Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Manipulation von Teilchen unter Verwendung von Dielektrophoresekräften für Screeningprozeduren mit hohem biologischem Wert, durchgeführt bei potenziellen pharmazeutischen Verbindungen, das zur Diagnostik und Analyse von landwirtschaftlichen Erzeugnissen geeignet ist. Die Erfindung betrifft ebenfalls eine Vorrichtung zur Ausführung des offenbarten Verfahrens.

In einem sich ausdehnenden Fachgebiet, das die Entdeckung von neuen Medikamenten und kombinatorische Chemie umfasst, die bei der Herstellung von neuen Anwärterverbindungen verwendet wird, wird es insbesondere vorteilhaft sein, in der Lage zu sein, eine große Anzahl an Substanzen mittels einer Prozedur zu screenen, die einen hohen Durchsatz zu dem Zweck der Beobachtung ihrer physiologischen Auswirkung auf Tiere und auf Menschen bietet. Vor dem „teilweise erfolgreichen" Testen der Wirksamkeit eines Medikamentenanwärters an Tieren, sollte die Substanz auf ihre potenzielle Giftigkeit in Bezug auf lebende Zellen getestet werden. Umgekehrt ist es die herkömmliche Praxis, dass viel versprechende Verbindungen nahezu sofort in umfassenden Studien an Tiermodellen getestet werden, Studien, die gleichzeitig lang und teuer sind. Weiterhin wird die Praxis zum umfassenden Testen an Tieren weniger und weniger in den Vereinigten Staaten und in Europa kulturell akzeptabel. Wenn potenzielle pharmazeutische Verbindungen getestet werden, um ihre Wechselwirkungen mit lebenden Zellen zu beobachten, bevor Studien an Tiermodellen durchgeführt werden, kann dies die Anzahl an Tieren, die für anschließende Versuche benötigt wird, durch Ausschließen von vielen der Anwärter reduzieren, bevor die Stufe des Testens an Tieren erreicht wird.

Gegenwärtige Prozeduren für die Analyse von Zelle-Medikament-Wechselwirkung bieten weder einen hohen Durchsatz noch einen hohen biologischen Wert aufgrund der eingeschränkten Anzahl an Zellen und Verbindungen, die in einer gegebenen Zeitdauer analysiert werden können, der unzureichenden Durchführbarkeit der Verfahren, die zur Verabreichung der Verbindungen notwendig sind, und den erforderlichen, beträchtlichen Volumen der Verbindung.

Dementsprechend sind Anstrengungen unternommen worden, um diese Nachteile durch Studieren von alternativen Verfahren für die Analyse von Wechselwirkungen zwischen Zelle und Medikament oder noch allgemeiner zwischen biologischen Proben und biologisch aktiven Mitteln zu überwinden, wie beispielsweise jenen, die nachstehend beispielhaft angegeben sind.

Es sind einige Verfahren zur Herstellung von gleichmäßig mikromodellierten Zellmatrizen beschrieben worden, zum Beispiel Photolithography (Mrksich & Whitesides, Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struc. 25:55-78, 1996). Gemäß diesem Verfahren, das eine Glasplatte verwendet, werden ein fotoempfindliches Material und eine Maske eingesetzt, um eine Platte zu erhalten, die eine Matrix aus reaktiven oder hydrophilen Stellen auf einer Oberfläche zeigt, die im Gegensatz dazu hydrophob ist. Die Matrix aus hydrophilen Gruppen stellt ein Substrat dar, um auf ihm eine nichtspezifische und nichtkovalente Bindung von bestimmten Typen an Zellen zu erhalten, die jene aus neuronalem Ursprung einschließen (Kleinfeld et al., J. Neurosci. 8:4098-4120, 1988).

In einem anderen Verfahren, das auf spezifischen, aber nichtkovalenten Wechselwirkungen basiert, wird Lichtpausen verwendet, um eine Goldoberfläche herzustellen, die Stellen aus Laminin, einem Zell-bindenden Protein, zu erzeugen, das normalerweise in der extrazellulären Matrix gefunden wird. (Singhvi et al., Science 264:696-698, 1994).

Eine spezifischere, gleichförmige Bindung kann durch Vernetzung von spezifischen Molekülen, wie beispielsweise Proteinen, an reaktiven Stellen des modellierten Substrats erhalten werden (Aplin & Hughes, Analyt. Biochem. 113: 144-148, 1981).

Eine andere Entwicklung eines optischen Systems zum Modellieren eines Substrats und Bilden von reaktiven Stellen basiert auf der Verwendung von tiefen UV-Strahlen, die durch eine optische Maske gerichtet werden, um aktive Orte zu erhalten, die aus polaren Silanolgruppen bestehen. Diese Gruppen bilden die Stellen der Matrix und werden durch Paarung mit anderen reaktiven Gruppen weiterhin modifiziert, wie in US Patent Nr. 5,324,591 offenbart. Dieses optische Verfahren zum Bilden von gleichförmigen Zellmatrizen auf einem Substrat erfordert weniger Schritte als das fotolithografische Verfahren, aber erfordert ultraviolettes Licht in hoher Intensität, und geeignete Lichtquellen sind sehr teuer.

In all diesen Verfahren ist die resultierende Zellmatrix zudem gleichförmig, weil die biochemisch spezifischen Moleküle an die chemisch mikromodellierten Matrizen gebunden sind. Mit dem Fotolithografie-Verfahren binden die Zellen an Matrizen aus hydrophilen Stellen und/oder an spezifische Moleküle, die an den Stellen anhaften, die die Zellen binden. Dementsprechend binden die Zellen an all die Stellen der Matrix auf die gleiche Weise. Mit dem optischen Verfahren binden die Zellen an Matrizen, die Stellen aus freien Aminosäuregruppen enthalten, durch Haftung. Es gibt wenig oder keinen Unterschied zwischen diesen Stellen. Hier binden die Zellen wieder an all die Stellen auf die gleichen Weise, und es ist möglich, nur einen gegebenen Zellwechselwirkungtyp unter Verwendung dieser Matrizen zu studieren, weil irgendeine Stelle im Wesentlichen die gleiche wie eine andere ist.

Diesem Matrixtyp fehlt daher eine Flexibilität als ein Instrument für die Analyse einer einzelnen spezifischen Varietät von Zelle oder Wechselwirkung. Folglich entsteht der Bedarf zur Herstellung von Zellmatrizen, die nicht gleichförmig mikromodelliert sind, um die Anzahl an Zellen oder Wechselwirkungen zu erhöhen, die gleichzeitig analysiert werden können.

Die Internationalen Patentanmeldungen WO 00/39587 und WO 00/47996 veranschaulichen ein System aus Sensoren und Verfahren zur Herstellung von Matrizen, zusammengesetzt oder anders, aus Beads oder Zellen, die an den Spitzen von Bündeln von optischen Fasern zufällig angeordnet sind. Während einerseits die in diesen Anmeldungen beschriebenen Verfahren ein großes analytisches Potenzial, insbesondere in dem Fall von Proteinen und Nukleinsäuren, bieten, ist es ein Nachteil, dass sie dem Experimentator weder gestatten, Bestände von Interesse, die identifiziert werden können, abzutrennen noch geschweige denn wieder zu gewinnen.

Eine Durchführung einer Untersuchung mit hohem Durchsatz bei vielen Tausenden an Verbindungen erfordert die parallele Manipulation und die Behandlung von vielen Verbindungen und der Reagenzien, die in dieser Untersuchung enthalten sind; zudem muss es ein Verfahren zum Identifizieren und Messen der Resultate des Experiments in der einfachsten, möglichen Weise geben. Die üblicheren Untersuchungen verwendenden homogene Elends aus Verbindungen und biologischen Reagenzien zusammen mit mindestens einer Markerverbindung, die in eine Standard-Mikrotiterplatte mit 96 oder 384 Vertiefungen geladen werden (Kahl et al., J. Biomol. Scr. 2:33-40, 1997). Die von jeder Vertiefung gemessenen Signale, ob Fluoreszenzemissionen, optische Dichte oder Radioaktivität, werden mit dem Signal von all dem Material integriert, das die Vertiefung einnimmt, um einen allgemeinen Durchschnitt des Bestands von allen Molekülen in der Vertiefung zu geben. Dieser Untersuchungstyp wird üblicherweise eine homogene Untersuchung genannt.

Weil Fluoreszenz unter den Systemen am meisten verbreitet verwendet wird, sind verschiedene Verfahren zur Erzeugung von Bildern von fluoreszierenden Zellen mit einem Mikroskop und Extrahieren von Information über die räumliche Verteilung und die Änderungen entwickelt worden, die über die Zeit in diesen Zellen auftreten. Viele dieser Verfahren und ihre Anwendungen sind in einem Artikel von Taylor et al., Am. Scientist 80:322-335, 1992 beschrieben.

Die vorgeschlagenen Verfahren sind bei der Herstellung einer kleinen Anzahl an Proben im Hinblick darauf entworfen und optimiert worden, dass die Verteilung, Menge und biochemisches Profil der fluoreszierenden Reportermoleküle, die in den Zellen vorhanden sind, gemessen werden können, wobei ein hohes Niveau an räumlicher und zeitlicher Auflösung erhalten wird.

Nützliche Detektionsverfahren schließen Behandelung der Zellen mit Farbstoffen und fluoreszieren den Reagenzien ein, um Bilder zu erhalten und/oder die Zellen genetisch zu modifizieren, derart, dass sie fluoreszierende Proteine wie modifiziertes grünes fluoreszierendes Protein (GFP) herstellen werden. Die Verwendung von GFP in der Studie der Genexpression und der Lokalisierung von Proteinen werden ausführlich von Chalfic et al., in Science 263:803-805 diskutiert.

Dennoch sind diese Verfahren komplex, teuer und langsam, und sie können nur verwendet werden, um Zellen in Gruppen, nicht einzeln, zu studieren.

Dielektrophorese betrifft das physikalische Phänomen, durch das dielektrische Teilchen, die räumlich ungleichförmigen elektrischen Gleichstrom- oder Wechselstrom-Feldern unterworfen sind, einer Nettokraft ausgesetzt sind, die in Richtung zu jenen Raumbereichen gerichtet ist, die durch ansteigende (pDEP) oder abnehmende (nDEP) Feldstärke charakterisiert sind. Wenn die Stärke der resultierenden Kräfte vergleichbar mit der Schwerkraft ist, ist es im Wesentlichen möglich, ein Gleichgewicht an Kräften zu bilden, das die Levitation von kleinen Teilchen ermöglicht. Die Stärke, Richtung und Orientierung der Dielektrophoresekraft sind stark von den dielektrischen und leitenden Eigenschaften des Körpers und von dem Medium abhängig, in das er geworfen wird, und diese Eigenschaften variieren wiederum mit der Frequenz.

Studien, die die Effekte von Dielektrophoresekräften auf Mikroorganismen oder biologische Stoffe im Allgemeinen (Zellen, Bakterien, Viren, DNA usw.) und auf anorganische Stoffe analysieren, haben irgendwann einmal die Vorstellung der Ausbeutung dieser Kräfte als ein Mittel zum Selektieren eines besonderen Körpers aus einer Probe, die eine Vielzahl an Mikroorganismen enthält, unter Charakterisierung der physikalischen Eigenschaften von Mikroorganismen und im Allgemeinen unter Gestatten ihrer Manipulation angedeutet.

Beispielhaft lehrt die Internationale Patentanmeldung WO 00/47322 die Manipulation von generischen „Packungen" aus Substanzen (flüssig, fest oder gasförmig) unter Verwendung von Dielektrophoresekräften, die zwischen benachbarten Elektroden einer ansprechbaren Anordnung erzeugt werden. Trotzdem ist das in dieser Druckschrift beschriebene Verfahren nicht zur Durchführung einer Studie mit hohem biologischen Wert an Zellen und allgemeiner an Mikroorganismen oder Teilen davon (DNA- und RNA-Sequenzen, Plasmide usw.) geeignet, weil einerseits die „Packung" signifikanten Spannungen unterworfen wird, um ihre Manipulation durch Dielektrophorese zu gestatten, und andererseits allgemeiner Reibung gegenüber der Reaktionsoberfläche unterworfen wird, die die Anordnung von Elektroden trägt.

Der Stand der Technik umfasst ein anderes System, das auf der Bildung von dreidimensionalen Zellenmanipulationskäfigen durch Konstruieren von Mikrooktupolen basiert (T. Schnelle et al., in Biochimica et Biophysica Acta, 1157:127-140); in diesem Fall ist das Zellmaterial frei schwebend und daher von Reib- oder anderen mechanischen Belastungen unbeeinflusst, insbesondere in dem Fall, in dem die Abmessungen des angepassten Manipulationssystems mit jenen der Teilchen, die manipuliert werden, vergleichbar sind, folglich die Größenordnung der Spannungen reduzierend, die verwendet werden, um die notwendigen Feldverteilungen zu bilden, wenn unerwünschte Effekte auftreten (Washizu & Kurosawa, Trans. Ind. Appl. 26:1165-1172, 1990; Washizu et al., Trans. Ind. Appl. 30:835-843, 1994).

Die in der Literatur vorgeschlagenen Strukturen treffen jedoch auf Ausführungsformprobleme, wenn die Abmessungen des geplanten Käfigs sich jenen der tatsächlichen Zellen (mit dem Zweck eine einzelne Zelle einzufangen) annähern. In diesem Fall besteht das Problem in der Ausrichtung der zwei Strukturen, die miteinander auf einer mikrometrischen Skala zusammengebaut sind, die das Oktupol bilden.

Dieses besondere Problem wird gemäß der Internationalen Patentanmeldung WO 00/69565 gelöst, die eine Vorrichtung und ein Verfahren für die Manipulation von Teilchen (der Ausdruck „Teilchen", wird hierin nachstehend verwendet, um dielektrophoretisch manipulierte, in Experimenten verwendete Elemente zu bezeichnen, ob sie biologische Funktionseinheiten, mit einem Zuführmittel vermischte Substanzen oder beides sind; welcher der drei Fälle beabsichtigt ist, wird aus dem Kontext erkennbar sein) unter Verwendung von geschlossenen Dielektrophoresepotenzialkäfigen offenbart. Weitere Verfahren sind aus der WO 00/32774, EP-A-1088592, WO 99/38612, EP-A-0815942 und WO 00/47322 bekannt.

Auf alle Fälle sind die letzteren Verfahren zur Manipulation, die auf dielektrophoretischer Levitation des Materials zur Analyse basieren, gegenwärtig auf die Trennung und/oder Zählung der manipulierten Teilchen eingeschränkt, was durch Erkennung von eben derselben Teilchen unter Verwendung von geeigneten Sensoren vom spezifischen Typ ermöglich wird, die in der Anordnung von Elektroden hergestellt und integriert sind und/oder innerhalb oder außerhalb der Kammer angeordnet sind, in der die levitationale Manipulation stattfindet. Das bedeutet, dass solche Verfahren nur für Teilchen mit intrinsischen, ausgeprägten Charakteristiken (unterschieden auf der Basis der Größe, zum Beispiel) verwendet werden können, die mit spezifischen Sensoren detektierbar sind, die auf einer Basis des fallweisen Vorgehens hergestellt werden müssen.

Die Aufgabe der Erfindung ist, die verschiedenen Nachteile, auf die in Verfahren vom Stand der Technik gestoßen wird, wie vorstehend für die Manipulation von Zellen und allgemeiner von chemischem/biologischem Material umrissen, zu dem Zweck zu überwinden, dass chemische und pharmakologische Untersuchungen mit hohem Durchsatz rasch, effizient, ökonomisch, mit Präzision und ohne den Bedarf (zumindest anfänglich) der Verwendung von Tieren, wie beispielsweise Meerschweinchen, durchgeführt werden können.

Chemisches/biologisches Material bedeutet, insbesondere hier und überall in der Beschreibung, irgendeine gegebene „Funktionseinheit", ob bestehend aus einer „Verbindung" oder einer „Verbindungseinheit", wie nachstehend definiert, oder aus einer Zelle.

Hier und überall in der Beschreibung wird der Ausdruck „Verbindung" benutzt, um irgendeine gegebene Substanz zu bedeuten, die wahrscheinlich zur pharmazeutischen Aktivität in der Lage ist, nämlich potenziell transformante DNA oder eine chemische Substanz, wie gefunden, oder, wenn notwendig, auf der Oberfläche von Mikrobeads geeignet immobilisiert oder in einer Lipid-Doppelschicht oder Liposom mikroverkapselt, oder in einem Virus, der genetisch oder auf eine andere Weise modifiziert ist, der in der Lage ist, als ein Vektor für genetisches Material zu fungieren. Hier und überall in der Beschreibung wird der Ausdruck „Verbindungseinheit" benutzt, um ein Liposom, das eine vorbestimmte Menge einer Verbindung, wie vorstehend definiert, enthält, oder ein einzelner Vektorvirus zu bedeuten. In dem Fall, dass chemische Substanzen verwendet werden, um ein Mikrobead zu beschichten, wird eine „Verbindungseinheit" benutzt, um ein Mikrobead zu bedeuten, das eine vorbestimmte Menge einer Verbindung aufweist, die auf seiner Oberfläche immobilisiert ist.

Mit den vorangehenden Definitionen im Gedächtnis ist eine erste Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Durchführung von Tests und Untersuchungen mit hohem Durchsatz und hohem biologischen Wert bei Funktionseinheiten bereitzustellen, die aus einzelnen Zellen oder aus Verbindungseinheiten bestehen, deren Natur a priori sogar unbekannt sein kann, sodass es eine Identifizierung von Zellen oder Verbindungseinheiten von unbekannter Natur in einem anfänglich gemischten Bestand und möglicherweise danach eine Trennung der identifizierten Zellen und/oder Verbindungseinheiten von dem anfänglichen Bestand gestattet.

Eine zweite Aufgabe der Erfindung ist, ein Verfahren zur Durchführung von Tests und Untersuchungen mit hohem Durchsatz und hohem biologischen Wert bei einzelnen Zellen bereitzustellen, das eine Identifizierung der biologischen Aktivität bei den einzelnen Zellen von einer oder mehreren ausgewählten Verbindungen, die möglicherweise von einer oder mehreren einzelnen identifizierbaren Verbindungseinheiten zugeführt werden, durch Überwachen der Antwort auf die Zellen bei der Verabreichung solcher Verbindungen gestattet. Bevorzugt ist ebenfalls eine Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren des vorgeschlagenen Typs zur Untersuchung der biologischen Aktivität bereitzustellen, das einer Verbindung gestattet, zu einer Zeit zu den Zellen, bevorzugt unter Einsatz von vorbestimmten und einstellbaren Dosierungen, verabreicht zu werden.

Eine dritte Aufgabe der Erfindung ist, eine Testvorrichtung bereitzustellen, die Verwendung von einer dielektrophoretischen Manipulation macht und zur Ausführung der vorstehend angegebenen Verfahren geeignet sein wird, die eine stabile Levitation von neutralen dielektrischen Teilchen oder elektrisch geladenen Teilchen (Zellen oder Verbindungen) zu dem Zweck der Verifizierung und Steuerung der Position jeder einzelnen Zelle oder Verbindung gestattet, die in der Vorrichtung vorhanden ist.

Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist schließlich, ein einfaches, rasches, effektives und zuverlässiges Verfahren zur Zuführung von Verbindungen oder Verbindungseinheiten zu Zellen oder Mikroorganismen bereitzustellen.

Unter Betrachtung eines ersten Aspekts der Offenbarung betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Durchführung von Tests und Untersuchungen mit hohem Durchsatz und hohem biologischen Wert bei einer Probe, welche chemisches/biologisches Material enthält, bestehend aus unbekannten Funktionseinheiten, wie in Anspruch 1 beansprucht. Insbesondere umfasst solch ein Verfahren die Schritte:

• (a) – Einführen der Probe einschließlich der unbekannten Funktionseinheiten in eine erste Kammer einer Testvorrichtung, umfassend mindestens eine Anordnung von ersten selektiv ansteuerbaren und aktivierbaren Elektroden und mindestens eine zweite den ersten Elektroden gegenüber angeordnete und zugewandte zweite Elektrode;
• (b) – Einführen von chemischem/biologischem Material in eine erste Kammer der Testvorrichtung, bestehend aus bekannten Funktionseinheiten, die innerhalb der Testvorrichtung identifizierbar sind und eine vorausgesetzte Affinität mit den unbekannten Funktionseinheiten aufweisen;
• (c) – selektives Bilden von geschlossenen bewegbaren Potentialkäfigen innerhalb der ersten Kammer mittels Dielektrophoresekraft, gebildet durch die gegenüberliegenden Elektroden, und Einfangen mindestens eines Teils der unbekannten Funktionseinheiten innerhalb der bewegbaren Käfige;
• (d) – Bewegen mindestens eines der bewegbaren Käfige, enthaltend die bekannten Funktionseinheiten, in Richtung der bewegbaren Käfige, enthaltend die unbekannten Funktionseinheiten, und Hervorrufen einer Wechselwirkung von mindestens einer unbekannten Funktionseinheit mit mindestens einer bekannten Funktionseinheit mindestens eines ersten Typs durch Bewirken der Fusion mindestens eines Paares von bewegbaren Käfigen, enthaltend die jeweiligen Funktionseinheiten;
• (e) – Verifizieren der Bildung oder auf andere Weise einer stabilen Bindung zwischen der mindestens einen unbekannten Funktionseinheit und der mindestens einen bekannten Funktionseinheit des ersten Typs zu dem Zweck der Bestimmung, ob eine Affinität zwischen den beiden besteht, und folgliches Identifizieren der mindestens einen unbekannten Funktionseinheit.

Die auf diese Weise identifizierten, unbekannten Funktionseinheiten werden bevorzugt gezählt und von den verbleibenden Funktionseinheiten getrennt und außerhalb von der Testvorrichtung wieder gewonnen, nachdem sie zu einer zweiten Kammer der Testvorrichtung übertragen wurden.

Auf diese Weise und insbesondere unter Verwendung von Mikrobeads als die bekannten Funktionseinheiten (funktionalisiert, zum Beispiel, mit speziellen Antikörpern oder mit einem Liganden) kann das Verfahren gemäß der Erfindung in dem Gebiet der Diagnostik zur Identifizierung und denkbar zur Zählung eines gegebenen Organismus in einer Probe, zur Trennung von Zellen auf der Basis der antigenetischen Charakteristiken, zum Beispiel, beim Trennen von neoplastischen Zellen von normalen Zellen oder zum Studieren der Zellantwort verwendet werden, die durch die Bindung eines Ligands an seinen spezifischen Rezeptor ausgelöst wird.

Unter Betrachtung eines zweiten Aspekts der Offenbarung betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Durchführung von Tests und Untersuchungen mit hohem Durchsatz und hohem biologischen Wert bei einer Vielzahl von ersten Funktionseinheiten, ausgewählt aus einer Gruppe, einschließlich Zellen, Viren, Mikroorganismen, Nukleinsäuren und Kombinationen von diesen, und einer Vielzahl von zweiten Funktionseinheiten, bestehend aus Verbindungen oder Verbindungseinheiten, welche hinsichtlich ihrer biologischen Aktivität gegenüber den ersten Funktionseinheiten getestet werden sollen, wie in Anspruch 20 beansprucht; insbesondere umfasst solch ein Verfahren die Schritte:

• (a) – Einführen der ersten und der zweiten Funktionseinheiten in eine erste Kammer einer Testvorrichtung, umfassend mindestens eine Anordnung von ersten selektiv ansteuerbaren und aktivierbaren Elektroden und mindesten einer zweiten gegenüber den ersten Elektroden und diesen zugewandt angeordneten zweiten Elektrode;
• (b) – selektives Bilden von geschlossenen bewegbaren Potentialkäfigen innerhalb der ersten Kammer mittels einer Dielektrophoresekraft, gebildet durch die gegenüberliegenden Elektroden, und Einfangen mindestens eines Teils der Funktionseinheiten innerhalb der bewegbaren Käfige;
• (c) – Bewegen mindestens eines der bewegbaren Käfige, enthaltend die ersten Funktionseinheiten, in Richtung der bewegbaren Käfige, enthaltend die zweiten Funktionseinheiten, und Hervorrufen einer Wechselwirkung mindestens einer ersten Funktionseinheit mit mindestens einer zweiten Funktionseinheit mindestens eines ersten Typs durch Bewirken der Fusion mindestens eines Paars von bewegbaren Käfigen, welche die jeweiligen Funktionseinheiten enthalten;
• (d) – Verifizieren der biologischen Aktivität der zweiten Funktionseinheit gegenüber der ersten Funktionseinheit durch Analysieren der resultierenden Wechselwirkung unter Verwendung von zur Detektion irgendeines Beweises fähigen Sensors in der ersten Funktionseinheit mindestens eines aus einer ausgewählten Gruppe von Effekten, nämlich der cytostatischen, cytotoxischen, mitotischen Expression eines Markers.

Exakter werden die vorstehend erwähnten cytostatischen, cytotoxischen, mitotischen Effekte durch Verifizieren der Anwesenheit und/oder geänderten Anwesenheit der ersten Funktionseinheiten in den bewegbaren Käfigen detektiert, die um sie und/oder in Nähe zu einer Vielzahl an ersten Elektroden gebildet sind, die unmittelbar benachbart zu den bewegbaren Käfigen positioniert sind, die die ersten Funktionseinheiten enthalten, und die vor der Ausführung des vorstehend erwähnten Schritts (c) durch leer bewegbare Käfige frei oder belegt gelassen werden.

Es wird folglich möglich, viele Tausende von Experimenten parallel innerhalb der gleichen Vorrichtung durchzuführen. Zellen des gleichen Typs können mit einer Kombination von verschiedenen Verbindungen behandelt werden, oder alternativ kann eine Kombination von Zellen mit einer Verbindung behandelt werden, oder wiederum kann eine Kombination aus beiden Lösungen verwendet werden. Die Anzahl an Experimenten, die mit diesem Verfahren möglich ist, kann weiterhin durch Variieren der „Dosis" der zu jeder einzelnen Zelle verabreichten Verbindungen oder der Menge eines bestimmten Verbindungstyps erhöht werden.

Neben dem Vorteil des hohen Durchsatzes gestattet das Verfahren, dass Experimente bei hoher Geschwindigkeit mittels der Verwendung von geringen Reaktionsvolumen, das heißt kleinen Mengen von Verbindungen, ebenso von Puffern und anderen Reagenzien, durchgeführt werden. Tatsächlich weist das Hilfsmittel zur Positionierung der Teilchen durch dielektrophoretische Levitation den Effekt der Minimierung der Manipulation der Flüssigkeit unter Verwendung von unhandlichen und teuren Mikrofluidsystemen auf.

Dies weist ebenfalls einen zusätzlichen und offensichtlichen positiven Einfluss auf die Unkosten der Durchführung des Experiments auf, weil es möglich ist, den Bedarf an großen Mengen von Verbindungen zu reduzieren, die besonders teuer und/oder schwierig durch Synthese zu erhalten sind.

Im Gegensatz zu „traditionellen" Systemen zur Immobilisierung von Zellen (basierend auf einer chemischen Bindung – spezifisch oder auf eine andere Weise – mit einem Substrat), wird die Anordnung von Zellen gemäß der vorliegenden Erfindung mittels dielektrophoretischer Levitation erreicht, sodass es keinen Kontakt und keine Bindung, egal welche, zwischen dem Material und der Vorrichtung gibt, und dies soll gewährleisten, dass die physiologische Antwort natürlicher ist.

Im Vergleich zu Systemen, die auf vielen Kammern (Mikrotitern usw.) basieren, besteht ein weiterer Unterschied und Vorteil in der Tatsache, dass die Zelle-Verbindung-Wechselwirkungen alle in der gleichen Kammer der einen Vorrichtung und in der Praxis gleichzeitig auftreten können. Dies reduziert das Auftreten von Fehlern in der Analyse, die mit dem Apparat auftreten, der getrennte Kammern oder Vertiefungen aufweist, weil die Bedingungen, unter denen das Experiment durchgeführt wird, durch eine größere Gleichförmigkeit gekennzeichnet sind.

Das offenbarte Verfahren ermöglicht ebenfalls die Analyse einer Antwort einer einzelnen Zelle und nicht nur die des statistischen Mittels in einem Bestand aus homogenen Zellen, wie es in nahezu allen der bis jetzt vorgeschlagenen Verfahren auftritt. Dies wird durch die Übernahme von integrierten Abtastsystemen vom optischen oder kapazitiven Typ ermöglicht, die einen Verzicht von sperrigen Instrumenten erlaubt, die zu dem Zweck in diesem Gebiet (TV-Kamera, Mikroskop) traditionell verwendet werden, wenn auch solche Instrumente genauso gut für die visuelle Überwachung von Ereignissen, die innerhalb der Vorrichtung auftreten, oder einfach, wenn bevorzugt, aus welchen Grund auch immer, verwendet werden können.

Zudem können herkömmliche Regelungstechniken eingesetzt werden, die die Information verarbeiten, die von den Sensoren zurückkommt, die in die Vorrichtung integriert sind, um eine Reihe von komplexen Tätigkeiten im vollständig automatischen Modus auszuführen, wie beispielsweise die selektive Wiedergewinnung von bestimmten Teilchen, die eine Analyse durchmachen.

Eigentlich kann das gesamte Verfahren automatisiert und elektronisch gesteuert werden, was es insbesondere anpassbar an variierende Benutzeranforderungen macht. Das erreichbare hohe Automatisierungsniveau schränkt ebenfalls das Auftreten von Fehlern ein, das üblicherweise mit den wiederholten manuellen Tätigkeiten verbunden ist, die in anderen Screening-Prozeduren durchgeführt werden.

Zudem kann das offenbarte Verfahren verwendet werden, um nicht nur potenzielle pharmazeutische Verbindungen, die mikroverkapselt oder anders sind, sondern ebenfalls passend funktionalisierte Mikrobeads zuführen.

Solche Beads können Abmessungen aufweisen, die mit jenen von Zellen vergleichbar oder sogar viel kleiner sind, und durch herkömmliche Verfahren, zum Beispiel, mit Antikörpern (Ab) oder anderen Substanzen beschichtet werden, die fähig sind, mit Zellrezeptoren zu Wechselwirken.

Mit Sonden-DNA (oder RNA) passend beschichtete Mikrobeads können hergestellt werden, sodass sie mit anderen, die mit Ziel-DNA (oder RNA) beschichtet sind, als Teil eines Hybridisierungstests Wechselwirken, zum Beispiel, um das Ziel (Molekulardiagnostik) oder in der Einzel-Nukleotid-Polymorphismus-(SNP bzw. bzw. single nucleotid polymorphism) Analyse zu identifizieren.

Unter Betrachtung eines dritten Aspekts der Offenbarung betrifft die Erfindung eine multifunktionelle Testvorrichtung, bestehend aus einem ersten Modul, umfassend eine Anordnung von ersten Elektroden, welche einzeln und selektiv ansteuerbar und aktivierbar mindestens zum Teil sind, angeordnet auf einem isolierenden Träger; einem zweiten Modul, umfassend mindestens eine zweite Elektrode, positioniert gegenüber und den ersten Elektroden zugewandt, und eine obere Trägerstruktur; ebenso einem Abstandselement, welches zwischen dem ersten und zweiten Modul angeordnet ist und eine flüssige oder halbflüssige Umgebung während des Betriebs abgrenzt, dadurch gekennzeichnet, dass das Abstandselement in einer solchen Art und Weise ausgeführt ist, dass mindestens eine erste Kammer und mindestens eine zweite Kammer innerhalb der Vorrichtung vorgesehen ist, hydraulisch mittels mindestens einer schmalen Passage verbunden, und die flüssige oder halbflüssige Umgebung abgrenzend, welche auf diese Weise durch die mindestens eine schmale Passage in mindestens zwei Teilumgebungen aufgeteilt ist, welche gegenseitig hydraulisch unbeeinflusst sind und mit den mindestens zwei Kammern übereinstimmen.

Die zwei Kammern sind mit selektiv und kontrollierbar zu öffnenden Öffnungen versehen, die als jeweilige Einlassöffnungen und Auslassöffnungen dienen, und wobei die Anordnung der ersten Elektroden als Boden der Kammern und der mindestens einen schmalen Passage, welche den Austausch zwischen den Kammern ermöglicht, dient.

Mit dieser Lösung wird es möglich, Tests und Tätigkeiten in Anzahlen auszuführen, die bis jetzt nicht durch eine einzelne Testvorrichtung gehandhabt, rasch und zuverlässig, mit Leichtigkeit und geringen Kosten (vorausgesetzt, dass die Prozeduren alle ohne Schwierigkeit durch elektronische Programmierung ausgeführt werden können) ausgeführt werden konnten. Tatsächlich offenbaren die Lösungen vom Stand der Technik, die bis jetzt in dem Gebiet der Kombinatorischen Chemie vorgeschlagen wurden, allerlei Probleme, von denen viele mit der Vorrichtung gemäß der Erfindung aufgrund ihrer Fähigkeit überwunden werden können, eine räumliche Verteilung von Teilchen zu bilden oder einfacher ihre Position zu steuern, wobei eine gezielte Verteilung von elektrischen Feldern eingesetzt wird, die entworfen sind, um geschlossene Potenzialkäfige mittels Dielektrophoresekraft zu bilden. Diese Käfige können auf eine solche Weise manipuliert werden, dass ein innerhalb eines entsprechenden Käfigs gefangenes Teilchen gebildet wird, um nennenswerte Abstände innerhalb der Vorrichtung abzudecken.

Schließlich betrifft die Vorrichtung ein Verfahren zum Transportieren erster Funktionseinheiten, bestehend aus Verbindungen oder Verbindungseinheiten, in zweite Funktionseinheiten, wie in Anspruch 40 beansprucht; solch ein Verfahren umfasst die Schritte:

• (a) – des Einführens der ersten und zweiten Funktionseinheiten in eine Kammer einer Testvorrichtung, umfassend mindestens eine Anordnung erster selektiv ansteuerbarer und aktivierbarer Elektroden und mindestens eine zweite Elektrode, welche gegenüber den ersten Elektroden und diesen zugewandt angeordnet ist;
• (b) – des selektiven Bildens von geschlossenen bewegbaren Potentialkäfigen innerhalb der Kammer mittels einer Dielektrophoresekraft, gebildet durch die gegenüberliegenden Elektroden, und des Einfangens mindestens eines Teils der Funktionseinheiten innerhalb der bewegbaren Käfige;
• (c) – der Identifizierung und Auswahl der die ersten Funktionseinheiten enthaltenden Käfige;
• (d) – des Bewegens mindestens eines der bewegbaren Käfige, enthaltend die ersten Funktionseinheiten, in Richtung der bewegbaren Käfige, enthaltend die zweiten Funktionseinheiten;
• (e) – des Hervorrufens der Fusion mindestens eines bewegbaren Käfigs, enthaltend eine erste Funktionseinheit, mit einem bewegbaren Käfig, enthaltend eine zweite Funktionseinheit.

Das Verfahren bietet folglich die Möglichkeit des Bringens von ausgewählten Substanzen in Kontakt mit anderen ausgewählten Substanzen oder Organismen in einer gesteuerten Weise, rasch und effektiv, nicht nur zu dem Zweck des Durchführens von Tests, sondern ebenfalls zum vorsätzlichen Herbeiführen von Änderungen oder Reaktionen, während des Haltens der Reaktionsprodukte „innerhalb von Grenzen", zum Beispiel, unter Erzeugung von genetischen Änderungen in Mikroorganismen, die anschließend leicht wieder gewonnen werden können.

Andere Merkmale und Vorteile der Erfindung werden von der folgenden Beschreibung von bestimmten bevorzugten Ausführungsform, die beispielhaft veranschaulicht sind, und keine Einschränkung beinhalten, mit Hilfe der begleitenden Zeichnungen klarer zum Vorschein kommen.

1 veranschaulicht einen Teil einer herkömmlichen Vorrichtung für die Manipulation von Proben durch Dielektrophorese, schematisch und in Perspektive gesehen;

2 ist eine schematische dreidimensionale Ansicht der Vorrichtung, die gemäß der Vorliegenden Erfindung ausgeführt ist;

3 ist eine schematische Veranschaulichung, die eine der möglichen Ordnungsstrategien zeigt, die in dem Verfahren gemäß der Erfindung verwendet werden kann, die aus Einführung und Platzierung besteht, was nacheinander für die verschiedenen Typen an Zellen ausgeführt wird;

4 veranschaulich eine Ordnungsstrategie, die aus der gleichzeitigen Einführung von einigen Spezies und der selektiven Platzierung von verschiedenen Spezies besteht;

5 zeigt die Kurve, die durch Dielektrophoresekraft unter Bedingungen des Variierens der Frequenz für Zellen (BIO) und für Mikrobeads (BEAD) beschrieben wird;

6 veranschaulicht die Tätigkeit des Dielektrophoresesystems, das gemäß der Erfindung verwendet wird, wenn zwei Käfige fusioniert werden, wobei einer eine Zelle zur Analyse enthält, und der andere ein mit Antikörpern beschichtetes Mikrobead mit Abmessungen enthält, die mit jenen der Zelle vergleichbar sind, in dem Fall eines Zusammenpassens (6a) und keines Zusammenpassens (6b) zwischen Antigen und Antikörper;

7 veranschaulicht die Tätigkeit des Dielektrophoresesystems, das gemäß der Erfindung verwendet wird, wenn zwei Käfige fusioniert werden, wobei einer eine Zelle zur Analyse enthält, und der andere mit Antikörpern beschichtete Mikrobeads mit Abmessungen enthält, die geringer als jene der Zelle sind, in dem Fall eines Zusammenpassens zwischen Antigen und Antikörper mit einer vorherrschenden positiven Dielektrophoresekraft (7a), eines Zusammenpassens, aber mit einer vorherrschenden negativen Dielektrophoresekraft (7b) und keines Zusammenpassens (7c);

8 schließt eine Grafik ein, die eine Anzahl an Potenzialminima zeigt, und veranschaulicht die Versetzung einer neu erzeugten Zelle von dem Minimum, das von der Elternzelle belegt ist, zu dem benachbarten Minimum;

9 veranschaulicht die Schritte der Analyse und Selektion von spezifischen Zellen unter Verwendung von Mikrobeads, die mit spezifischen Antikörpern funktionalisiert sind.

Unter Bezugnahme auf 1 und 2 basiert die vorliegende Erfindung auf der Verwendung einer Testvorrichtung, die eine Technologie ausführt, die in der Internationalen Patentanmeldung WO 00/69565 offenbart ist, die von der selben Anmelderin eingereicht ist, deren Inhalt hier einbezogen ist, insoweit sie eine nützliche Bezugnahme für die Zwecke der vorliegenden Offenbarung bereitstellt; tatsächlich beinhaltet die hierin beschriebene Vorrichtung neue und originelle strukturelle Merkmale, die nicht in der vorstehend erwähnten Anmeldung erwähnt sind, die insbesondere in solch einer Weise entworfen sind, dass die Test- und Untersuchungsverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung einfach, effizient, ökonomisch und mit einer rationellen Verwendung vom Raum durchgeführt werden können.

Die vorgeschlagene Vorrichtung, die in 1 schematisch veranschaulicht ist, umfasst zwei Hauptmodule, von denen ein erstes aus einer Anordnung M1 von Elektroden LIJ besteht, die in ordnungsgemäßer Basis auf einer isolierenden Trägerstruktur A1 angeordnet sind. Die Elektroden LIJ können aus irgendeinem gegebenen leitfähigen Material gestaltet sein, das bevorzugt ausgewählt ist aus den Metallen, die mit der Technologie der elektronischen Integration kompatibel sind, während das isolierende Medium der Trägerstruktur A1 Siliziumoxid oder gewiss irgendein anderes isolierendes Material sein kann.

Die Form der Elektroden LIJ, die die Anordnung M1 bilden, kann aus einer Anzahl an Typen ausgewählt werden; in 1 sind die Elektroden LIJ quadratisch, wenn dies auch keine Einschränkung beinhaltet. Jedes Element der Anordnung M1 besteht aus einer einzelnen Elektrode LIJ, die dazu dient, einen Dielektrophoresekäfig S1 zu erzeugen, um mittels dem eine biologische Probe BIO innerhalb einer flüssigen oder halbflüssigen Umgebung L zu manipulieren, die durch ein Abstandselement A3 abgegrenzt ist.

Eine Region C unterhalb der Elektroden dient dazu, integrierte Abtastschaltungen unterzubringen, die in die Vorrichtung integriert werden können, das heißt, Sensoren aus einer herkömmlichen Ausführungsform (der Einfachheit halber nicht veranschaulicht), die aus einer Anzahl an Typen ausgewählt sind, sodass sie die Anwesenheit einer zu manipulierenden Funktionseinheit innerhalb der von den Elektroden erzeugten Potenzialkäfige S1 detektieren werden. In einer bevorzugten Ausführungsform der Vorrichtung besteht das zweite Hauptmodul im Wesentlichen aus einer einzelnen großen Elektrode M2, die die Vorrichtung in ihrer Gesamtheit abdeckt. Schließlich kann die Vorrichtung ebenfalls eine obere Trägerstruktur A2 einschließen, die ebenfalls als ein Deckel für die Vorrichtung fungiert und die die flüssige oder halbflüssige Umgebung L einschließt.

Die einfachste Form für die zweite Elektrode M2 ist die einer glatten, flachen und gleichmäßigen Oberfläche; andere Formen mit größerer oder geringerer Komplexität sind möglich (zum Beispiel ein Gitter aus gegebener Maschengröße, durch das Licht passieren kann). Das am meisten geeignete Material für die Elektrode M2 wird ein transparentes, leitfähiges Material sein, das auf einer Trägerstruktur A2 aus Glas abgelagert ist. Neben dem Gestatten des Einschlusses von Abtastschaltungen, wie vorher umrissen, wird diese Lösung ebenfalls die Verwendung von traditionellen optischen Inspektionsmitteln (Mikroskop und TV-Kamera) ermöglichen, die über der Vorrichtung positioniert sind.

Das schematische Diagramm von 2 stellt eine Vorrichtung DE dar, die gemäß der Erfindung ausgeführt ist und die von der Vorrichtung von 1 abgeleitet ist, und dementsprechend sind solche Details, die ähnlich oder identisch in den zwei Zeichnungen erscheinen, der Einfachheit halber unter Verwendung der gleichen Bezugszeichen angegeben.

Die Vorrichtung DE umfasst ein oberes Modul A2, das eine einzelne Elektrode M2 zeigt (die im Interesse der Einfachheit nicht angegeben ist), ein unteres Modul C, das eine Anordnung M1 von selektiv ansteuerbaren und aktivierbaren Elektroden LIJ (nicht veranschaulicht) trägt, ebenfalls einen Abstandshalter A3, der zwischen die zwei Hauptmodule A2 und C zwischengeschoben ist und eine flüssige oder halbflüssige Umgebung L umgibt, die bei Betrieb aus geeigneten Pufferlösungen bestehen wird. In diesem Fall ist der Abstandshalter A3 jedoch gemäß der Erfindung in solch einer Weise gestaltet, sodass er zwei innere Kammern F und FL bildet, die mittels mindestens einer schmalen Passage D hydraulisch verbunden sind und die Umgebung L abgrenzen, die folglich durch die schmale Passage D in zwei Teilumgebungen geteilt ist, die voneinander hydraulisch unbeeinflusst sind und mit den zwei Kammern F und FL übereinstimmen. Jede Kammer F und FL ist weiterhin mit selektiv und steuerbar öffenbaren Öffnungen ausgerüstet, die als Einlassöffnungen und Auslassöffnungen fungieren, die jeweils als I1 und O1 (Kammer F) und I2 und O2 (Kammer FL) bezeichnet sind; die Anordnung M1 von Elektroden LIJ fungiert als der Boden der beiden Kammern F und FL und der verbindenden schmalen Passage D.

Die so ausgeführte Vorrichtung wird gemäß der Erfindung in einer nun zu beschreibenden Weise verwendet.

In dem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung kann der Experimentator die Probe (seien es Zellen, mikroverkapselte potenzielle pharmazeutische Verbindungen oder funktionalisierte Mikrobeads) durch die relativen Einlassöffnungen I1 (2) und in die Manipulationsumgebung unter Verwendung herkömmlicher Instrumente, die dem Fachmann bekannt sind (peristaltische Pumpen, Pipettierhilfen, Hamilton-Spritzen usw.), unter Einsatz einer Prozedur einführen, die entsprechend den Anforderungen ganz automatisch sein oder die manuell vonstatten gehen kann. Die Probe wird einer Dielektrophoresekraft von geeigneter Stärke in solch einer Weise unterworfen, dass sie innerhalb eines Potenzialminimums eingefangen wird und sie veranlasst wird, innerhalb der Vorrichtung größere oder geringere Abstände zurückzulegen. Bevor diese Tätigkeiten beginnen können, müssen in jedem Fall die Kammern F und FL (2) der Vorrichtung mit einer geeigneten Pufferlösung mittels der Öffnungen I1 und I2 gefüllt werden. Während dieses Schritts werden die Öffnungen O1 und O2 auf der gegenüberliegenden Seite der Kammern offen gelassen, um die Bildung von Luftblasen zu vermeiden, die verhindern würden, dass die Vorrichtung DE korrekt funktioniert.

Die Tatsache, dass sie in der Lage ist, frei schwebende Teilchen durch die alleinige Dielektrophoresekraft zu versetzen, ist beim Minimieren der Manipulation der Flüssigkeit unter Verwendung von unhandlichen und teuren strömungsdynamischen Systemen (Mikrofluiden) behilflich. Die ausgewählten Teilchen können in der Einlassfläche F (an der vorübergehend ein hoher Durchfluss und eine mögliche Turbulenz ist) gesammelt und dann durch die schmale Passage D in dem zentralen Trenner und in die normalerweise durchflusslose benachbarte Kammer FL unter Bewegung der Teilchen eher als die Flüssigkeit und folglich unter Vermeidung von Belastung durch Reibung und Kontakt gerichtet werden. In dieser Weise können die Teilchen in einer ordnungsgemäßen Matrix angeordnet oder ihnen einfacher gestattet werden, die spontan innerhalb der Kammer angenommene Position aufrecht zu erhalten.

Die erforderliche Platzierung erzeugt und/oder aufrecht erhalten habend, ist es dann möglich, andere Teilchen zu versetzen, seien sie Zellen oder Verbindungen, die anzuordnen bzw. zu untersuchen sind, und sie in Kontakt mit jenen zu bringen, die zu analysieren sind.

Es ist daher möglich, Tausende von parallelen Experimenten innerhalb der gleichen Vorrichtung durchzuführen. Zellen des gleichen Typs können mit einer Kombination aus verschiedenen Verbindungen behandelt werden oder alternativ kann eine Kombination aus Zellen mit einer Verbindung behandelt werden. Es ist ebenfalls möglich, verschiedene Zellen mit verschiedenen Verbindungen in dem Verlauf von einem Experiment zu behandeln. Die Anzahl an Experimenten, die mit diesem Verfahren möglich ist, kann weiterhin durch Variieren der „Dosierung" der zu jeder Zelle verabreichten Verbindungen, d.h. der Anzahl an Einheiten eines bestimmten Verbindungstyps, oder sogar Verabreichen von verschiedenen Verbindungen in Folge zu jeder einzelnen Zelle erhöht werden.

Dies wird durch die folgende Formel veranschaulicht: N_E = n·2^(c·p)

Wobei NE die Anzahl an einzelnen Experimenten ist, die innerhalb des Gesamtexperiments durchgeführt werden können, n die Anzahl an verschiedenen verwendeten Zellen ist, c die Anzahl an verschiedenen verwendeten Zellen ist, und p die Dosierung der Verbindungen ist.

Die Weise, in der zu verabreichende Substanzen zu den Zellen von Interesse zugeführt werden, wird zuallererst davon, wo die Aktion stattfinden muss, in anderen Worten, ob die Substanz in die Zelle eingeführt werden muss oder ob sie mit einem Rezeptor außerhalb von der Zelle Wechselwirken kann, sowie von den chemischen und physikalischen Eigenschaften der Substanz abhängen, die getestet wird.

In Fällen, in denen die Substanz in die Zelle eingeführt werden muss, um ihre hypothetische Aktivität auszuführen, werden sich die Verfahren zur Zuführung gemäß den chemischen und physikalischen Eigenschaften von eben derselben Substanz signifikant ändern:

Diese Kategorie umfasst all jene Substanzen, die natürlich in der Lage sind, durch Zellgrenzen (Membran und Wand, wenn überhaupt eine vorhanden ist) durchzugehen, in anderen Worten weitgehend apolare Substanzen, die im Allgemeinen eine getrennte Phase in wässerigen Lösungen bilden (mit der Ausnahme von bestimmten polaren Substanzen, die in die Zelle durch Membrantransporterproteine spontan eingeführt werden). Für viele dieser apolaren Substanzen ist es ausreichend, Emulsionen unter Verwendung von Verfahren gemäß dem Stand der Technik herzustellen, in denen der Durchmesser der Substanzbeads in der Emulsion mit den Abmessungen der Dielektrophoresekäfige kompatibel sind, in denen sie manipuliert werden. Andere (z.B. Retinolsäuren) werden durch ein Liposom zugeführt, eingeschoben in Phospholipide als Bestandteile der Lipidschicht des Liposoms.

Diese Kategorie umfasst alle polaren Substanzen, die in die Zelle eintreten müssen, um ihre Aktion durchzuführen, aber die sich in wässerigen Lösungen lösen (einschließlich Nukleinsäuren). Um in die Zelle einzutreten, müssen diese Substanzen mikroverkapselt sein, zum Beispiel, in eine Doppelschicht aus Phospholipid (Liposom) eingebettet sein. Unter Fusion mit der Wand der Zielzelle kann das Liposom seinen Inhalt in das Cytoplasma zuführen. Es ist ebenfalls möglich, spezifische, mit der Substanz von Interesse imprägnierte Mikrobeads zu verwenden, die von der Zelle absorbiert werden.

Alternativ können, wie in dem Fall von Nukleinsäuren, zum Beispiel, Substanzen durch Viren vektorisiert werden, die, wenn angemessen, durch herkömmliche Verfahren genetisch modifiziert sind. Während Viren signifikant kleiner als Zellen sind, fällt das Hilfsmittel zur Manipulation von ihnen durch Dielektrophorese dennoch in den Umfang von Stand der Technik in diesem Gebiet.

Diese Kategorie schließt all jene Substanzen ein, deren Aktion der eines Rezeptor-Ligand-Mechanismuses entspricht. Ausgenommen, dass diese kleine Moleküle sind, die in dem ausgewählten Puffer löslich sind, müssen sie mit Hilfe von Mikrobeads zugeführt werden, das heißt unter Beschichtung von Mikrobeads aus geeignetem Material mit diesen gleichen Substanzen. Andere Typen an Molekülen können ebenfalls auf der Oberfläche von Liposomen zugeführt werden. Schließlich können andere Zellen selbst den Liganden zuführen.

Um Experimente auszuführen, die das offenbarte Verfahren einsetzen, muss der Experimentator notwendigerweise in der Lage sein, die Position und den Typ jeder verwendeten Zell und/oder Verbindung zu kennen.

Strategien zur Ordnen von Zellen und Verbindungen fallen im Wesentlichen in zwei Kategorien:

Eine mögliche Prozedur ist, die Zellen und/oder Verbindungen in die Vorrichtung der Reihe nach einzuführen. 3 zeigt ein Beispiel, wie Zellen der Reihe nach geordnet werden. In diesem Beispiel ist der Zelltyp offensichtlich vorher bekannt, und es ist ausreichend, Näherungssensoren in einer Ausrichtung mit mindestens einer Elektrodentasche der Vorrichtung anzuordnen. Die Käfige, die sich über diese Tasche bewegen, können gemäß der Anwesenheit oder Abwesenheit des Teilchens gekennzeichnet werden. Wenn die Anwesenheit abgetastet wird, wird das Teilchen auf der Anordnung platziert; wenn nicht, kann der Käfig ignoriert werden und der nächste Käfig in der Folge wird abgetastet. Die vorgeschlagene Prozedur kann unter Verwendung von externen Sensoren, wie beispielsweise mit einem Mikroskop verbundene TV-Kameras, ausgeführt werden, oder alternativ kann die Trägerstruktur A1 beide Elektroden, die dazu dienen, die biologischen Teilchen zu manipulieren, und die Vorrichtungen aufnehmen, die dazu dienen, sie abzutasten. Die Sensoren können vom kapazitiven oder optischen Typ sein. Einmal durch die Einlassöffnung I1 (3) in die Durchflusskammer F der Vorrichtung eingeführt, werden die biologischen Elemente oder Teilchen in einer ordnungsgemäßen Anordnung R2 in der durchflusslosen Kammer FL platziert, wo bereits andere Zelltypen R1 sein können, eingeführt und vorher geordnet und in das gleiche Experiment eingeschlossen. Wenn andererseits all die Taschen mit Sensoren ausgerüstet sind, dann wird die Situation vereinfacht. Die Käfige, die Teilchen enthalten, werden in der Durchflusskammer F unmittelbar im Anschluss an die Einführung der neuen Spezies identifiziert und zu den ausgewählten Positionen in der durchflusslosen Kammer FL bewegt.

Überschüssige Teilchen können durch Einführen von weiterer Flüssigkeit durch die Einlassöffnung I1 der Durchflusskammer entfernt werden, dadurch die Teilchen aus der Kammer zusammen mit der überschüssigen Flüssigkeit mittels der relativen Auslassöffnung O1 spülend.

Verwendung von Sensoren, die fähig sind, den Zell- oder Substanztyp zu identifizieren Eher als Einführen von Zellen oder Verbindungen in ordnungsgemäßer Reihenfolge, existiert die Möglichkeit, mit einer Vorrichtung, die Sensoren einschließt, die fähig sind, nicht nur die Anwesenheit, sondern ebenfalls den Zell- oder Verbindungstyp zu detektieren, der in einem Käfig eingefangen sein kann, die Zellen zufällig einzuführen, und die Vorrichtung sie automatisch anordnen zu lassen (wie in dem Patent PCT/WO 00/69565 beschrieben). Ebenso wird in diesem Fall die Prozedur mit Hilfe von entweder extern positionierten Sensoren oder von optischen oder kapazitiven Sensoren durchgeführt, die in die Vorrichtung integriert sind. 4 zeigt ein Beispiel dieser Lösung. Die biologischen Teilchen werden mittels der Einlassöffnung I1 in die erste Kammer F der Vorrichtung eingeführt, die einen temporären Durchfluss aktiviert. Hier werden sie gemäß dem Typ durch die Unterscheidungssensoren identifiziert. Danach wird jedes einzelne Teilchen gemäß dem Typ in die durchflusslose Kammer FL zusammen mit den anderen seiner Art R1 und R2 geordnet. Ein Typ-Unterscheidungssensor kann unter jeder Tasche oder sogar nur unter einer Tasche positioniert werden. In dem letzteren Fall wird es vorteilhaft sein, den Sensor unter einer Tasche nahe der Passage D zwischen den beiden Kammern zu positionieren, durch den die Käfige notwendigerweise gerichtet werden.

In Bezug auf die Version des Verfahrens, das die Verwendung von funktionalisierten Mikrobads involviert, wird das Problem des Ordnens der in dem Test enthaltenen Teilchen und insbesondere ihrer Identifizierung teilweise durch die Charakteristiken der Mikrobeads erleichtert. Wenn einmal die gewünschte Anordnung der Zellen unter Verwendung von einer der beschriebenen Strategien erzeugt und/oder aufrecht erhalten worden ist, kann der Experimentator eine Mischung aus Mikrobeads, die mit verschiedenen Antikörpern funktionalisiert sind, in die Vorrichtung mit keinen Bedarf der Anpassung einer sequentiellen Prozedur einfach einführen. Es ist ausreichend, dass die Substanzen homogene Paare mit physikalischen und immunologischen Charakteristiken aufweisen, in anderen Worten, dass jeder spezifische Antikörpertyp mit verschiedenen Charakteristiken der Teilchen übereinstimmt, durch die er zugeführt wird. Ein Beispiel von diesen ist in Tabelle 1 gezeigt: Drei Antikörper (spezifische mAbs) für drei verschiedene Antigene von drei verschiedenen Organismen werden verwendet, um drei Teilchentypen zu beschichten, die sich einerseits in Bezug auf die Farbe und andererseits in Bezug auf die dielektrische Konstante unterscheiden. Physikalische Charakteristiken vom Mikrobead Antikörpertyp Farbe Dielektrische Konstante Weiß &egr;1 S.aureus Ag H Gelb &egr;1 H. influenzae Ag K Grün &egr;1 E. coli Ag O Weiß &egr;1 S. aureus Ag H Weiß &egr;2 H. influenzae Ag K Weiß &egr;3 E. coli Ag O Tabelle 1. Beispiel vom Paaren zwischen physikalischen und immunologischen Charakteristiken von funktionalisierten Mikrobeads. Antigenetische Charakteristiken können mit verschiedenen physikalischen Charakteristiken des Mikrobeads assoziiert werden.

Die Anzahl an Teilchen kann ebenfalls durch Anpassen von Kombinationen von physikalischen Charakteristiken erhöht werden. Ein Beispiel von diesem ist in Tabelle 2 gezeigt. Physikalische Charakteristiken vom Mikrobead Antikörpertyp Farbe Dielektrische Konstante Gelb &egr;1 Ab1 Gelb &egr;2 Ab2 Grün &egr;1 Ab3 Grün &egr;2 Ab4 Tabelle 2. Beispiel des Paarens zwischen physikalischen und immunologischen Charakteristiken von funktionalisierten Mikrobeads.

Neben Farbe können anderen Charakteristiken, wie beispielsweise Reflexion und möglicherweise Fluoreszenz leicht mit der Hilfe eines geeigneten externen Sensors detektiert werden. Transparenz und Differenz in der dielektrischen Konstante können jeweils mit integrierten Sensoren vom optischen und kapazitiven Typ detektiert werden.

Ähnlich können durch die Antigen-Antikörper-Wechselwirkung zwischen Zelle und Bead gebildete Komplexe, die leicht durch das Zusammenpassen zwischen den physikalischen und immunologischen Charakteristiken der Mikrobeads identifiziert werden, an diesem Punkt gemäß der Erfindung weiterhin verarbeitet werden, wie zur gegebenen Zeit beschrieben. Eine Unterscheidung auf der Basis der physikalischen Charakteristiken unter Verwendung von Fluoreszenz insbesondere kann verwendet werden, um Teilchen zu identifizieren, die nicht nur aus funktionalisierten Mikrobeads bestehen, sondern ebenfalls aus Liposomen, die gegebene Verbindungen entweder im Innern oder auf der Oberfläche tragen.

Es ist möglich, den Weg auszunutzen, in dem sich das Verhalten der Teilchen in der Vorrichtung mit der Variation in der Frequenz der angelegten elektrischen Felder ändert. Wenn die Frequenz variiert, können die Zellen tatsächlich eine Änderung in der Richtung und/oder Stärke der dielektrischen Netto-Dielektrophoresekraft durchmachen, die sie in Richtung zu Bereichen der Vorrichtung mit abnehmender Feldstärke (nDEP) oder sie in Richtung zu Bereichen der Vorrichtung mit ansteigender Feldstärke (pDEP) treibt. Verschiedene Zellen weisen verschiedene Übergangskurven auf, die von ihren dielektrischen und leitenden Eigenschaften (ihren so-genannten „Spektralsignaturen") abhängen. In der Praxis kann dieses Phänomen verwendet werden, um eine einzelne Zellenspezies einzufangen und zu bewegen (wie in Patent PCT/WO 00/69565 beschrieben), und um folglich verschiedene Spezies von einer Masse an Organismen abzutrennen. In diesem Fall führt der Experimentator unter Kenntnis, wie die Zellen bei der ausgewählten Frequenz wandern werden, und unter Aufweisens von Sensoren, die fähig sind, die Anwesenheit der Zellen zu detektieren, eine Mischung aus Organismen in die Kammer ein, die dann direkt durch die Vorrichtung getrennt wird. Die Anwesenheit der Sensoren kann wieder durch Sensoren detektiert werden, die extern oder in die Vorrichtung integriert arbeiten (optisch oder kapazitiv).

Während des Verlaufs dieser Tätigkeiten kann die von den Sensoren zurückkehrende Information verwendet werden, um die Steuerung und die Tätigkeiten zu modifizieren, die entsprechend dem Status des Systems auszuführen sind, und um die Programmierung der Vorrichtung zu ändern oder einzustellen. Es ist ebenfalls möglich, eine virtuelle Darstellung (Grafik, zum Beispiel) des Status des Systems zu dem Zweck der Optimierung des Schnittstelle zwischen Vorrichtung und Benutzer zum Zweck der Programmierung und der Analyse der Resultate zu erzeugen.

In der Praxis besteht dieser Experimenttyp aus der Erzeugung oder in allen Fällen der Aufrechterhaltung einer geordneten Anordnung von Zellen (oder Verbindungen) und aus dem Hervorrufen einer Wechselwirkung mit den Verbindungen (oder Zellen), die angeordnet bzw. untersucht werden. Dies wird einfach durch Veranlassen der Dielektrophoresepotenzialkäfige durchgeführt, die die Zellen und Verbindungen enthalten/befördern, zusammen zu fusionieren. In dem Fall der mikroemulgierten apolaren Verbindungen (z.B. Steroiden oder Triglyceriden) laufen diese spontan durch die Zellgrenzen und sind folglich fähig, sie zu ihrer Aktion, wenn irgendeine vorhanden ist, innerhalb der Zelle zu bringen. In dem Fall von Verbindungen, die in Liposomen mikroverkapselt sind, fusioniert der Phospholipidbeutel mit der Zellmembran unter Freisetzung der Verbindung in die Zelle, wo sie ihre Aktion erzeugen wird, wenn eine vorhanden ist. Wo Teilchen mit genetisch modifizierten viralen Vektoren verbunden werden, wird das Gen der Substanz, die getestet wird, in die DNA des Virus durch eine herkömmliche Prozedur eingefügt. Durch die Vermittlung der besonderen Mechanismen, die ihm eigen sind, wird der Virus das genetische Material in die Zelle einführen, wo es dann seine Aktion erzeugen wird, wenn irgendeine vorhanden ist.

Mit Antikörpern funktionalisierte Mikrobeads werden in allen Fällen verwendet, wenn ein Bedarf besteht, eine Zelle auf der Basis von charakteristischen Molekülen (Antigenen) zu unterscheiden, die an ihrer Oberfläche (Wand oder Membran) augesetzt sind. Typische Beispiele sind diagnostische Anwendungen und Prozeduren, die die Trennung von besonderen Beständen von Zellen von anderen betreffen, die ansonsten nicht unterschieden werden könnten.

Mit Antikörpern funktionalisierte Beads können mittels eines Dielektrophoresepotenzialkäfigs zu der Zelle zugeführt und in Kontakt mit der Zelle einfach durch Veranlassen angeboten werden, dass der Käfig, der das Bead enthält, mit dem Käfig fusioniert, der die Zelle enthält. Unter den einzigartigen Charakteristiken des Verfahrens gemäß der Erfindung ist die, dass es verwendet werden kann, um eine Bindungskontrolle mit dem Antikörper und dem identifizierten Antigen durchzuführen.

Der Experimentator kann danach streben, die Zellen von den funktionalisierten Mikrobeads abzulösen, und folglich eine zuverlässige Verifikation der Stärke der Bindung zwischen Antigen und Antikörper unter Anpassen von einer der folgenden Strategien auszuführen:

Bei konstanter Frequenz kann der Experimentator mit der Zelle und den Mikrobaeds, die beide der nDEP ausgesetzt sind, die Stärke der Bindungskraft zwischen dem das Bead beschichtenden Antikörper und dem auf der Oberfläche des biologischen Teilchens vorhandenen Antigen unter Verfizierung des Widerstands des Antigen-Antikörperkomplexes zu der Trennungskraft kontrollieren, wenn die zwei Teilchen in zwei verschiedene Käfige durch Variieren der Stärke von ∇(E_rms)² angezogen werden, d.h. der Stärke der dielektrischen Kraft, die ist: <F> ∝ Re[fcm(&ohgr;)] ∇ (E_rms)² in anderen Worten proportional zu ∇ (E_rms)². Unter Erhöhung der Spannungen der Elektroden, das heißt, unter Erhöhung der Amplitude der zwischen den Elektroden angelegten Spannung, ist es ebenfalls möglich, die Stärke der Dielektrophoresekraft zu erhöhen, die die zwei Teilchen in verschiedene Käfige anzieht.

Die Frequenzantwort der Dielektrophoresekraft (Re[fcm] in 5) ist im Allgemeinen jeweils in Mikrobeads und Zellen verschieden. Tatsächlich weist das Variieren der Frequenz den Effekt der Beeinflussung des Kraftfaktors fcm(&ohgr;) auf. Dies weist wenig Effekt auf die Mikrobeads (BEAD in 5) auf, in Bezug auf die die Dielektrophoresekraft im Wesentlichen konstant in dem negativen Sektor (nDEP) bleibt. In der Praxis fahren die Beads fort, in Richtung zu dem Zentrum der Dielektrophoresepotenzialkäfige gezogen zu werden. Im Vergleich mit Zellen (BIO in 5) ändert sich die Dielektrophoresekraft vom Negativen in das Positive mit der Variation in der Frequenz zwischen den Elektroden. Der Effekt von diesem in der Praxis ist, dass die Zellen dazu neigen, von dem Zentrum der Käfige in Richtung zu den Elektroden gezogen zu werden, wo das elektrische Feld am stärksten ist.

Es ist ebenfalls möglich, das Zusammenpassen der Bindung zwischen Antigen und Antikörper basierend auf den zwei vorstehend erwähnten Parametern durch Variieren von sowohl der Frequenz des elektrischen Felds, d.h. dielektrischer Kraft, die abnimmt (nDEP) oder die ansteigt (pDEP), als auch der elektrischen Feldstärke, d.h. des Moduls des Dielektrophoresekraftfelds, zu kontrollieren.

Die Situationen, die entstehen, hängen von einem großen Ausmaß von den Abmessungen der Mikrobeads, der vorherrschenden, positiven oder negativen Dielektrophoresekraft und von der Existenz oder auf einer anderen Weise von einer Bindung zwischen Antigen und Antikörper ab:

Das folgende Verfahren ist in dem Fall der Beads besonders geeignet, die Abmessungen aufweisen, die mit jenen des Partikels BIO und des Käfigs vergleichbar sind.

Anfänglich (Zeit T1 in 6a) belegen die Zelle BIO und das funktionalisierte Mikrobead BEAD zwei benachbarte Käfige. Die Käfige sind durch relative Phantomlinien S1 schematisch angezeigt, die jeweils den Raumabschnitt anzeigen, in dem eine signifikante Dielektrophoresekraft erzeugt wird. Dann (Zeit T2 in 6a) wird ein größerer Käfig erzeugt, wenn die zwei Teilchen sich nähern und im Grunde in physischen Kontakt innerhalb dieses gleichen Käfigs eintreten. In dem Fall eines Zusammenpassens erkennen die Antikörper an dem Mikrobead ihr spezifisches Antigen und binden an ihm. Danach (Zeit T3 in 6a) werden die anfänglichen Käfige wieder hergestellt, aber das Mikrobead verbleibt aufgrund der Antigen-Antikörper-Bindung an der Zelle verankert, und die zwei fahren fort den einen Käfig zu belegen.

Anfänglich (Zeit T1 in 6b) belegen die Zelle und das funktionalisierte Mikrobead zwei benachbarte Käfige. Dann (Zeit T2 in 6b) wird ein größerer Käfig erzeugt, wenn die zwei Teilchen sich nähern und im Grunde in physischen Kontakt innerhalb dieses gleichen Käfigs eintreten. Wenn jedoch kein Zusammenpassen vorliegt, erkennen die Antikörper an dem Mikrobead nicht irgendein spezifisches Antigen und werden folglich nicht an die Zelle binden. Danach (Zeit T3 in 6b) werden die anfänglichen Käfige wieder hergestellt, und das Mikrobead und die Zelle belegen wieder ihre ursprünglichen Positionen.

Das folgende Verfahren ist in dem Fall geeignet, dass die Beads entweder Abmessungen aufweisen, die kleiner sind als jene der Zelle BIO, oder Abmessungen aufweisen, die vergleichbar sind mit denen der Zelle BIO.

Anfänglich (Zeit T1/Zusammenpassen & vorherrschende pDEP in 7a) belegen die Zelle BIO und eine Anzahl an funktionalisierten Mikrobeads BEAD zwei benachbarte Käfige. Die Käfige sind hergestellt, um sich durch Veränderung der Polarität der Elektroden in der Anordnung M1 zu nähern (siehe 7a). Als ein Resultat (Zeit T2/Zusammenpassen & vorherrschende pDEP in 7a) treten die Beads in physischen Kontakt mit der Zelle und sammeln sich um ihre Oberfläche. In dem Fall eines Zusammenpassens erkennen die Antikörper an den Mikrobeads ihre spezifischen Antigene und binden an ihnen. Eine Frequenzänderung wird nun angewendet, deren Effekt ist, die Zelle der positiven Dielektrophoresekraft zu unterwerfen und zu veranlassen, dass der Zell-Mikrobeadkomplex in eine Zone mit maximalem Potenzial oder zwischen die Elektroden fällt (Zeit T3/Zusammenpassen & vorherrschende pDEP in 7a). Die Käfige werden in einem Versuch manipuliert, die Zellen von den Beads abzutrennen, aber diese fahren fort, an der Zelle als eine Folge der Antigen-Antikörper-Bindungskraft zu haften (Zeit T4/Zusammenpassen & vorherrschende pDEP in 7a). Danach wird die Situation durch Verifizierung der Anwesenheit von Teilchen in der Nachbarschaft der Elektrode L100 und der Abwesenheit von Teilchen in der Nachbarschaft der Elektrode L200 bewertet (Zeit T5/Zusammenpassen & vorherrschende pDEP in 7a). Dies kann unter Verwendung von optischen Sensoren (die integriert sind oder anders) oder kapazitiven Sensoren ausgeführt werden.

Die Situation während der anfänglichen Schritte (Zeiten T1–T3 in 7b) ist die gleiche wie vorstehend beschrieben, wobei die Zelle BIO und eine Anzahl an funktionalisierten Mikrobeads BEAD zwei benachbarte Käfige belegen (Zeit T1/Zusammenpassen und vorherrschende nDEP in 7b). Genauso sind in diesem Fall die Käfige hergestellt, um sich durch Veränderung der Polarität der Elektroden in der Anordnung M1 zu nähern, und die Mikrobeads treten in physischen Kontakt mit der Zelle, sammeln sich um ihre Oberfläche (Zeit T2/Zusammenpassen & vorherrschende nDEP in 7b). Dies ist wieder ein Beispiel eines Zusammenpassens, bei dem die Antikörper, die auf dem Mikrobead vorhanden sind, ihre spezifischen Antigene erkennen und an ihnen binden. Eine Frequenzänderung wird angewendet, als deren Folge wird die Zelle der positiven Dielektrophoresekraft unterworfen, aber unter Voraussetzung der vorherrschenden nDEP auf die Mikrobeads wird der Zell-Mikrobeadkomplex in Levitation aufrecht erhalten (Zeit T3/Zusammenpassen & vorherrschende nDEP in 7b). Die Käfige werden weiterhin in einem Versuch manipuliert, die Zellen von den Beads abzutrennen, aber die Zellen fahren als eine Folge der Antigen-Antikörper-Bindungskraft fort, an den Beads zu haften (Zeit T4/Zusammenpassen & vorherrschende nDEP in 7b), sodass sich der Komplex als eine einzelne Funktionseinheit innerhalb des einen Käfigs bewegt, wie es die Variation in der Polarität der Elektroden vorschreibt. Schließlich wird die Situation durch Verifizierung der Abwesenheit von Teilchen in der Nachbarschaft der Elektrode L100 und der Anwesenheit von Teilchen in der Nachbarschaft der Elektrode L200 bewertet (Zeit T5/Zusammenpassen & vorherrschende pDEP in 7b).

Anfänglich (Zeit T1/Kein Zusammenpassen in 7c) belegen die Zelle BIO und eine Anzahl an funktionalisierten Mikrobeads BEAD zwei benachbarte Käfige. Die Käfige sind hergestellt, um sich durch Veränderung der Polarität der Elektroden in der Anordnung M1 zu nähern. Die Mikrobeads treten nun in physischen Kontakt mit der Zelle und sammeln sich um ihre Oberfläche (Zeit T2/Kein Zusammenpassen in 7c). In diesem Fall erkennen die Antikörper an den Mikrobeads nicht irgendein spezifisches Antigen. Eine Frequenzänderung wird nun angewendet, als deren Resultat stehen die Mikrobeads in Levitation innerhalb eines Käfigs, während die Zellen in Richtung zu den Elektroden fallen, der pDEP unterworfen seiend (Zeit T3/Kein Zusammenpassen in 7c). Die Käfige bewegen sich weiterhin, die Zelle verbleibt nahe der Elektroden, während sich die Mikrobeads von Käfig zu Käfig verschieben (Zeit T4/Kein Zusammenpassen in 7c). Schließlich wird die Situation durch Verifizierung der Anwesenheit von Teilchen in der Nachbarschaft der Elektrode L100 und der Elektrode L200 bewertet (Zeit T5/Kein Zusammenpassen in 7c).

Neben der Möglichkeit der Kontrolle von jeder Zelle zu dem Zweck der Durchführung von einer Vielfalt von Experimenten, bieten die Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung den Vorteil, dass die physiologische Antwort von Zellen direkt analysiert werden kann, ohne sie von der Testvorrichtung wieder gewinnen zu müssen.

Es verbleibt dennoch möglich, die Merkmale der Vorrichtung voraussetzend, die Zellen von Interesse ohne unangebrachte Schwierigkeit in dem Fall wieder zu gewinnen, dass es gewünscht wird, weitere Experimente mit ihnen durchzuführen. Wenn die Durchflusskammer F der Vorrichtung einmal von irgendwelchen restlichen Teilchen mit Pufferlösung sauber gespült worden ist, können die Zellen von Interesse von der durchflusslosen Kammer FL zu der Durchflusskammer F zurückgeführt werden und durch Pumpen durch mehr Pufferlösung entfernt werden.

Das vorgeschlagene Verfahren gestattet dem Experimentator im Wesentlichen, die Antwort von jeder einzelnen Zelle auf die Verbindung zu analysieren, während andere Verfahren im Allgemeinen eine Analyse der Antwort nur in Bezug auf einen Mittelwert gestatten, der einen homogenen Bestand an Zellen widerspiegelt. Die durch die Verbindung erzeugten Effekte sind weitgehend in vier Typen klassifizierbar:

• • cytostatisch: Die Verbindung stellt eine Verzögerung in der Zeit her, die genommen wird, damit eine Zellteilung stattfindet;
• • cytotoxisch: Die Verbindung induziert Zelltodmechanismen, die schließlich zur Zelllyse führen;
• • mitotisch: Die Verbindung stimuliert Zellmitose (Zellteilung) oder eine Reduktion in der Zeit, die zur Erzeugung einer Zelle beansprucht wird;
• • komplex: eine mehrfaktorige physiologische Antwort (Induktion von second Messengers; Aktivierung von einem oder mehreren Genen usw.), deren Effekte nicht leicht beobachtet werden können, aber schließlich dennoch mit einem des Vorangehenden übereinstimmen.

Cytotoxische, cytostatische und mitotische Effekte können mit Hilfe von externen optischen Sensoren oder integrierten Sensoren beobachtet werden. Solche Sensoren können vom kapazitiven Typ sein, das heißt, bestehend aus einer Schaltung, die fähig ist, kleine Kapazitätsdifferenzen zwischen zwei Elektroden der Gruppierung zu detektieren; die Anwesenheit oder die Abwesenheit der Zelle oder gleichermaßen ihre mögliche Lyse oder Verdopplung wird den Wert der Kapazität ändern, dem Experimentator gestattend, nicht nur die Zelle zu detektieren, sondern ebenfalls die Anzahl an vorhandenen Zellen zu detektieren. Optisches Abtasten kann genauso verwendet werden, in diesem Fall ist der Faktor, der eine Unterscheidung zwischen den Anwesenheit und der Abwesenheit oder der Lyse und Verdopplung der Zelle die Menge an Photonen, die einen Sensor erreicht, der unter einem Potenzialminimum positioniert ist. Wenn eine Zelle in solch einem Minimum oder Lücke eingefangen wird, unter dem bzw. der ein Sensor positioniert ist, werden die Photonen, die auf den Sensor einfallen, zu dem Ausmaß weniger sein, dass die Zelle weniger durchsichtig ist als die Flüssigkeit, in der sie suspendiert ist.

In dem Fall eines mitotischen Effekts kann eine (oder mehrere) der erzeugten Zellen nicht in dem gleichen Käfig wie die Elternzelle enthalten sein und fällt folglich in einen benachbarten Käfig, der zu dem Zweck frei gelassen ist, wo sie durch den Sensor detektiert werden kann, der unter diesem gleichen Käfig positioniert ist. 8 veranschaulicht die vorstehende Reihenfolge an Vorgängen, die in einer schematischen Darstellung von der Vorrichtung und in einer Grafik gezeigt sind, die die räumliche Variation der Dielektrophoresekraft von einem Moment zu dem nächsten anzeigt.

Exakter belegt eine Zelle BIO, die eine Verbindung gerade empfangen haben kann oder nicht, einen Käfig S1 oder eher einen minimalen Abschnitt des durch die Vorrichtung erzeugten Dielektrophorese-Felds (Zeit T1 in 8); ob durch den Effekt der Verbindung stimuliert oder von ihrer Abwesenheit einen Nutzen ziehend, beginnt die Zelle, sich zu teilen. Solange die zwei neuen Zellen verbunden verbleiben, entkommen sie nicht aus dem Käfig (Zeit T2 in 8); mit ausgeführter Mitose werden die zwei erzeugten Zellen momentan zwischen die zwei Käfige tatsächlich auf die Scheitelpunkte von zwei angemessenen benachbarten Potenzialminima genommen werden, in die sie unvermeidlich fallen werden (Zeit T3 in 8); wenn sich die Zellen einmal effektiv geteilt haben, erreicht das System eine neue minimale Potenzialenergie, wenn jede Zelle einen relativen Käfig belegt hat (Zeit T4 in 8). Durch Überwachung der Anzahl an belegten Käfigen wird es unter Verwendung des vorliegenden Verfahrens möglich, die ausgeführte Mitose zu identifizieren. Alternativ kann Verwendung von einem kapazitiven Sensor gemacht werden, der eine analoge Antwort proportional zu der Anzahl an erzeugten Zellen erzeugt und deshalb so gestatten wird, dass die Zellen gezählt werden, sogar, wenn sie innerhalb des gleichen Käfigs eingefangen sind.

Um verschiedene physiologische Zellantworten und durch eine Verbindung induzierte Komplexe oder nicht-makroskopische Effekte oder Effekte zu analysieren, die nicht leicht identifizierbar sind, ist das bevorzugte Verfahren, genetisch modifizierte Zellen, die ein Reportergen an einem ausgewählten Punkt des metabolischen Wegs enthalten, der durch die Verbindung beeinflusst werden könnte, oder ein Gen zu verwenden, das ein sofort beobachtbares Protein, das typischerweise fluoreszierend ist, wie beispielsweise grünes fluoreszierendes Protein (GFP) anstelle von (oder zusammen mit, zum Beispiel, in dem Fall eines Fusionproteins) dem normalen, aber nicht sofort beobachtbaren Genprodukts exprimiert. Dies ist eine alltägliche Technik, und sie wird von Fachleuten in dem Gebiet der Mikrobiologie verwendet. Wieder in diesem Fall können die Sensoren integriert oder extern sein, aber müssen offensichtlich nur vom optischen Typ sein.

Die Möglichkeit zur Analyse von physiologischen Antworten, komplex oder anders, wird durch die Tatsache, dass eine konstante, ausgewählte Temperatur innerhalb der Vorrichtung aufrecht erhalten werden kann, und genauso durch die Freiheit vereinfacht, verschiedene Puffer zu verwenden, die neben dem Aufweisen der richtigen Dielektrophoresecharakteristiken ebenfalls Substanzen einschließen werden, die von den Zellen metabolisiert oder anderweitig sein können und die folglich ermöglichen, dass die Zellen in physiologischen Bedingungen innerhalb der Vorrichtung solange wie nötig überleben werden, um eine Antwort zu erhalten.

Die Hauptanwendung dieses Verfahrens ist offensichtlich die der Basissuche, wo die Möglichkeit der Kontrolle von Wechselwirkungen relativ zu einer einzelnen Zelle komplett neue Gebiete zur Experimentation erschließt, insbesondere, wenn das Liposom einen Rezeptor-spezifischen Liganden auf seiner Oberfläche trägt. Ein anderer Vorteil in Bezug auf die Basissuche ist, dass Liposom-Liposom-Wechselwirkungen beobachtet werden können: Wenn ein Liposom einen Liganden auf seiner Oberfläche trägt, wobei ein anderes Liposom den Rezeptor trägt und andere Proteine trägt, von denen bekannt ist, dass sie die Signalantwort vermitteln, wird es möglich, ein minimales Zell-Signalisierung-System wieder aufzubauen.

Das Verfahren findet Anwendung, um das Gebiet der kombinatorischen Chemie zu fördern, wo Experimentatoren Bibliotheken von Verbindungen screenen müssen, die Tausende von Substanzen umfassen, um ihren Effekt auf Zellen von verschiedenen Typen zu verifizieren, zur selben Zeit danach strebend, sowohl die Zeit als auch die Mengen an Substanzen einzuschränken, die bei der Durchführung des Tests eingesetzt werden. In diesem Fall fusionieren Liposomen mit der Zelle und lassen ihren Inhalt in das Cytoplasma frei. Es ist ebenfalls möglich, die Fusion von zwei Liposomen zu bewirken, die Reagenzien zu dem Zweck zum Erhalten einer gegebenen Verbindung enthalten. Schließlich können Wechselwirkungen zwischen Liposomen und porösen Mikrobeads verwendet werden, um eine Vielfalt an Liposomen in die Poren der Mikrobeads zu transportieren.

Unter den Anwendungen für das Verfahren, die Substanzen verwenden, die fähig sind, Mikrobeads von verschiedenen Typen zu funktionalisieren, schließen zusätzlich zu jenen, die mit Liposomen möglich sind, andere ein:

Das Verfahren kann verwendet werden, um einen Organismus in einer biologischen Probe unter Verwendung von Mikrobeads zu identifizieren, die mit Antikörpern, zum Beispiel monoklonalen Antikörpern, funktionalisiert sind, um ein spezifisches Antigen des Organismus zu lokalisieren. Die Hauptvorteile dieses Verfahrens über andere immunologische Verfahren sind insbesondere der hohe Spezifizitätsgrad, der durch die Bindungskontrolle gewährleistet wird, die Möglichkeit der Verwendung von bemerkenswert kleinen Mengen von sowohl dem Antikörper als auch der Probe, die getestet wird, und nicht minder wichtig die hohe Ausführungsgeschwindigkeit, die durch die Prozedur mittels ihrer Einfachheit und dein enthaltenen Automatisierungsniveau erreicht wird.

Eine der möglichen Anwendungen für Diagnostikzwecke ist in 9 gezeigt, die eine schematische Veranschaulichung von sowohl der Weise zur Durchführung des Diagnostiktests als auch von der Prozedur zur Bewirkung einer spezifischen Trennung von Zellen (zu gegebener Zeit beschrieben) bereitstellt, vorausgesetzt, dass die anfänglichen Schritte in jeden Fall die gleichen sind. Die Prozedur kann weitgehend wie folgt charakterisiert werden: Die biologische Probe, die den Typ oder Typen von Zellen von Interesse enthält, wird mit einem oder (sollten die zu identifizierenden/wieder zu gewinnenden Zelltypen mehr als einer in der Anzahl sein) möglicherweise mehreren Mikrobeadtypen gemischt, die mit Antikörpern funktionalisiert sind, die zu dem Typ oder Typen von Zellen von Interesse spezifisch ist. Die verschiedenen Typen an Mikrobeads müssen auf der Basis ihrer physikalischen Charakteristiken leicht identifizierbar sein. An diesem Punkt wird die Mischung in eine der Kammern der Vorrichtung eingeführt.

Alternativ können die Mikrobeads in die Vorrichtung getrennt von der Probe eingeführt werden, wobei der Reihe nach vorgegangen wird, sollte es nicht möglich sein, zwischen den verschiedenen Typen an Mikrobeads innerhalb der Vorrichtung zu unterscheiden.

Zellen und Mikrobeads, die nicht in Kontakt gekommen sind, wenn gemischt, werden durch einen anfänglichen Dielektrophorese-Manipulationsschritt zusammen gebracht (9a und 9b). Es werden nun Versuche gemacht, um die Zellen von den Mikrobeads zu trennen (9c). Wo Komplexe nicht getrennt werden können, wird angenommen, dass die Antikörper, die an den Mikrobeads befestigt sind, an die Antigene an den Zellen gebunden worden sind, und diese werden dementsprechend identifiziert. Getrennte Zellen werden dann mit Mikrobeads eines verschiedenen Typs mit jenen gepaart, mit denen sie vorher in Kontakt waren (9d und 9e). Die Tätigkeit wird wiederholt, bis all die Zellen von Interesse identifiziert und wenn möglich nummeriert worden sind.

Eine Anwendung für das Verfahren in dem Gebiet der Molekulardiagnostik involviert die Verwendung von Mikrobeads, die entweder aufgrund davon, dass sie vor ihrer Einführung in die Vorrichtung bekannt sind, oder einfach dadurch, dass sie innerhalb der Vorrichtung auf der Basis von ihren physikalischen Eigenschaften identifizierbar sind, wieder erkennbar sind, die mit Sonden-DNA (oder RNA) geeignet beschichtet sind und veranlasst werden, mittels der dielektrophoretischen Manipulation mit anderen zu Wechselwirken, die eine Beschichtung aus Ziel-DNA (oder RNA) aufweisen. Dieses Verfahren kann beim Durchführen eines Hybridisierungstests durch Homologie verwendet werden, um die Ziel-DNA (oder RNA) und ohne Verwendung von radioaktivem oder fluoreszierendem Material in der Sonde zu identifizieren, wie es im Gegensatz dazu in herkömmmlichen Verfahren erforderlich ist. Zudem wird die Stringenz der experimentellen Bedingungen durch elektronische Mittel (d.h. nach einer Trennung der Mikrobeads strebend) und in Echtzeit leicht gesteuert und variiert, wenn notwendig, in anderen Worten ohne die gesamte Prozedur wiederholen zu müssen. Dies ist, zum Beispiel, beim Lokalisieren von Einzel-Nukleotid-Polymorphismen (SNPs) besonders vorteilhaft, die für bestimmte ernsthafte Erkrankungen typisch sind.

Eine der Anwendungen von größtem Interesse für die vorliegende Erfindung ist die der Zellsortierung und exakter die Verwendung von Mikrobeads, die mit Antikörpern funktionalisiert sind, beim Ermöglichen der Selektion eines homogenen Unterbestands aus Zellen aus einer heterogenen Masse.

Tatsächlich sind die Charakteristiken des Verfahrens so, dass sie eine hohe Erkennungsspezifizität sicherstellen, die Unterscheidung von Zellen gestattend, die sich sogar minimal unterscheiden, und darüber hinaus ihre Trennung und Wiedergewinnung von anderen einfach und mit vernachlässigbarem Risiko der Kontamination von dem unerwünschten Teil des Zellbestands ermöglichend. Diese Anwendung ist von besonderem Interesse in dem medizinischen Gebiet der Onkologie.

Die Prozedur kann weitgehend wie folgt charakterisiert werden: Die biologische Probe, die den Typ oder Typen von Zellen von Interesse enthält, wird mit einem oder (sollten die wieder zu gewinnenden Zelltypen mehr als einer in der Anzahl sein) möglicherweise mehreren Typen von Mikrobeads gemischt, die mit Antikörpern funktionalisiert sind, die zu dem Typ oder Typen von Zellen von Interesse spezifisch ist. Die verschiedenen Typen an Mikrobeads müssen auf der Basis ihrer physikalischen Charakteristiken leicht identifizierbar sein. An diesem Punkt wird die Mischung in eine der Kammern der Vorrichtung eingeführt.

Alternativ können die Mikrobeads in die Vorrichtung getrennt von der Probe eingeführt werden, wobei der Reihe nach vorgegangen wird, sollte es nicht möglich sein, zwischen den verschiedenen Typen an Mikrobeads innerhalb der Vorrichtung zu unterscheiden.

Zellen und Mikrobeads, die nicht in Kontakt gekommen sind, wenn gemischt, werden durch einen anfänglichen dielektrophoretischen Manipulationsschritt zusammen gebracht (9a und 9b). Es werden nun Versuche gemacht, um die Zellen von den Mikrobeads zu trennen (9c). Wo Komplexe nicht getrennt werden können, wird angenommen, dass die Antikörper, die an den Mikrobeads befestigt sind, an die Antigene an den Zellen gebunden worden sind, und diese werden dementsprechend identifiziert. Getrennte Zellen werden dann mit Mikrobeads eines verschiedenen Typs mit jenen gepaart, mit denen sie vorher in Kontakt waren (9d und 9e). Die Tätigkeit wird wiederholt, bis all die Zellen von Interesse identifiziert worden sind. Immer noch an Mikrobeads gebundene Zellen werden nacheinander in die zweite Kammer der Vorrichtung in homogenen Gruppen bewegt und durch Ausspülen in Pufferlösung wiedergewonnen (9f und 9g). Alternativ werden stabile Komplexe des gleichen Typs in die zweite Kammer der Vorrichtung bewegt, woraufhin eine Trennungskraft durch Variieren der Stärke und/oder der Frequenz des elektrischen Felds zwischen ausgewählten Elektroden angewendet wird, ausreichend, um die Mikrobeads von den Zellen zu lösen, sodass sie in der ersten Kammer wieder verwendet werden können. Die Zellen werden von der Vorrichtung durch Ausspülen in Pufferlösung wiedergewonnen.

Unter Verwendung von Mikrobeads kann das Verfahren verwendet werden, um die Zellantwort zu studieren, die durch die Bindung eines Liganden an seinen spezifischen Rezeptor ausgelöst wird. Die Mikrobeads können tatsächlich ebenfalls mit Substanzen funktionalisiert werden, die anders als Antikörper sind, die, während sie in der Lage sind, entsprechend an einen Rezeptor zu binden (vorübergehend zu einem größeren oder kleineren Grad), ebenfalls physiologische Antworten in der Zelle auslösen. Viele Zellantworten werden tatsächlich durch Wechselwirkungen dieses Typs vermittelt, in dem eine Substanz, die als ein Messenger fungiert, aber unfähig ist, in die Zelle einzutreten, einem spezifischen Rezeptor begegnet, der das Signal durch die Zellgrenzen überträgt, ohne notwendigerweise die Substanz durch ihn zu nehmen. Messenger aktivieren im Allgemeinen eine Informationskaskade, die schließlich einen der vier vorher beschriebenen Effekte erzeugen wird: cytostatisch, cytotoxisch, mitotisch und komplex.

Die Möglichkeit der Funktionalisierung von Mikrobeads mit den beschriebenen Typen an Substanzen voraussetzend, kann der Bereich der Phänomene, die mit dem offenbarten Verfahren studiert werden können, ausgeweitet werden, um all jene Substanzen, tatsächlich die Mehrheit unter jenen von Interesse, einzuschließen, die entweder durch die Zellgrenzen nicht passieren können oder nicht sollen, noch fähig sind, dennoch die Physiologie der Zelle signifikant zu beeinflussen.

Schließlich können funktionalisierte Mikrobeads in der Basissuche verwendet werden, zum Beispiel, unter Hervorrufung einer Wechselwirkung mit Liposomen: Wenn ein Mikrobead einen Liganden auf seiner Oberfläche trägt, und ein Liposom den Rezeptor und die anderen Proteine, durch die die Antwort auf das Signal vermittelt wird, wird es möglich, ein minimales Zell-Signalisierungs-System wieder aufzubauen. Mikrobeads können ebenfalls als Vektor für die Einführung von Verbindungen oder Verbindungseinheiten in Zellen oder in eine aufgeteilte Umgebung verwendet werden, zum Beispiel, isoliert innerhalb eines Liposoms; tatsächlich kann ein funktionalisiertes Mikrobead durch eine Zelle vereinnahmt werden, mit der es in Kontakt gebracht wird; das gleiche gilt in dem Fall eines Liposoms.

In dem Fall, dass es die Aufgabe ist, eine Verbindung oder eine Verbindungseinheit in eine Zelle (oder Liposom) einzuführen, kann diese gleiche Verbindung oder eine Verbindungseinheit direkt durch ein Mikrobead oder ein Liposom oder denkbar auf der Oberfläche der anderen Zelle getragen werden oder in einem Vektor (einem Virus, zum Beispiel, wenn die Verbindung ein DNA/RNA-Fragment ist) enthalten sein, der entworfen ist, um in das Innere einer Zelle oder Liposoms zu dringen, wenn in physischen Kontakt mit diesen gebracht, und der Vektor selbst kann ebenfalls von Zellen und/oder Mikrobeads und/oder Liposomen getragen werden.