlung, Prozessierung und Verfeinerung sind in Tabelle 4 angegeben. Tabelle 4 Inhibitor Diprotin A Strahlungsquelle Rotierende Kupferanode Wellenlänge [Å] 1,5418 Detektor MAR Imageplate Temperatur [K] 100 Raumgruppe P1 Zellparameter: a ≠ b ≠ c [Å] 62,3; 118,5; 133,1 &agr; ≠ &bgr; ≠ &ggr; [°] 112,7; 94,9; 90,9 Auflösung [Å] 2,59 Unabhängige 103898 Reflexe I/&sgr;¹ 14,0 (4,1) Vollständigkeit¹ 93,5 (89,4) [%] R_meas ^1,2 [%] 6,1 (28,0) R_cryst ¹ [%] 22,6 R_free ² [%] 27,5

Die Ergebnisse der röntgenkristallographischen Untersuchung sind in 5 dargestellt. Mit diesem Ausführungsbeispiel wird das große Potential erfindungsgemäßer Verfahren unter Verwendung von Microdosiersystemen (und Free Mounting) deutlich, da hier parallel ein Kristall optimiert und durch das Auftropfen ein Inhibitor gebunden werden konnte.

Eine weitere Möglichkeit, insbesondere schwerlösliche Liganden (Inhibitoren) an kristallisierte Proteine zu binden, besteht im langsamen Akkumulieren des Inhibitors, der im wässrigen System gelöst ist. Beim klassischen „Soaking" ist man stets darauf angewiesen, daß die Konzentration des Inhibitors in der Lösung nicht zu gering ist. Daher ist es häufig notwendig, dem Ansatz zur Erhöhung der Löslichkeit Lösungsmittel beizumischen, was die empfindlichen Proteinkristalle u.U. schädigt oder sogar zerstört.

Mit einer erfindungsgemäßen Vorrichtung bzw. bei Durchführung eines erfindungsgemäßen Verfahrens wurde zur schonenderen Behandlung ganz auf Lösungsmittel verzichtet, da sich der Inhibitor auch bei nur geringer Löslichkeit durch häufiges Auftropfen im Kristall akkumuliert, wodurch die Wahrscheinlichkeit der Bindung wesentlich erhöht wird. Durch die Beobachtung des Kristalls mit dem Videosystem wurde gewährleistet, daß der Kristall nicht zu stark befeuchtet wurde. Ein neuer Tropfen wurde erst dann aufgebracht, wenn der vorherige Tropfen bereits verdunstet war. Aus den Angaben über die Löslichkeit des jeweiligen Inhibitors, der Tropfengröße und der Anzahl der Moleküle im Kristall konnte sogar die Anzahl der aufzubringenden Tropfen berechnet werden.

Als Inhibitor wurde Pefabloc SC (4-(2-Aminoethyl)-benzolsulfonyl-fluorid-hydrochlorid, K_i: 6,5 &mgr;M) verwendet, der sich durch eine hohe Stabilität im wässrigen System auszeichnet.

Es wurde die Anzahl benötigter Tropfen für eine Stöchiometrie von Inhibitor zu Protein von 2:1 errechnet unter folgenden Randbedingungen: bei einem Kristall-Volumen von 300 pl und einer Dichte des Kristalls von ca. 1,3 g/ml ergab sich für die Masse des Kristalls = 390 ng. Unter Berücksichtigung des Molekulargewichts von Thrombin (ca. 40 kDa) ergab sich eine Konzentration des Thrombins im Kristall ca. 9,75 pmol/300 pl bzw. 32,5 mM. Da es das Ziel war, den Inhibitor im stöchiometrischen Verhältnis von 2:1 aufzubringen, um eine möglichst hohe Besetzung zu erreichen, betrug die benötigte Menge des Inhibitors: 19,5 pmol (9,75 pmol × 2).

Die Menge an aufzutropfender Inhibitor-Lösung hängt von der Konzentration des Inhibitors ab und wurde experimentell für drei Konzentrationen unter der Annahme einer Tropfengröße von 10 pl, wie sie bei Verwendung von Wasser realisierbar ist, gewählt, wie in Tabelle 5 dargestellt. Bei einer üblichen relativen Feuchte zwischen 90 und 100 % r.h. konnte regelmäßig 1 Tropfen pro sec auf den Kristall aufgebracht werden. Die Frequenz wurde aber deutlich erhöht, wenn bei reduzierter Feuchte im Hüllstrom, die zu einem Austrocknen der Kristalle führt, der Verlust an Feuchtigkeit durch ein schnelleres Auftropfen ausgeglichen und somit die rel. Feuchte am Kristall konstant gehalten werden mußte. Dadurch wurde eine Frequenz von 20 Tropfen pro Sekunde ermöglicht. Die sich daraus bei verschiedenen Inhibitorkonzentrationen ergebenden Zeiten sind ebenfalls in Tabelle 5 dargestellt. Tabelle 5 Inhibitor-Konzentration Gesamtvolumen an aufzutropfen- der Lösung [&mgr;l] Anzahl der Tropfen (Tropfenvolumen 10 pl) Dauer des Experi-ments [h] bei 20 Tropfen/sec 100 &mgr;M 0,195 19.500 0,3 10 &mgr;M 1,95 195.000 2,7 1 &mgr;M 19,5 1.950.000 27,1

Beim Experiment mit humanen &agr;-Thrombin und dem Inhibitor Pefabloc unter Verwendung einer Konzentration von 100 &mgr;M wurden die folgenden, aus Tabelle 6 entnehmbaren experimentellen Parameter gewählt. Durch die erhöhte Frequenz beim Auftropfen wurde die reduzierte Feuchte während des Experimentes ausgeglichen werden. Tabelle 6 Startfeuchte [% r.h.] 93 Feuchte beim Auftropfen [% r.h.] ca. 80 Inhibitor-Konz. [&mgr;M] 100 Größe des Proteinkristalls [pl] 250 Größe der aufzubringenden Tropfen [pl] ca. 10 Frequenz [s^–1] 10 Anzahl der aufzubringenden Tropfen 17.000 Spannung [V] 41,0 Pulsweite [&mgr;s] 450