Die Erfindung betrifft die Identifizierung von Verbindungen, die sich für Analyse, Therapie und andere Anwendungen eignen, bei denen es günstig ist, eine Substanz bereitzustellen, die spezifisch an ein Zielmolekül bindet, d.h. eine spezifische Pattern-Matching-Technik, die es erlaubt, Kandidatenbindungssubstanzen in Abwesenheit des Zielmoleküls einem Screening zu unterziehen. Die Erfindung betrifft auch eine Verbesserung hinsichtlich der Konstruktion von Referenzpanels für die Verwendung bei Profilierung und Pattern-Matching. Genauer gesagt betrifft die Erfindung die Verwendung von Referenzpanels für die Herstellung von Kreuzreaktions-Finger-abdrücken, die Enzyme und/oder andere Nichtimmunglobulinproteine als Affinitätsziele umfassen.

Es gibt zahlreiche Fälle, in denen es günstig ist, einen Liganden aufzufinden, der spezifisch einen Rezeptor oder ein anderes Ziel bindet. Besonders offensichtliche Beispiele sind: Falls ein Rezeptor verantwortlich für die Aktivierung einer bestimmten Art von Zelle ist, können Liganden, die den Rezeptor binden, therapeutische Anwendung bei der Aktivierung oder der Verhinderung der Aktivierung des Rezeptors finden, und zwar mit einem entsprechenden physiologischen Effekt auf die Zelle. Falls die Zelle in einem Tier oder in einer Pflanze enthalten ist, kann sich der Effekt auf den gesamten Organismus auswirken. So beruht ein sehr populärer Ansatz zum Entwurf neuer Arzneistoffe darauf, geeignete Bindungsmittel für diese Rezeptoren zu finden.

Liganden, die spezifische Ziele binden, können auch Anwendung in analytischen Zusammenhängen finden. Z.B. sind Antikörper nützliche Komponenten in Immunoassayverfahren. Alle diese Verfahren beruhen auf der spezifischen Wechselwirkung zwischen einem Antigen und einem Antikörper, wobei jeder der Partner der Analyt sein kann.

Darüber hinaus können Trennverfahren und andere Prozesse mit gewerblicher Anwendung von spezifischer Bindung profitieren. Als besonders einfache Veranschaulichung kann genannt werden: eine Verunreinigung kann in wirksamer Weise aus einer Zusammensetzung durch Behandlung der Zusammensetzung mit einem festen Träger entfernt werden, an den ein "Rezeptor" gebunden ist, der geeignet ist, die Verunreinigung unter relativem Ausschluss der anderen Komponenten der Zusammensetzung zu binden, sofern die Affinität des Rezeptors für die Verunreinigung in ausreichender Weise größer ist als für die gewünschten Komponenten.

In allen vorstehend genannten Fällen sind der Grad der Affinität, der die spezifische Bindung charakterisiert, und der Grad der Spezifität, die erforderlich ist, von den Umständen abhängig. Einige Anwendungen ziehen Vorteile aus einer relativ schwachen Wechselwirkung, während andere eine hohe Affinität erfordern. Einige Anwendungen sind hinsichtlich der Spezifität anspruchsvoller als andere.

Eine offensichtliche Methode, mit Brachialgewalt einen Liganden zu finden, der an ein Ziel von Interesse bindet, besteht darin, physikalisch die Eignung einer großen Anzahl an Verbindungen zu testen, die mögliche Liganden sind, und zwar im Hinblick auf ihre Eignung, das Ziel selbst zu binden. Dieses Verfahren wird in praktisch allen Fällen ohne Zweifel schließlich dazu führen, einen erfolgreichen Liganden zu finden. Es ist jedoch zeitaufwendiger und arbeitsintensiver als im Hinblick auf die praktische Brauchbarkeit günstig erscheint. Zunächst muss das Ziel, z.B. ein Rezeptor, in einer bestimmten physikalischen Form hergestellt werden, die getestet werden kann, und ausreichende Mengen müssen bereitgestellt werden, um dann den Bereich von Verbindungen, bei denen es sich um Kandidaten handelt, zu testen. Zweitens ist, falls Verbindungen einfach in statistischer Folge getestet werden, eine große Menge des Ziels erforderlich. Dies kann, insbesondere im Fall von zellulären Rezeptoren, unerschwinglich teuer sein.

Eine Reihe von Ansätzen sind vorgeschlagen worden, um diese Schwierigkeiten zu minimieren. Zunächst kann, an Stelle des statistischen Testens von Verbindungen ein systematisch variiertes Panel von Verbindungen verwendet werden. Derartige systematisch variierte Panels können in zweckmäßiger Weise konstruiert werden, indem Polymere aus Monomereinheiten festgelegter Eigenschaften gebildet werden. Besonders zweckmäßige derartige Polymere sind Peptide, wobei jedoch auch Polysaccharide, Polynucleotide und dergleichen verwendet werden können. Die Parameter, die wichtig sind, und die Art der Konstruktion derartiger Panels werden in den US-Patenten 4,963,263, 5,133,866 und 5,340,474 beschrieben.

Zusätzlich zu der Verwendung systematisch variierter Panels von Verbindungen als Kandidaten oder an Stelle davon kann das Screening selbst auf solche Weise durchgeführt werden, dass die erforderliche Anzahl an physikalischen Messungen minimiert wird. Z.B. kann, wie in US-Patent 5,217,869 dargelegt wird, ein Reaktivitätsprofil für einen Liganden erstellt werden, von dem bekannt ist, dass er mit einem Ziel reagiert, in dem ein Standardpanel von Bindungsmitteln bereitgestellt wird. Das erhaltene Profil charakterisiert diesen speziellen Liganden, von dem bekannt ist, dass er den Rezeptor bindet. Die Kandidatenverbindungen können dann gegen das gleiche Panel getestet werden, wobei man ihre entsprechenden Profile erhält. Wenn ein entsprechendes Profil mit dem eines Liganden übereinstimmt, von dem bekannt ist, dass es sich um eine erfolgreich bindende Verbindung an das Ziel handelt, dann weist die Verbindung, die das übereinstimmende Profil erzeugte, mit hoher Wahrscheinlichkeit eine Bindung an das Ziel auf. Bei einem alternativen Ansatz werden Umkehrabbildungspanels mit variierenden Eigenschaften hergestellt, und Profile, die für den Rezeptor und Liganden gegen umgekehrte Panels erhalten werden, werden abgeglichen.

Verschiedene andere Technologien sind auf Verfahren zur Verbesserung der Einfachheit, mit der die physikalische Bindung eines Rezeptors an einem Kandidatenliganden gemessen werden kann, gerichtet, wie die Verwendung von Robotern, Fluoreszenznachweis der Reaktivität, physikalische Anordnungen der Panels und dergleichen.

Weitere Verfahren, mit denen versucht wird, spezifische Bindungspaarmitglieder zu finden, umfassen computerbasierte Verfahren, wie dreidimensionale Datenbankrecherchen, Röntgenkristallographie, Molecular Modeling und dergleichen. Bei anderen Methoden werden Antikörper als Surrogatziele eingesetzt, oder die Methoden beruhen einfach auf dem Verhalten der Verbindung im Hinblick auf verwandte Zielrezeptoren. Z.B. kann das Verhalten einer Verbindung als ein Inhibitor einer bestimmten Serinprotease oder einer Anzahl von Serinproteasen zu der Annahme führen, dass die Verbindung ein brauchbarer Inhibitor einer weiteren Serinprotease sein wird, für die deren Inhibitionsaktivität noch nicht bestimmt wurde. Die Gültigkeit dieser letztgenannten Verfahren basiert auf der Ähnlichkeit von Serinproteasen, die die „Referenzrezeptoren" sind, für den die Bindungseigenschaften nicht bekannt sind.

Die vorliegende Erfindung stellt ein weiteres Verfahren bereit, um einen Liganden mit einem Ziel in Übereinstimmung zu bringen. Es ist besonders hilfreich, wenn begrenzte Mengen an Zielen verfügbar sind. Das erfindungsgemäße Verfahren ist besonders nützlich bei Arzneistoffdesignprojekten, bei denen das Ziel nicht vollständig gereinigt wurde, instabil ist oder aus anderen Gründen nicht in adäquaten Mengen für das Screening im Großmaßstab verfügbar ist, oder wenn das Assayverfahren für das Ziel komplex und kostspielig ist. Ferner minimiert das Verfahren den Verbrauch an Rezeptor in einem Programm des Screenings gegen viele potenzielle Liganden.

US-Patent 5,300,425 beschreibt Verfahren, bei denen charakteristische Profile eines bestimmten Analyten erstellt werden, ähnliche Profile zur Korrelation von Bindungseigenschaften unter verschiedenen Analyten abgeglichen werden und Umkehrabbildungspanels verwendet werden, um Profile für diesen Zweck zu erzeugen. Bei den Verfahren, die in dem "425-Patent beschrieben werden, werden Immunglobuline oder ihre immunologisch reaktiven Fragmente als Mitglieder der Panels der Bindungsliganden verwendet, um die charakteristischen Profile zu erhalten, die bei Charakterisierung und Korrelation verwendet werden. Eine Abwandlung dieser Technologie, die in dem vorstehend erwähnten US-Patent 5,340,474 beschrieben wird, ersetzt die Antikörper und Fragmente, die in den Profilierungspanels verwendet werden, durch Panels diverser Paraloga. Paraloga sind definiert als polymere Anteile, vorzugsweise mit einem Molekulargewicht von weniger als 7,5 kD, zusammengesetzt aus Monomeren mit Charakteristika, so dass eine maximale Verschiedenheit über die Panelmitglieder bei einer minimalen Anzahl an Paraloga erzielt werden kann. Durch Maximierung der Verschiedenheit kann dann der Bereich an Raum/Ladungs-Konturen, der den „chemischen Raum" charakterisiert, mit einer vergleichsweise kleinen Anzahl an Verbindungen erzielt werden.

Wie in den vorstehend in Bezug genommenen Patenten beschrieben, sind derartige Referenzpanels in einer Anzahl von Zusammenhängen nützlich. Das Panel kann verwendet werden, um einen „Fingerabdruck" zu erhalten, der einen bestimmten Analyten charakterisiert. Der Fingerabdruck kann als ein analytisches Werkzeug verwendet werden, um eine bestimmte Substanz zu identifizieren, und zwar im Wesentlichen in der gleichen Weise, in der ein IR-Spektrum oder NMR-Spektrum verwendet werden kann. Außerdem wurde erkannt, dass Analyten, die ähnliche Fingerabdrücke aufweisen, oder in deren Fingerabdrücken ähnliche Merkmale enthalten sind, ähnliche Bindungs- oder Reaktivitätseigenschaften im Allgemeinen oder im Hinblick auf die Eigenschaft, die mit einem ähnlichen Merkmal assoziiert ist, aufweisen. Wenn also z.B. ein Rezeptor von Interesse einen bekannten Liganden aufweist, dann lassen sich weitere Verbindungen finden, die an den Rezeptor binden, indem deren Fingerabdrücke mit dem Referenzpanel mit den Fingerabdrücken, die von dem bekannten Liganden erhalten wurden, abgeglichen werden. Ein ähnlicher Abgleich von komplementären Mitgliedern eines Bindungspaars kann unter Verwendung von Umkehrabbildungssätzen erhalten werden, wobei ein Fingerabdruck für einen Liganden gegenüber einem Referenzpanel mit dem Fingerabdruck des Rezeptors gegenüber einem Satz von Verbindungen übereinstimmt, bei dem es sich um eine Umkehrabbildung des Referenzpanels handelt.

Eine weitere Anwendung, für die Panels von Reagenzien nützlich sind, besteht in der Bestimmung der Analytzusammensetzung einer Probe. Diese Anwendung wird in US-Patent 5,338,659 beschrieben. Der Fingerabdruck, der für eine unbekannte Probe erhalten wird, wird mit festgelegten Fingerabdrücken oder Profilen, die mit bekannten Standardzusammensetzungen bestimmt werden, abgeglichen. Es können bestimmte Berechnungstechniken angewandt werden, um diesen Vergleich zu erleichtern, wie in dem Patent beschrieben wird. In diesem Fall wird jedoch nicht allgemein angenommen, dass ein weiter Bereich an Bindungsvermögen erforderlich ist, da die Anwendung sich auf Zusammensetzungen konzentriert, die Analyten enthalten, im Allgemeinen mit verwandten Strukturen, und Maßnahmen zur Korrelation der Fingerabdrücke mit anderen inhärenten Eigenschaften der Analyten selbst werden nicht benötigt. In diesem Fall mag es also als logisch angesehen werden, Panelmitglieder zu verwenden, die nicht notwendigerweise Antikörper oder maximal verschiedene Paraloga sind.

In der vorliegenden Anmeldung wird ein weiteres Verfahren der Identifizierung von Bindungspartnern unter Verwendung einer berechneten Kombination von Ergebnissen gegenüber einem Referenzpanel als ein Surrogat für ein gewünschtes Ziel beschrieben. Das veranschaulichte Referenzpanel ist aus Enzymen zusammengesetzt. Es wird dabei überraschend gefunden, dass eine ausreichende Verschiedenheit der Reaktivität erhalten werden kann, um brauchbare Ergebnisse zu erzielen, selbst wenn die Enzyme, die in dem der Veranschaulichung dienenden Referenzpanel verwendet werden, von der Natur nicht entworfen wurden, um eine große Vielfachheit an Bindungsaktivitäten aufzuweisen (wie Antikörper). Von den Enzymen wurde auch nicht erwartet, dass sie die maximale Verschiedenheit aufweisen, die einer kleinen Anzahl an Panelmitgliedern zugeschrieben werden kann, wie sie durch die Entwicklung von Paraloga erzielt wurde. Dennoch kann unter Verwendung von Enzymen, sogar Isoenzymen mit ähnlichen Aktivitäten, als Mitgliedern des Referenzpanels ein zufrieden stellendes Surrogat erzielt werden, um die Bindung von Kandidatenliganden an Ziele unter Einschluss von Zielen, die durch keinerlei Ähnlichkeit der Aminosäuresequenz mit den Enzymen, die Panelmitglieder sind, verwandt sind, vorherzusagen. Es ist auf diese Weise festgestellt worden, dass derartige Enzyme oder Referenzmoleküle im Allgemeinen auch bei der Profilierung und bei Pattern-Matching-Verfahren nützlich sein sollten, die in den in Bezug genommenen Patenten beschrieben werden, und bei den darin beschriebenen Verfahren.

Die Erfindung nutzt, was im Ergebnis ein Surrogat für das Ziel ist, um eine beliebige Anzahl an potenziellen Liganden einem Screening zu unterziehen. Zunächst wird ein Reaktivitätsbindungsprofil des Ziels im Hinblick auf einen „Trainingssatz" von Verbindungen erstellt, vorzugsweise mit Charakteristika, die systematisch verschieden sind. Der Trainingssatz kann z.B. zehn verschiedene Verbindungen umfassen, die verschiedene Grade der Affinität für das Ziel aufweisen. Auf diese Weise zeigt das Zielprofil einen Satz von variierenden Affinitäten in Bezug auf diese Verbindungen. An Stelle des Tests zusätzlicher Kandidatenliganden im Hinblick auf das Ziel selbst, wird künstlich ein „Surrogat" durch Testen der Reaktivität dieses gleichen Satzes von zehn Trainingsverbindungen gegenüber einem Referenzpanel von Molekülen erzeugt, gegenüber dem der Trainingssatz ebenfalls variierende Grade der Reaktivität zeigt. Dies mag als ein Referenzpanel bezeichnet werden. Jede Verbindung in dem Trainingssatz zeigt daher ein Muster von Reaktivitäten im Hinblick auf dieses Referenzpanel.

Dies führt zu einer zweidimensionalen Matrix, wobei der Grad der Reaktivität jedes Mitglieds des Trainingssatzes im Hinblick auf jedes Mitglied des Referenzpanels aufgezeichnet wird. Der Grad der Reaktivität jedes Mitglieds des Referenzpanels mit jeder der Trainingsverbindungen wird daher gleichzeitig in einer orthogonalen Dimension aufgezeichnet.

Jedes Mitglied des Referenzpanels wird selbstverständlich ein anderes Profil im Hinblick auf den Trainingssatz zeigen, als das tatsächliche Ziel zeigte. Eine bestimmte rechnerische Kombination, vorzugsweise eine lineare Kombination, dieser Referenzpanelprofile erzeugt jedoch ein Profil, das so eng wie möglich mit dem übereinstimmt, das von dem Zielmolekül selbst erhalten wurde. Diese optimale Annäherung stellt ein Surrogat für das Ziel dar. Die Formel, die sich aus der Berechnung im Hinblick auf das Referenzpanel ergibt, wird herangezogen, um die Reaktivitäten für neu getestete Verbindungen abzuschätzen. In empirischer Hinsicht haben derartige Surrogate eine gute Vorhersageleistung, wenn sie auf Liganden außerhalb des Trainingssatzes angewandt werden. Eine Bibliothek von Ligandenprofilen gegenüber dem Referenzpanel kann daher rechentechnisch mit Ergebnissen vergleichbar denen eines direkten physikalischen Screenings der Liganden abgesucht werden.

So wird für jede anschließend getestete Verbindung die Reaktivität gegenüber jedem Mitglied des Referenzpanels erhalten, und die Formel, die aus dem Trainingssatz abgeleitet wird, wird angewendet, um einen vorhergesagten Wert im Hinblick auf das Ziel zu erhalten. An Stelle des direkten Testens der Reaktivität einer Kandidatenverbindung im Hinblick auf ein Zielmolekül ist es möglich, statt dessen seine Reaktivität im Hinblick auf ein Panel von vergleichsweise leicht zugänglichen Referenzrezeptoren zu testen, die Formel auf die Ergebnisse anzuwenden und vorherzusagen, was passiert wäre, wenn das Ziel selbst verwendet worden wäre. Je größer die Bibliothek von gespeicherten Ligandenprofilen gegenüber einem Referenzsatz ist, umso größer ist der Anstieg der Effizienz für das Screening durch ein Surrogat.

Es ist nun auch festgestellt worden, dass Nichtimmunglobulinproteine (von denen einige natürlich auftreten, jedoch unabhängig davon, wie sie tatsächlich gebildet werden) erfolgreich verwendet werden können, um ein Referenzpanel für die Verwendung bei der Profilierung von Analyten, der Vorhersage von Bindungsmöglichkeiten von Kandidatenverbindungen im Hinblick auf Ziele sowie für die analytischen Zwecke, die in US-Patent 5,338,659 beschrieben werden, zu bilden. So können Panels, die bei den erfindungsgemäßen Verfahren brauchbar sind, vollständig aus derartigen Proteinen, wie Enzymen, T-Zellrezeptoren, olfaktorischen Rezeptoren, Lectinen und künstlich modifizierten Proteinen, die beliebige Bindungsstellen enthalten, zusammengesetzt sein. Die Panels können auch Antikörper oder Fragmente davon oder Paraloga als Mitglieder umfassen; bei den Panels, die für die erfindungsgemäßen Verfahren brauchbar sind, müssen jedoch die Nicht-Ig/Nicht-Paralog-Mitglieder das Panel über den Beitrag jeglicher Immunglobulinproteine und Paraloga, die in den Panels auch enthalten sind, „anreichern", wie nachstehend beschrieben.

Gemäß einem Aspekt kann die Erfindung herangezogen werden, um die Fähigkeit einer Kandidatenverbindung zur Reaktion mit einem Target durch die Bereitstellung eines Surrogats für das Target (Ziel) zu bestimmen. Das Surrogat ist die Formel, die eine rechnerische Kombination darstellt, vorzugsweise eine lineare Kombination, von mindestens zwei Referenzreaktivitätsprofilen, die am besten mit den empirischen Bindungsdaten des Ziels gegenüber dem Trainingssatz von Verbindungen übereinstimmt. Die Referenzreaktivitätsprofile stellen die Reaktion jedes Mitglieds eines Panels von Referenzrezeptoren im Hinblick auf einen Satz von Verbindungen dar, wobei der Satz von Verbindungen als ein „Trainingssatz" bezeichnet werden kann. Die Formel wird dann auf die Reaktivitäten im Hinblick auf jedes der Mitglieder des Panels der Referenzrezeptoren angewandt, die für jede der Kandidatenverbindungen erhalten werden. Das Ergebnis der Anwendung dieser Formel ahmt nach, was gefunden würde, wenn die Verbindung direkt mit dem Zielrezeptor getestet worden wäre.

Der Aspekt der Erfindung bezieht sich daher auf ein Verfahren zur Identifizierung einer Kandidatensubstanz als reaktiv mit einem gewünschten Target, wobei das Verfahren umfasst:

• (a) Bereitstellung einer Formel, die aus einer Kombination von Reaktivitätsprofilen von mindestens zwei Mitgliedern eines Referenzpanels mit einem Satz von Verbindungen abgeleitet ist, wobei die Formel ein vorhergesagtes Profil berechnet, das am besten mit dem Reaktivitätsprofil des Targets im Hinblick auf den Satz von Verbindungen übereinstimmt;
• (b) Testen der Reaktivität der mindestens zwei Mitglieder des Panels im Hinblick auf die Kandidatensubstanz;
• (c) Berechnung einer abgeschätzten Reaktivität im Hinblick auf das Target für die Kandidatensubstanz durch Anwendung der Formel auf die Reaktivitäten, die in Schritt (b) bestimmt wurden, um die Reaktivität der Kandidatensubstanz im Hinblick auf das Target abzuschätzen; und
• (d) auf Basis der Ergebnisse von (c) Identifizierung der Kandidatensubstanz als reaktiv mit dem Target.

Ein erfolgreicher Kandidat wird dann identifiziert und aus geeigneten Ausgangsmaterialien synthetisiert.

Eine besonders bevorzugte Kombination von einem Trainingssatz und einem Panel wird hier angegeben. In dieser bevorzugten Matrix weist jedes Mitglied des Referenzpanels gewissermaßen ein inverses Bildmitglied im Trainingssatz der Verbindungen auf. Auf diese Weise wird die Anzahl an Referenzpanelmitgliedern und Trainingsverbindungen durch Entfernung redundanter Überlappungen minimiert.

Es wird hier auch eine Datenbank von Fingerprints beschrieben, die bezüglich eines Referenzpanels erhalten wird. Die Datenbank kann für eine Reihe von Zwecken verwendet werden, wie nachstehend beschrieben.

Verfahren zur Konstruktion der Referenzpanels werden hier auch beschrieben.

Ein Verfahren zur Charakterisierung eines einzelnen Analyten wird hier beschrieben, wobei das Verfahren das Kontaktieren des Analyten mit jedem Mitglied eines Panels angereichert mit oder gebildet durch die vorstehend beschriebenen Nicht-Ig-Proteine, die in einer Vielzahl verschiedener Grade mit dem einzelnen Analyten reagieren; den Nachweis des Grades der Reaktivität des Analyten gegenüber jedem der Mitglieder; das Aufzeichnen des Grades der Reaktivität des Analyten gegenüber jedem der Panelmitglieder; und die Anordnung der aufgezeichneten Reaktivitätsgrade, so dass ein charakteristisches Profil des Analyten bereitgestellt wird, umfasst.

Panels, die Nicht-Ig-Proteine enthalten, die bei verschiedenen Musterabgleichverfahren und für physikalische Ausführungsformen der Fingerprints, die nach den vier Verfahren erhalten werden, geeignet sind, werden hier auch beschrieben.

Ein Verfahren zur Identifizierung eines Kandidaten, wobei der Kandidat wirksam hinsichtlich der Reaktion mit einem Target ist, wobei das Target einen bekannten Liganden aufweist, mit dem es reagiert, wird hier auch beschrieben, wobei das Verfahren folgendes umfasst: Kontaktieren des Kandidaten mit jedem Mitglied des Panels, angereichert mit oder gebildet aus den vorstehend beschriebenen Nicht-Ig-Proteinen, die in einer Vielzahl verschiedener Grade mit dem Kandidaten reagieren; Bestimmung des Grades der Reaktivität des Kandidaten gegenüber jedem der Panelmitglieder; Aufzeichnung jedes der Grade der Reaktivität des Kandidaten gegenüber jedem der Panelmitglieder; Anordnung der aufgezeichneten Reaktivitätsgrade, so dass ein charakteristisches Profil des Kandidaten bereitgestellt wird; Vergleich des Profils mit einem Profil, das auf eine analoge Weise von dem Liganden erhalten wurde, im Hinblick auf die Vielzahl von Panelmitgliedern; wobei die Ähnlichkeit des Profils des Kandidaten zum Profil des Liganden die Fähigkeit des Kandidaten anzeigt, mit dem Target zu reagieren. Eine Substanz, die als erfolgreicher Kandidat identifiziert ist, wird dann identifiziert und aus geeigneten Ausgangsmaterialien synthetisiert.

Ein Verfahren zur Auswahl eines Kandidaten aus einer Vielzahl von Kandidaten, der spezifisch mit einem bekannten Target reagiert, wird hier auch beschrieben, wobei das Verfahren umfasst: Bereitstellung eines Reaktivitätsprofils des Targets gegenüber einem maximal verschiedenartigen Satz von Verbindungen; Bereitstellen eines Panels einschließlich Nicht-Ig-Proteine wie oben beschrieben, was ein inverses Bild des maximal verschiedenartigen Satz ist; Herstellen eines Profils der Reaktivität des Kandidaten gegenüber dem inversen Bildpanel; Vergleich des maximal verschiedenartigen Satzprofils des Targets mit dem inversen Bildpanelprofil des Kandidaten; und wobei die Ähnlichkeit des inversen Bildpanelprofils mit dem verschiedenartigen Satzprofil die Wahrscheinlichkeit angibt, mit der sich der Kandidat an das Target binden wird. Ein erfolgreicher Kandidat wird dann identifiziert und aus geeigneten Ausgangsmaterialien synthetisiert. Dieses Verfahren kann "umgekehrt" werden, weil die Wahl, welche Substanz als "Kandidat" und welche als "Target" angesehen wird, willkürlich ist – d.h. das Target kann gegen das inverse Bildpanel und der Kandidat gegen das maximal verschiedenartige Panel profiliert werden.

Ein Verfahren zur Bestimmung des Vermögens eines Kandidaten, mit einem Target zu reagieren, wird hier auch beschrieben, wobei das Verfahren die Bereitstellung eines Surrogats für das Target wie vorstehend beschrieben und einschließlich Nicht-Ig-Proteinen im Referenzpanel umfasst.

1 ist ein Flussdiagramm des Verfahrens zur Berechnung der Wahrscheinlichkeit einer Kandidatenbindung an das Ziel unter Verwendung eines Surrogats.

2 zeigt eine bevorzugte Ausführungsform der Trainingssatz/Referenz-Matrix.

3 ist ein Flussdiagramm des Verfahrens zur Bestimmung des Profils eines Analyten.

4a und 4b zeigen typische Ausführungsformen von Fingerabdrücken, die nach verschieden Verfahren erhalten wurden.

5 ist ein Flussdiagramm des Verfahrens zum Vergleich von Profilen eines Liganden mit einer Kandidatenverbindung.

6 ist ein Flussdiagramm des Verfahrens zum Vergleich von Umkehrabbildungsprofilen.

7a, 7b und 7c stellen Abstandsverteilungen für Profile von 800 Verbindungen dar, bestimmt im Hinblick auf Referenzpanels von 5, 7 bzw. 10 Referenzproteinen.

8a bis 8c sind Abstandsverteilungen für Punkte im zehndimensionalen Raum, die Profile von 50, 100 bzw. 1000 Verbindungen im Hinblick auf ein Panel von 10 Referenzproteinen darstellen.

9a bis 9c zeigen Verteilungen für die Profile im Hinblick auf 10 Referenzproteine verschiedener Sammlungen von Verbindungen. 9a entspricht 8a, die die Abstandsverteilung zeigt, die Profile von 50 zufälligen Verbindungen repräsentiert. 9b zeigt die Abstandsverteilung für Profile von 50 bekannten pharmazeutisch aktiven Verbindungen. 9c stellt eine ähnliche Verteilung von 50 Peptiden mit variierender biologischer Aktivität dar.

10 zeigt die Ergebnisse, die erhalten werden, wenn ein Trainingssatz von Verbindungen im Hinblick auf ein Panel von Referenz-GST-Isoenzymen getestet wird, um ein Surrogat für einen Zielrezeptor zu erzeugen. Die Ergebnisse des Testens einer Vielzahl von zusätzlichen Verbindungen gegenüber dem Panel von Referenzenzymen und der Anwendung der Formel, die das Surrogat definiert, werden verglichen mit dem Testen zusätzlicher Verbindungen direkt gegenüber dem Zielrezeptor. Die Grauskala zeigt IC₅₀-Werte an.

11a zeigt die Vorhersagen und tatsächlichen empirischen Daten aus 10 als eine Punktwolke, wobei sich ein hoher Grad der Korrelation zeigt. 11b zeigt den Rest von 11a.

12 zeigt eine Liste von 122 Verbindungen und deren Symbole, die als einer Verbindungsbibliothek bei den Ergebnissen verwendet wurden, die gegenüber einem angereicherten Referenzpanel von acht ausgewählten Enzymen erzielt wurden.

13 zeigt die experimentelle und vorhergesagte Fähigkeit der Verbindungen von 12 zur Bindung an GRd und AdDH, sowie die charakteristischen Profile dieser Verbindungen gegenüber einem Referenzpanel, wobei die ersten 12 Verbindungen, die aufgelistet sind, dem anfänglichen Trainingssatz entsprechen. Ein weiterer Satz von 10 Trainingsverbindungen, die in den Vorhersagen der zweiten Iteration verwendet wurden, wird durch benachbarte schwarze Balken bezeichnet, und zwar mit einem unterschiedlichen Satz von 10 für jedes Ziel.

14a und 14b zeigen Korrelationsdiagramme von vorhergesagten und experimentellen Werten entsprechend den in 13 gezeigten Ergebnissen.

15 zeigt die Korrelation angepasster und experimenteller Bindung einer Vielzahl von Verbindungen gegenüber neun verschiedenen Zielen.

Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt es, eine große Anzahl an Kandidatenverbindungen auf deren Fähigkeit zur Reaktion mit einem und insbesondere zur Bindung an ein Ziel zu testen, und zwar ohne dass die Notwendigkeit großer Mengen des Ziels als solchem besteht. Das Ziel selbst wird nur in ausreichender Menge und Reinheit benötigt, um die Formel zu generieren, die das Surrogat erzeugt.

Wie hier verwendet, umfasst der Ausdruck „Ziel" beispielsweise Moleküle, die sich auf der Oberfläche von Zellen befinden und die Aktivierung der Zellen durch Aktivierung von Liganden vermitteln; der Ausdruck wird jedoch auch in einem generischen Sinn so verwendet, dass er jegliches Molekül bedeutet, das spezifisch an ein Gegenstück bindet. Ein Mitglied eines spezifischen Bindungspaars könnte willkürlich als ein „Rezeptor" oder „Ziel" bezeichnet werden, und das andere als „Ligand". Es braucht keine spezielle physiologische Funktion mit dieser spezifischen Bindung verbunden zu sein. Ein „Ziel" mag beispielsweise Antikörper, immunologisch reaktive Abschnitte von Antikörpern, Moleküle, die so ausgelegt sind, dass sie Komplemente anderer Moleküle darstellen, und dergleichen einschließen. In der Tat ist im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung die Unterscheidung zwischen „Ziel" und „Ligand" völlig irrelevant; die Erfindung betrifft Paare von Molekülen, die spezifisch aneinander in nichtkovalenter Weise mit größerer Affinität binden als jedes davon an andere Moleküle bindet. Zur einfachen Erklärung werden die erfindungsgemäßen Verfahren jedoch oftmals im Hinblick auf ein Ziel diskutiert, wie ein Enzym (erneut einfach ein Molekül, für das ein Gegenstück gesucht wird, das damit reagiert oder daran bindet), und der „Ligand" stellt einfach das Gegenstück dar (wie einen niedermolekularen Inhibitor).

Um das erfindungsgemäße Surrogatverfahren auszuführen, sind die folgenden Elemente erforderlich:

Erstens ein Referenzsatz von Modellzielen, gegenüber denen eine messbare Aktivität bewertet werden kann. Verschiedene Techniken für die Bestimmung der Reaktivität von Verbindungen mit diesem Satz von Referenzzielen sind möglich und gehören zu den Fähigkeiten des Fachmanns, wie vorstehend beschrieben. Es ist wichtig, zu betonen, dass es nicht erforderlich ist, dass die Referenzpanelmitglieder in irgendeiner Weise durch die primäre Aminosäuresequenz oder die empirische chemische Struktur oder durch die biologische Funktion mit dem Ziel, für das sie ein Modell darstellen, verwandt sind. In der nachstehenden Veranschaulichung werden beispielsweise verschiedene Enzyme unter Einschluss von Glutathion-S-Transferase (GST) als die Referenzrezeptoren verwendet, während es sich bei dem tatsächlichen Ziel um Glutathion-Reduktase (GRd), Aldehyd-Dehydrogenase oder eine Reihe anderer Proteine handelt. Es gibt eine zuvor erkennbare Ähnlichkeit zwischen den Enzymen des Panels und irgendeinem der Ziele auf der Ebene der Primärstruktur oder der bekannten enzymatischen Funktion. Einer der Vorteile der vorliegenden Erfindung besteht darin, dass die Referenzproteine hinsichtlich bekannter Reaktivität und Primärstruktur vom Ziel recht verschieden sein können, da die Vorhersageinformation in ihren relativen Korrelationen mit dem Ziel, nicht in ihrer Homologie liegt. Das Referenzpanel kann lediglich 1 Nicht-Ig-Protein enthalten, enthält jedoch vorzugsweise 2 bis 50 und insbesondere 8 bis 25 Nicht-Ig-Proteine; die Gesamtzahl der Panelmitglieder kann ähnlich beschrieben werden.

Zweitens ist ein Trainingssatz von Liganden erforderlich, die repräsentativ für die Verbindungen sind, die weiter im Hinblick auf ihre Reaktivitäten mit dem Referenzpanel getestet werden sollen. Wenn es eine Bibliothek von Verbindungen gibt, die weiter getestet werden sollen, dann kann eine multivariate Clustering-Methode genutzt werden, um repräsentative Verbindungen aus der Bibliothek oder Verbindungen, die denen in der Bibliothek ähnlich sind, für die Verwendung in dem Trainingssatz zu bestimmen. Entsprechend können Verbindungen mit maximal systematisch variierenden Eigenschaften ebenfalls verwendet werden. Im Allgemeinen sollte dieser Trainingssatz von Verbindungen mindestens so viele Verbindungen umfassen, wie der Anzahl der Referenzproteine entspricht, und vorzugsweise etwa dreimal diese Anzahl.

Drittens muss genügend Ziel verfügbar sein, um den Trainingssatz empirisch zu testen, wobei das Ziel jedoch nicht notwendigerweise rein sein muss. Das Ziel muss jedoch frei von unerwünschten störenden Verunreinigungen sein.

Mit diesen Verbindungen und Referenzpanels können die Profile der einzelnen Referenzpanelmitglieder im Hinblick auf den Trainingssatz und das Profil des Ziels im Hinblick auf den Trainingssatz durch physikalische Messung erhalten werden. Eine vierte Anforderung besteht dann in einem Anpassungsverfahren, um das Zielprofil mit einer Kombination der Referenzpanelmitgliedsprofile abzugleichen. Neben Verfahren der linearen Regression können nichtlineare Regressionsverfahren für diesen Zweck ebenfalls verwendet werden, und zwar unter Einschluss von teilweise linearen Modellen sowie regelbasierten Methoden, wie Clustering durch rekursive Partitionierung. In der Tat können beliebige Algorithmen, die in der hemometrischen Analyse oder der Mustererkennung herangezogen werden, mit den physikalischen Assaydaten, die von Fingerprints repräsentiert werden, die hergestellt werden, wie es hier gelehrt wird, kombiniert werden, um die Verbindungen zu klassifizieren. Derartige mathematische Techniken sind auf diesem Gebiet gut verstanden, und sie führen zu einer Formel, die als ein Surrogat für das Testen weiterer Verbindungen dient.

Die Anwendung der Formel auf das Profil, das für eine neu getestete Verbindung im Hinblick auf das Referenzpanel erhalten wurde, führt zu einer Abschätzung der Fähigkeit der neu getesteten Verbindung, das Ziel zu binden. Selbstverständlich stellt dies eine Wahrscheinlichkeit dar und ist nicht absolut. Das abgeschätzte Ergebnis läuft auf ein Screening-Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen mit einer hohen Wahrscheinlichkeit zur Bindung des Ziels (oder Nichtbindung des Ziels) hinaus.

Während zu einem Zeitpunkt eine Verbindung im Hinblick auf das Referenzpanel getestet und die Formel zur Abschätzung eines Zielreaktivitätswertes angewandt werden kann, besteht die nützlichste Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens darin, Bibliotheken von Kandidatenverbindungen einem Screening zu unterziehen. Recht häufig ist eine große Anzahl an Kandidatenverbindungen verfügbar, und das erfindungsgemäße Verfahren kann herangezogen werden, um die, die das Ziel binden, und die, die das Ziel nicht binden, zu selektieren. Wenn das Verfahren auf diese Weise auf Bibliotheken angewandt wird, dann können die Ergebnisse der neu dem Screening unterzogenen Kandidaten gegebenenfalls dem Trainingssatz zugefügt werden, und das Verfahren kann in einer iterativen Schleife wiederholt werden. Der ursprüngliche Trainingssatz kann also mit ausgewählten Verbindungen ergänzt werden, von denen abgeschätzt wird, dass sie stark das Ziel binden, sowie mit ausgewählten Verbindungen, von denen abgeschätzt wird, dass sie das Ziel nur schwach oder in nicht nachweisbarer Weise binden, und diese Verbindungen können zusätzlich zu oder an Stelle von bestimmten Mitgliedern des Trainingssatzes verwendet werden, um die Profile im Hinblick auf die Referenzpanelmitglieder und tatsächlichen Ziele zu erhalten. Die Formel kann dann unter Berücksichtigung dieser zusätzlichen Mitglieder neu berechnet werden.

Ferner brauchen nicht alle Profile der Referenzpanelproteine im Hinblick auf den Trainingssatz am Ende in die Formel eingeschlossen zu werden. Das heißt, dass einige der Koeffizienten für die Modellrezeptorprofile in der linearen Kombination Null oder negativ sind.

Der allgemeine Ansatz betreffend die Verwendung von Surrogaten ist in 1 erläutert.

In 1 wird zunächst eine Fingerabdruck-Datenbank gemäß dem Verfahren, das in der nachstehend beschriebenen 3 gezeigt ist, für eine Mehrzahl von Verbindungen gegenüber einem repräsentativen Referenzpanel zusammengestellt. Das Referenzpanel selbst wird unter Verwendung von vorläufigen Daten ausgewählt, so dass Mitglieder eingeschlossen sind, die insgesamt die Fähigkeit haben, mit einem weiten Bereich von Verbindungen zu reagieren, wobei jedoch jedes Panelmitglied mit anderen Sätzen derartiger Verbindungen reagiert.

Wenn ein geeignetes Panel gewählt worden ist, wird auch ein Trainingssatz unter den Profilen gewählt, und zwar zum Testen gegen das Ziel. Jedes der Mitglieder des Trainingssatzes wird auf diese Weise getestet, und das Ergebnis im Hinblick auf das Ziel wird für jedes Mitglied des Trainingssatzes erhalten. Dies läuft auf ein Profil des Ziels unter Verwendung des Trainingssatzes als Panelmitglieder hinaus. Die Fingerabdrücke des Trainingssatzes können dann konzeptionell invertiert werden, da die gleichen Datenpunkte betroffen sind, so dass ein Profil für jedes Mitglied des Panels im Hinblick auf die Verbindungen des Trainingssatzes bereitgestellt wird. Diese konzeptionell invertierten Profile können mathematisch analysiert werden, z.B. unter Anwendung der linearen Regressionsanalyse, um ein mathematisches Surrogat zu erhalten, wie es in 1 gezeigt ist.

Das Profil eines beliebigen Kandidaten unter Einschluss von Kandidaten, für die Profile in der Datenbank bereits erhältlich sind, kann mathematisch gemäß dem Surrogat behandelt werden, um die Reaktivität mit dem Ziel vorherzusagen. Erfolgeiche Kandidaten können unter Anwendung der Surrogat-erzeugten Abschätzungen identifiziert werden, und die erfolgreichen Kandidaten können unter Verwendung relevanter Ausgangsmaterialien synthetisiert werden. Es gibt auch eine Rückkopplungsschleife, die es erlaubt, derartige Vorhersagen zu testen und Revisionen des Trainingssatzes auf der Basis dieser Vorhersagen auszuführen, was zu Modifikationen des Surrogats führt.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann weiter unter Verwendung einer vereinfachten hypothetischen Matrix und eines linearen Regressionsverfahrens der Kombination veranschaulicht werden.

Die nachstehend angegebene Matrix stellt eine hypothetische Matrix dar, die zur Veranschaulichung der Erzeugung der relevanten Formel als Surrogat verwendet wird. Oben sind fünf Panelmitglieder angegeben, die mit MR1 bis MR5 bezeichnet sind und Panelmitglieder repräsentieren, wie Enzyme, die als Referenzmodellziele für den tatsächlichen Zielrezeptor TR verwendet werden. An der Seite, bezeichnet mit TC1 bis TC5, sind fünf Trainingsverbindungen angegeben, die in unterschiedlichen Graden mit jedem der Referenzpanelmitglieder binden oder sonst wie reagieren. Dem Grad der Reaktivität ist willkürlich ein Wert auf einer Skala von 1 bis 10 zugeordnet, wobei 10 die höchste Reaktivität angibt und 1 die geringste Reaktivität angibt. Im Allgemeinen wird eine logarithmische Skala von Messwerten verwendet. Beispielmatrix MR1 MR2 MR3 MR4 MR5 PR TR TC1 6 1 1 7 2 2 2 TC2 2 4 2 6 2 4 4 TC3 1 3 8 1 5 6 6 TC4 5 9 10 10 1 8 8 TC5 9 1 10 5 9 10 10

Bei diesen hypothetischen Ergebnissen sind Profile für jede Verbindung aus dem Satz von Trainingsverbindungen im Hinblick auf das Referenzpanel in den waagerechten Reihen angegeben, und Profile für jedes Referenzenzym im Hinblick auf den Trainingssatz von Verbindungen sind in den vertikalen Spalten angegeben. So gibt es z.B. für MR1 ein mäßig hohes Niveau der Reaktivität mit TC1, eine geringe Reaktivität mit TC2, eine sehr geringe Reaktivität mit TC3, eine mäßige Reaktivität mit TC4 und eine sehr hohe Reaktivität mit TC5. Jedes der Panelmitglieder MR1 bis MR5 weist also ein spezielles Reaktivitätsprofil im Hinblick auf den Trainingssatz auf. Auf der rechten Seite, markiert mit TR, zeigt der Zielrezeptor ein Profil gegenüber dem Trainingssatz mit monoton ansteigenden Reaktivitäten über den Bereich TC1 bis TC5, wobei dieses Muster von allen Referenzprofilen stark verschieden ist.

Es wird dann eine Formel erzeugt, indem den einzelnen Elementen der fünf Profile MR1 bis MR5 Gewichte zugeordnet werden, um ein vorhergesagtes Zielrezeptorprofil zu erhalten, das mit dem tatsächlich erhaltenen Profil für das Ziel übereinstimmt. Die Gewichtungsfaktoren müssen für jedes Element der Profile gleich sein. Die Gewichtungsfaktoren, die auf das Element TC1 im Hinblick darauf, wie die Werte von MR1 bis MR5 gezählt werden, angewandt werden, müssen die gleichen sein, wie diejenigen, die auf TC2 angewandt werden. Schließlich hat der Algorithmus die Form: A(MR1) + B(MR2) + C(MR3) + D(MR4) + E(MR5) = Wert, der dem vorhergesagten Wert entsprechend dem Surrogat zugeordnet wird, angegeben in der Tabelle als PR. Jeder der Koeffizienten A bis E weist einen numerischen Wert auf; einige der Koeffizienten können Null sein. Diese gleiche Gleichung mit den gleichen Werten für A bis E wird herangezogen, um die abgeschätzte Reaktivität mit einem Zielrezeptor für beliebige individuelle Kandidatenverbindungen zu berechnen.

Im vorstehenden Beispiel gilt: A = +2; B = +3; C = –1; D = –2; E = +1. Hier ermöglichen die Koeffizienten eine perfekte Übereinstimmung zwischen dem abgeschätzten Rezeptorprofil (ER) und dem Zielrezeptorprofil (TR) im Hinblick auf den Trainingssatz. Im Allgemeinen und wenn mehr Verbindungen in den Trainingssatz eingeschlossen werden, ist eine perfekte Übereinstimmung nicht möglich; die engste erzielbare Übereinstimmung ist jedoch für den gleichen Zweck brauchbar.

Für jede neue Verbindung wird also eine Vorhersage der Reaktivität mit dem Ziel wie folgt erhalten: Ein Profil, das Reaktivitätswerte für MR1 bis MR5 bereitstellt, wird erhalten. Die erhaltenen Werte werden dann in die vorstehend angegebene Formel eingesetzt, und zwar mit vorher festgelegten Werten für A bis E. Ein abgeschätzter Wert wird berechnet. Eine neue Kandidatenverbindung, die ein Profil mit Werten MR1 = 8, MR2 = 9, MR3 = 4, MR4 = 7 und MR5 = 5 ergibt, wird also gemäß folgender Formel bewertet: (+2) (8) + (+3) (9) + (–1) (4) + (–2) (7) + (+1) (5) = PR wobei man einen vorhergesagten Reaktivitätswert von 30 erhält. Dies zeigt, dass das Verfahren eine höhere Reaktivität vorhersagen kann, als sie in dem Trainingssatz erhältlich ist. Bestätigte Verbindungen hoher Reaktivität können dem Trainingssatz zugefügt werden, um die Formel zu verfeinern.

Die nachstehend angegebenen Beispiele 3 und 4 zeigen, dass dieser allgemeine Ansatz erfolgreich bei der Vorhersage der Reaktivität beliebiger Kandidatenverbindungen mit einem Ziel ist; dementsprechend ist keine weitere Bereitstellung von Zielrezeptor erforderlich, um eine beliebige Anzahl von Verbindungen zu testen.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der ursprünglichen Matrix werden sowohl das Referenzpanel als auch der Trainingssatz maximal verschieden eingestellt und stellen inverse Bilder dar. Dies wird in 2 erläutert, die eine hypothetische Matrix von Referenzpanelmitgliedern und Referenzbindungsmitteln zeigt. Wie in der Figur veranschaulicht, treten Referenzpanelmitglied 1 und Satzmitglied 1' stark in Wechselwirkung; Referenzpanelmitglied 2 und Satzmitglied 2' tun dies ebenfalls; Referenzpanelmitglied 3 und Satzmitglied 3' usw. Es gibt eine vergleichsweise schwache Wechselwirkung zwischen beispielsweise Satzmitglied 3' und Referenzpanelmitglied 2 oder Referenzpanelmitglied 1. Im Ergebnis stellen Referenzpanel und Trainingssatz inverse Bilder dar.

Es können Kits hergestellt werden, die in getrennten Behältern jedes der Mitglieder des Trainingssatzes, jedes der Mitglieder des Referenzpanels und das Ziel zusammen mit Reagenzien zum Testen ihrer Reaktivität umfassen.

Die Ausführung des vorstehenden Surrogatverfahrens führte zu dem überraschenden Befund, dass der Abgleich von Fingerabdrücken zur Identifizierung von Verbindungen mit gewünschten Eigenschaften, wie der Fähigkeit zur Bindung an ein gewünschtes Ziel, der Fähigkeit, als ein Enzyminhibitor zu wirken, einer spezifischen pharmakologischen Aktivität und dergleichen auf Panels basieren kann, die in wesentlicher Weise angereichert sind durch Proteine, die weder Immunglobuline noch deren Fragmente noch spezifisch ausgelegte maximal diverse Paraloga sind. Überraschenderweise kann ein Bereich der Komplementarität oder anderer interaktiver Fähigkeit, der ausreicht, um im Wesentlichen den gesamten „chemischen Raum" abzudecken, unter Einsatz von natürlich auftretenden Proteinen, wie Enzymen, Lectinen, T-Zellrezeptoren, olfaktorischen Rezeptoren und dergleichen, oder durch Einsatz von Proteinen, die modifizierte Formen von natürlich auftretenden Proteinen sind, erzielt werden. Indem ein geeigneter Satz dieser Proteine gewählt wird, kann ein ausreichender Bereich der Reaktivität erhalten werden, um verstärkte Fingerabdrücke in diesen Zusammenhängen bereitzustellen. Panels, die mit Nichtimmunglobulinproteinen angereicht sind oder daraus bestehen, dienen also dazu, geeignete Referenzsätze von Datenpunkten bereitzustellen, um ein charakteristisches Profil einer individuellen Substanz zu erhalten. Die Profile können in einer Reihe von Weisen manipuliert werden, wie weiter nachstehend beschrieben wird.

Es wäre möglich und liegt innerhalb des Umfangs der Erfindung, Panels zu konstruieren, die als Mitglieder nicht nur diese Proteine, sondern auch Antikörper und/oder Paraloga oder sonstige willkürlich gewählte quantitative Reaktivitätsereignisse enthalten. Wenn das Wort „Reaktivität" in der vorliegenden Anmeldung verwendet wird, bezieht es sich auf nichtkovalente Wechselwirkung zwischen den angegebenen Teilnehmern. In einem gewissen Sinn ist „Reaktivität" im Wesentlichen ähnlich zu nichtkovalenter Bindung. Derartige Bindung kann mit katalytischen oder allosterischen Reaktionen verbunden sein oder nicht.

Das Panel muss jedoch zumindest durch die alternativen Proteine angereichert sein. Ein Protein reichert das Panel an, wenn seine Mitgliedschaft in dem Panel eine der folgenden Wirkungen oder Kombinationen hat:

• (a) Erweiterung der Abdeckung des Panels über den chemischen Raum (siehe nachstehend);
• (b) Erhöhung des mittleren Abstandes zwischen Fingerabdrücken verschiedener Verbindungen in der Bibliothek (siehe nachstehend);
• (c) Verringerung der Anzahl der Referenzpanelmitglieder, die erforderlich ist, um eine gegebene Anzahl an Hauptkomponenten zu erhalten (siehe nachstehend).
  
  (a) Es ist natürlich erwünscht, den gesamten chemischen Raum abzudecken. 90 %, vorzugsweise jedoch 95 % Abdeckung ist im Allgemeinen ausreichend. „Abdeckung" des chemischen Raums bedeutet, dass alle Verbindungen, die gegen das Panel getestet werden, zumindest eine gewisse Reaktivität mit mindestens einem Panelmitglied und vorzugsweise mit drei bis fünf Panelmitgliedern zeigen.
  
  (b) Der „Abstand" zwischen Fingerabdrücken oder Profilen kann am besten durch den Kunstgriff der Zuordnung jedes Profils zu einem Punkt im n-dimensionalen Raum verstanden werden, wobei die Reaktivität im Hinblick auf jedes von n Referenzpanelmitgliedern einzeln in n Dimensionen aufgezeichnet wird. Der Abstand zwischen den Punkten ist dann der Abstand zwischen den Profilen. Es ist jedoch ohne weiteres ersichtlich, dass dies lediglich eine zweckmäßige Weise ist, um die Unterschiede zwischen Profilen quantitativ festzulegen; jedes beliebige andere Verfahren zur quantitativen Bestimmung der Profile kann herangezogen werden, wie eine rekursive Partitionierung der Daten, wie in einer Verzweigungsbaumclusterhierarachie.
  
  (c) „Hauptkomponenten" bezieht sich auf den Grad der Korrelation hinsichtlich der Reaktivität in Übereinstimmung mit dem standardmäßigen multivariaten statistischen Gebrauch. Wenn es beispielsweise 10 Mitglieder in dem Panel gibt und alle nahezu gleichmäßig mit einem gegebenen Satz von Verbindungen reagieren, dann liefern sie nur eine Hauptkomponente. Wenn jedes mögliche Paar von Panelmitgliedern keine Korrelation in der Bindungsreaktivität zu einem gegebenen Satz von Verbindungen zeigt, dann gibt es 10 Hauptkomponenten.

Die Proteine, die in die Panels eingeschlossen sind, die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, müssen das Panel in mindestens einer der vorstehenden Weisen verstärken oder anreichern. Die Panels, die in der Erfindung brauchbar sind, können mindestens ein Nicht-Ig-Protein enthalten, das das Panel anreichert. Vorzugsweise sind 10 % der Mitglieder Nicht-Ig-Proteine, insbesondere 20 % und ganz besonders 50 % oder mehr.

Die Panels können vollständig aus Nicht-Ig-Proteinen oder in der Tat vollständig aus Enzymen oder vollständig aus Lectinen oder vollständig aus T-Zellrezeptoren oder vollständig aus olfaktorischen Rezeptorproteinen oder vollständig aus Rezeptorproteinen im Allgemeinen bestehen, oder sie können aus Gemischen davon zusammengesetzt sein. Nimmt man als Beispiel Panels, bei denen der Einschluss von Enzymen der Schwerpunkt ist, dann enthalten die Panels typischerweise mindestens 2 Enzyme, vorzugsweise 3 Enzyme, insbesondere 4 bis 6 Enzyme und ganz besonders 7 bis 25 Enzyme. Es wurde festgestellt, dass der Einsatz von nicht mehr als 15 Enzymen immer noch akzeptable Ergebnisse über praktisch den gesamten chemischen Raum ergibt; es gibt jedoch keine willkürliche obere Grenze für die Anzahl der Enzyme in dem Panel, abgesehen von praktischen Überlegungen dahingehend, dass das Gesetz der abnehmenden Grenzerträge recht deutlich oberhalb der Anzahl in diesem Bereich einsetzt. Ähnliche Kommentare können im Hinblick auf beliebige andere spezielle Klassen von Proteinen, wie vorstehend erwähnt, gemacht werden.

Die Proteine in dem Panel können vorzugsweise wie folgt gewählt werden:

Es wird ein iteratives Verfahren genutzt, um die Mitglieder eines beliebigen Panels zur Verwendung bei der Fingerabdruckbestimmung auszuwählen. Einige Kandidatenpanelmitglieder unter Einschluss von Nicht-Ig-Proteinen werden willkürlich gewählt, und Fingerabdrücke für einen beliebigen willkürlichen Satz von Verbindungen werden erhalten. Es werden Vergleiche zwischen den Fingerabdrücken angestellt. Ein beliebiges Verfahren des Vergleichs kann genutzt werden; einige besonders wirksame Verfahren werden jedoch nachstehend beschrieben. Was immer das Verfahren des Vergleichs ist, Verbindungen, die sehr ähnliche Fingerabdrücke haben, sind eindeutig redundante Mitglieder der Bibliothek von Verbindungen für diesen Zweck, und nur eine der Verbindungen in einer derartigen Gruppe sollte in dem Selektionssatz erhalten bleiben. Die restlichen Fingerabdrücke werden dann erneut auf Ähnlichkeit verglichen; dieses Mal wird jedoch ein inverses Profil für jedes der Referenzpanelmitglieder im Hinblick auf die restlichen Verbindungen in dem Auswahlsatz erhalten. Nun wird es möglich, Panelmitglieder zu verwerfen, die ähnliche inverse Profile im Hinblick auf die Verbindungsbibliothek liefern. Wenn also drei Kandidatenmitglieder in dem Panel offensichtlich ähnliche Reaktionsmuster über die getestete Verbindungsbibliothek ergeben, dann wird nur eines der Mitglieder in dem Panel behalten.

Wenn das Panel unter Einschluss von Nicht-Ig-Proteinen, das auf diese Weise aufgrund der Redundanz verkleinert worden ist, weiter brauchbare Fingerabdrücke für alle neuen Verbindungen ergibt und wenn die neuen Verbindungen keine weitere Redundanz in dem Panel aufzeigen, dann ist das Panel zufrieden stellend. Wenn das Panel jedoch keine aussagenkräftigen Fingerabdrücke für neue Verbindungen ergibt, dann müssen zusätzliche Mitglieder zu dem Panel hinzugefügt werden, wobei es jedoch immer schwieriger wird, ein neues Mitglied zu finden, das ausgeprägte Muster im Vergleich zu den bereits vorhandenen liefert. Das Screening auf neue Mitglieder in den Panels wird vorzugsweise mit Verbindungen durchgeführt, die nicht mit den bereits vorhandenen Mitgliedern nachgewiesen wurden. Die neuen Mitgliedskandidaten werden dann im Hinblick auf einen maximal diversen Satz der bereits getesteten Verbindungen bewertet. Das ideale Panel sorgt für eine hohe Abdeckung mit hoher Unabhängigkeit und einer kleinen Anzahl an Mitgliedern, vorzugsweise unter 100, stärker bevorzugt unter 25 und insbesondere unter 15.

Es wurde festgestellt, dass unter 100 Enzymen mit stark verschiedener Funktion 12 eine 95%-ige Abdeckung gegenüber 1000 Verbindungen aus einer Vielzahl chemischer Klassen ergeben. Die 12 Enzyme sind unabhängig, da etwa 9 statistisch aussagekräftige Hauptkomponenten erforderlich sind, um die 12 zu beschreiben; wenn sie vollständig unabhängig wären, würden 12 benötigt.

Die Mitglieder unter Einschluss der Nicht-Ig-Proteine, die das Panel ausmachen, müssen physikalisch in einer solchen Weise verkörpert sein, dass ein individuelles Ergebnis für jedes Mitglied abgerufen und aufgezeichnet werden kann, so dass das Profil konstruiert wird. Es ist natürlich möglich, einfach jedes Mitglied unabhängig in einem individuellen Reaktionsbehälter mit dem relevanten Analyten umzusetzen; das Ergebnis für jeden Behälter individuell aufzuzeichnen; und manuell das Profil, das sich ergibt, zu konstruieren. Zweckmäßigere alternative Ansätze beinhalten die Ausbreitung der Panelmitglieder in einer geordneten Weise auf einer Art von festem Träger, wie einer Microtiterplatte oder einem anderen Träger mit mehrfachen Testregionen, und das Abtasten der Regionen im Hinblick auf die individuellen Ergebnisse. Mit dem Abtasten können die Ergebnisse in den einzelnen Regionen nacheinander oder gleichzeitig unter Anwendung bekannter Technologie bewertet werden.

Im Allgemeinen wird die Reaktivität des Analyten in Bezug auf jede Testregion oder jeden Behälter im Hinblick auf die Bindungsaffinität des Analyten zu dem darin enthaltenen Panelmitglied bewertet. Dieses Gebiet ist voll von Methoden zum Nachweis des Grades der Bindung einer Substanz an eine andere. Bei einem prototypischen Ansatz wird ein Partner, in diesem Fall das Panelmitglied, an einen festen Träger gebunden, und der andere Partner, in diesem Fall der Analyt, wird unter Verwendung von Radioisotopen, Fluoreszenz, Enzymen und dergleichen markiert, und nach Kontakt des Analyten mit dem trägergebundenen Panelmitglied wird der Träger gegebenenfalls von ungebundenem Analyten frei gewaschen, und die Menge der Markierung wird gemessen. Alternativ kann die Bindungsaffinität durch Konkurrenz zwischen dem Analyten und einem markierten Konkurrenten gemessen werden. Ein Verfahren mit derartiger kompetitiver Bindung, das in den vorstehend in Bezug genommenen Patenten beschrieben wird, beinhaltet die Konkurrenz zwischen dem Analyten und einem verschiedenartigen Gemisch von markierten Verbindungen, wobei das Gemisch ausreichend verschiedenartig ist, so dass das Gemisch gleichmäßig an jedes Mitglied des Testpanels bindet, so dass die Verringerung hinsichtlich der Markierung direkt ein Maß für den Grad der Bindung für den Konkurrenzanalyten ergibt. Es stehen auch Verfahren zur Verfügung, um den Grad der Bindung zwischen zwei Substanzen in homogenen Medien nachzuweisen, wie z.B. die EMIT-Technologie. Bei allen diesen Verfahren können beliebige herkömmliche Verfahren der Markierung angewandt werden. Zu den bevorzugten Verfahren gehört die Verwendung einer Konkurrenz mit fluoreszierender Markierung, z.B. die Anwendung der Fluoreszenzpolarisation. Die Erfindung betrifft Verfahren des Nachweises des Bindungsgrades, und jedes herkömmlicherweise angewandte Verfahren zur Messung der Bindungsaffinität zwischen einem Analyten und dem Mitglied des Panels kann herangezogen werden.

Es ist bevorzugt, Assayverfahren mit einem breiten Dynamikbereich anzuwenden. Die Quantifizierung der Affinität durch IC₅₀ für die Inhibition des Substratumsatzes oder andere kompetitive Bindungsereignisse können oftmals über mehr als 5 Log-Einheiten der Potenz gemessen werden.

Die Bestimmung eines charakteristischen Profils stellt das grundlegende Werkzeug für die erfindungsgemäßen Abgleichtechniken dar. Jedes Profil oder jeder Fingerabdruck wird durch Messung der individuellen Reaktivitäten bestimmt, wie Bindungsaffinitäten des Analyten für jedes Mitglied des Panels. Die Reaktivitäten werden dann in einer geordneten Anordnung aufgezeichnet, so dass sie dieses charakteristische Profil bereitstellen.

3 ist ein Flussdiagramm, das die Stufen beim Erhalten des charakteristischen Profils für einen Analyten zeigt.

Zunächst wird der Analyt mit jedem Panelmitglied (Panelmitglied i) in einem Panel von n Mitgliedern in Kontakt gebracht. Für jeden dieser Kontakte wird die Reaktion des Analyten mit dem Panelmitglied nachgewiesen und gemessen. Anschließend wird das Ausmaß der Reaktion aufgezeichnet, wobei man einen Datenpunkt für die Reaktivität, die mit jedem der n Mitglieder des Panels verbunden ist, erhält. Anschließend werden die aufgezeichneten Datenpunkte in einer ordentlichen Weise angeordnet, um das Profil zu erhalten. Eine zweckmäßige Weise der Anordnung dieser Datenpunkte besteht darin, jede Reaktivität in einer der Dimensionen eines n-dimensionalen Raums aufzutragen. Es stehen jedoch auch andere Maßnahmen zur Aufzeichnung der Profile zur Verfügung.

Die 4a bis 4b stellen Beispiele der Art dar, in der derartige Profile aufgezeichnet werden. In 4a wird der Analyt direkt im Hinblick auf die Bindungsaffinität für ein theoretisches Panel, das 10 Enzyme enthält, getestet. Die Ergebnisse werden in der Form eines Balkengraphen aufgezeichnet. Alternativ, wie in 4b gezeigt, können die Ergebnisse im Hinblick auf willkürliche Kategorien der Bindungsstärke, die durch ein Spektrum von weiß-schwarz repräsentiert werden, um den Grad der Affinität zu bezeichnen, tabuliert werden. Für die Computeranalyse sind numerische Werte besonders nützlich, wobei sie jedoch schwer durch visuelle Beobachtung zu interpretieren sind.

Sobald das charakteristische Profil eines Analyten aufgezeichnet ist, entweder wie in den 4a bis 4b gezeigt, oder in anderer grafischer, numerischer oder elektronischer Form, kann es für eine Reihe von Zwecken verwendet werden. Ein klarer Zweck besteht darin, einfach den Analyten zu charakterisieren, um in der Lage zu sein, das Profil mit dem einer unbekannten Verbindung abzugleichen. Das Profil kann auch genutzt werden, um die Konzentration des Analyten in einer Probe zu analysieren, unter Einschluss von Proben, die Gemische der Analyten enthalten. Das Profil kann auch genutzt werden, um das Bindungsvermögen einer Kandidatensubstanz mit dem eines Liganden, von dem bekannt ist, dass er an das Ziel bindet, zu vergleichen. Dies kann durch direkten Abgleich geschehen oder durch Abgleich des Profils mit dem eines Rezeptors unter Verwendung von Umkehrabbildungspanels, wie nachstehend beschrieben.

Eine Anwendung des Panels resultiert in der Identifizierung diagnostischer Merkmale von Molekülen oder „Pharmacophoren", die mit Rezeptorzielen in Wechselwirkung treten. Die Pattern-Matching-Techniken sind genau die gleichen wie die, die für Panels beschrieben wurden, die Antikörper oder Paraloga enthalten, wie sie in den vorstehend in Bezug genommenen Patenten 5,300,425 und 5,340,474 sowie in US-Patent 5,338,659 beschrieben werden.

Pattern-Matching kann herangezogen werden, um Verbindungen zu identifizieren, die eine gewünschte physiologische Aktivität aufweisen. Z.B. kann von Verbindungen, die Fingerabdrücke gegenüber den Referenzpanels ergeben, die ähnlich zu denen von Verbindungen sind, die entzündungshemmende Aktivität aufweisen, vorhergesagt werden, dass sie entzündungshemmende Aktivität aufweisen. Die Abgleichtechniken können variieren; die, die in dem vorstehend genannten US-Patent 5,338,654 beschrieben werden, sind jedoch besonders nützlich.

5 zeigt ein direktes Verfahren zur Identifizierung einer Substanz, die erfolgreich hinsichtlich der Bindung eines gewünschten Ziels ist.

Wie gezeigt, wird ein Profil für den Kandidaten in ähnlicher Weise, wie es vorstehend allgemein für einen Analyten beschrieben wurde, erhalten. Die gleichen Schritte unter Verwendung der gleichen Panelmitglieder werden im Hinblick auf einen Liganden durchgeführt, von dem bekannt ist, dass er an das gewünschte Ziel bindet. Auf diese Weise werden das Profil der Kandidatensubstanz und das eines Liganden erhalten. Diese Profile werden verglichen, z.B. in der Weise, die hier beschrieben wird, durch Bestimmung des Abstandes zwischen den Punkten, die durch Auftragung der Reaktivitäten gegen die Panelmitglieder im n-dimensionalen Raum erzeugt werden, und ein Kandidat, der ein Profil ähnlich dem des Liganden aufweist (d.h. z.B. nahe der Position des Punktes, der das Profil für den Liganden im n-dimensionalen Raum repräsentiert), wird als ein erfolgreicher Kandidat identifiziert. Der erfolgreiche Kandidat wird dann unter Verwendung der relevanten Ausgangsmaterialien synthetisiert, wobei man die gewünschte Substanz erhält.

Ein alternativer Ansatz besteht darin, Profile abzugleichen, die für die Kandidatensubstanz und das gewünschte Ziel bestimmt wurden, und die im Hinblick auf Umkehrabbildungspanels erhalten wurden. Dieser Ansatz ist in 6 erläutert.

Ein Umkehrabbildungssatz bezieht sich auf einen Satz von Mitgliedern, von denen jedes komplementär zu einem Mitglied des Referenzpanels, das vorstehend beschrieben wurde, ist. 2 ist im Zusammenhang mit der folgenden Beschreibung hilfreich. 2 zeigt ein Referenzpanel, bei dem repräsentative Moleküle speziell definierte Formen aufweisen, die mit 1-n nummeriert sind. Ein Umkehrabbildungspanel würde einem Satz von Molekülen entsprechen, der komplementär zu diesen Formen ist, gezeigt in der Figur als 1'-n'. Wie vorstehend angegeben, würde ein derartiges Umkehrabbildungspanel einen idealen Trainingssatz bei der Konstruktion der Surrogate darstellen. Es kann auch absichtlich für die Verwendung bei den Pattern-Matching-Techniken, die noch beschrieben werden, konstruiert werden. Die Mitglieder des Umkehrabbildungspanels werden als „Referenzkomplemente" bezeichnet, und zwar aufgrund ihrer komplementären Form. So passt z.B. Referenzkomplement 1' exakt zu Referenzpanelmitglied Nr. 1 und bindet dieses; Referenzkomplement 4' bindet exakt Referenzpanelmitglied Nr. 4 und passt dazu, usw. Die Konstruktion der Umkehrabbildungspanels wird auch in US-Patent 5,300,425 beschrieben.

Das allgemeine Pattern-Matching-Verfahren, das hier relevant ist, wird in 6 erläutert.

In 6 wird ein Profil einer Kandidatenverbindung auf eine Weise ähnlich zu der von 3 erhalten, wobei die Kandidatenverbindung mit jedem Panelmitglied behandelt und ein Profil erhalten wird, wie es in der linken Spalte gezeigt ist. Das Profil des gewünschten Ziels wird im Hinblick auf jedes Referenzkomplement eines n-Mitgliedersatzes erhalten, der eine Umkehrabbildung des Referenzpanels darstellt, wie es in der rechten Spalte gezeigt ist. Erneut werden die Profile verglichen, und ähnliche Profile werden identifiziert, um eine erfolgreiche Kandidatensubstanz zu erhalten, die an das Ziel bindet. Die erfolgreiche Kandidatensubstanz wird dann aus geeigneten Ausgangsmaterialien synthetisiert.

Natürlich könnten die Umkehrabbildungspanels umgekehrt werden; das Profil des Ziels wird im Hinblick auf das Referenzpanel erhalten, und das des Kandidaten im Hinblick auf dessen Umkehrabbildungsreferenzkomplementpanel.

Wie komplex auch immer die Struktur einer Kandidatenverbindung ist: Wenn sie ein strukturelles Merkmal aufweist, das ihre Bindung an ein Mitglied des Referenzpanels beeinflusst, wie die Pfeilkopfkonfiguration, die ausgelegt ist, in die dreieckige Höhlung zu passen, die für Referenzpanelmitglied Nr. 1 in 2 gezeigt ist, dann bindet sie an ein Ziel, das ein Oberflächenmerkmal aufweist (erneut unabhängig davon, wie komplex der Rest des Moleküls ist), das der dreieckigen Höhlung, die in Referenzpanelmitglied Nr. 1 in 2 gezeigt ist, ähnelt. Selbstverständlich bewirkt dieses Merkmal, dass eine Substanz, an die es selbst aufgrund dieses Merkmals bindet, an Referenzkomplement 1' im Umkehrabbildungspanel bindet. Aufgrund dieses gemeinsamen Merkmals stimmt das Profil des Kandidaten im Hinblick auf das Referenzpanel dann mit dem des Ziels im Hinblick auf das Umkehrabbildungspanel überein. Selbstverständlich ist es, da die erfindungsgemäßen Verfahren mit empirischen Fingerabdrücken arbeiten, nicht erforderlich, zu wissen, was die komplementären Motive im Hinblick auf die Molekülstruktur sind.

US-Patent 5,338,659, das vorstehend in Bezug genommen wurde, offenbart einen besonders effizienten Ansatz zur Durchführung der Vergleiche zwischen Profilen. Dieser Ansatz besteht darin, die erhaltenen Profile oder Fingerabdrücke im n-dimensionalen Raum aufzutragen, wobei n die Anzahl der Mitglieder des relevanten Panels ist und die Anordnung des Punktes in der Dimension eine Funktion der Reaktivität mit jedem Panelmitglied ist. Die Nähe der Punkte, die das unbekannte oder irgendein zuvor bestimmtes Profil im n-dimensionalen Raum repräsentieren, repräsentiert die Ähnlichkeit ihrer Zusammensetzungen. Es können auch multiparametrische statistische Techniken angewandt werden, um zu definieren, welche der n Dimensionen den größten Informationsgehalt relativ zu dem Assay aufweist, so dass die Auswahl einer minimalen Anzahl an Charakteristika oder Dimensionen, die vermessen werden, möglich wird.

Um die Profile als Werkzeuge bei der Vorhersage von Eigenschaften von Testsubstanzen oder in anderen Pattern-Matching-Anwendungen zu nutzen, und zwar unabhängig von den speziellen genutzten Pattern-Matching-Techniken, sollte das Referenzpanel geeignet sein, mindestens 90 % des chemischen Raums abzudecken, und es sollte einen mittleren Abstand zwischen Fingerabdrücken von allen Paaren von mindesten etwa dem Dreifachen des Rauschpegels, der durch wiederholte Bestimmung der Profile für eine einzelne Verbindung erzeugt wird, bereitstellen. Außerdem sollten die Fingerabdrücke, die durch das Referenzpanel bereitgestellt werden, mindestens fünf Hauptkomponenten im Hinblick auf den Bereich von kleinen organischen Verbindungen, die kommerziell erhältlich sind, bereitstellen. Z.B. wird dieser Bereich in typischer Form verwirklicht durch einen beliebigen Satz von ungefähr 1000 Verbindungen unter denen, die aus dem Aldrich Catalog of Fine Chemicals erhältlich sind.

Die Panels werden auch herangezogen, um Surrogate für ein gewünschtes Ziel zu erzeugen, um die Bindung von Kandidatenverbindungen zu bewerten, wie vorstehend beschrieben.

Die Anwendungen dieser Pattern-Matching-Verfahren im Hinblick auf die Profile oder Fingerabdrücke sind vielfältig. Z.B. ist es möglich, Peptide oder Proteine zu erhalten, die sich in biologisch wichtiger Weise verhalten, und zwar aufgrund der Einfachheit der Synthese oder aufgrund ihres natürlichen Auftretens. Peptide und Proteine sind jedoch nicht attraktiv als Arzneistoffe, da sie nicht leicht oral verabreicht und metabolisiert werden können, und da sie Probleme bei der Herstellung und Lagerung aufweisen; kleine Moleküle sind bevorzugt. Durch Abgleichung der Profile entweder durch direktes Pattern-Matching, inverse Panels oder Surrogate können geeignete kleine Ersatzmoleküle gefunden werden.

Eine weitere wichtige Anwendung ist die Vorhersage der Toxizität von Kandidatenarzneistoffen. Der Vergleich der entsprechenden Aspekte des Fingerabdrucks des Kandidatenarzneistoffs mit Merkmalen der Fingerabdrücke von bekannten Toxinen erlaubt eine derartige Vorhersage. In gleicher Weise erlaubt die Konstruktion von Surrogaten für Proteine, die ähnlich hinsichtlich der Sequenz oder Funktion zu dem Ziel sind, Nebenwirkungen aufgrund von Kreuzreaktionen vor Tierversuchen abzuschätzen, wobei nur Spurenmengen des betreffenden Proteins verwendet werden.

Noch eine weitere Anwendung der Profile und ihrer Korrelation betrifft die Bereitstellung von Parametern für die Verbesserung von dreidimensionalen Modellen der räumlichen Anordnung von Pharmacophoren, die durch herkömmliches Computer-Modelling erhalten werden. Der Vergleich des Fingerabdrucks einer speziellen Kandidatenverbindung, deren dreidimensionale Struktur mit einer idealisierten Beschreibung eines entsprechenden Liganden (des Pharmacophors) verglichen werden soll, mit Fingerabdrücken von Verbindungen, die verwandte Aktivitäten aufweisen, ergibt erhebliche zusätzliche empirische Informationen, die die Konstruktion genauerer dreidimensionaler Darstellungen von Peptiden oder anderen Makromolekülen erlauben können, die der konformationellen Variation unterliegen.

Diese Techniken erlauben auch die Verkleinerung großer Bibliotheken von Verbindungen auf kleinere Sätze, die dennoch die Verbindungen enthalten, die mit größter Wahrscheinlichkeit eine gewünschte biologische Aktivität aufweisen. Die verringerte Größe der Bibliothek erlaubt die Anwendung höher entwickelter Werkzeuge auf die Vorhersage der Affinität der Verbindungen in der verkleinerten Bibliothek für ein Ziel. Da die Größe der Bibliothek verringert ist, können umfangreiche Konformationsanalysen des Liganden an der aktiven Stelle sowie Konformationsänderungen der aktiven Stelle in Gegenwart des Liganden für die Bibliotheksmitglieder untersucht werden. Dies erlaubt auch eine genauere Analyse der elektrostatischen Wechselwirkungen zwischen dem Liganden und der Bindungsstelle unter Einschluss von Solvatationseffekten, die in Beziehung zur Desolvatation der Bindungskavität und des Liganden, wenn diese in Wechselwirkung treten, stehen. Die verkleinerte Bibliothek, die durch die Erfindung ermöglicht wird, ist erheblich kleiner als die, die üblicherweise in dreidimensionalen Datenbanken verwendet wird, was relativ größere Berechnungsanstrengungen im Hinblick auf jede Verbindung erlaubt.

Die allgemeinste Anwendung besteht einfach darin, die maximale funktionelle Verschiedenheit für eine gegebene Größe einer chemischen Bibliothek bereitzustellen; diese chemische Bibliothek stellt einen Kernsatz für ein Screening, einen Kernsatz für ein Computerscreening, Trainingssätze allgemein und chromatographische Liganden bereit. Diese Anwendung ist besonders nützlich für eine kombinatorische Bibliothek, in der sich typischerweise große Zahlen von recht ähnlichen Verbindungen finden.

Die Brauchbarkeit des Mustervergleichsansatzes ist erfolgreich gezeigt worden bei der Identifizierung nicht-steroidaler entzündungshemmender Arzneistoffe (NSAIDs). Viele NSAIDs sind auf der Basis ihrer Fähigkeit zur Inhibition von Cyclooxygenase (COX, auch bekannt als Prostaglandinsynthase) ausgewählt worden, die den ersten Schritt der Synthese von Prostaglandinen katalysiert, sowie aufgrund ihrer Aktivität in Tiermodellen. Kürzlich ist eine zweite Cyclooxygenase, COX-II, entdeckt worden, bei der es sich um ein Isoenzym der ursprünglich bekannten COX-I handelt. COX-II ist weitgehend beschränkt auf Zellen des Immunsystems, und es wird angenommen, dass sie bei Entzündungen wichtiger ist als COX-I.

Wie ausführlicher in Beispiel 2 dargelegt wird, wurden Fingerabdrücke für mehrere hundert Verbindungen unter Einschluss von zwei NSAIDs unter Verwendung der Proteinpanels (enthaltend 8 bis 10 Proteine) erhalten. Die Untersuchung der Fingerabdrücke dieser beiden Verbindungen zeigte ein gemeinsames Merkmal, von dem sich herausstellte, dass es von mehreren zusätzlichen bekannten NSAIDs, für die Profile oder Fingerabdrücke anschließend erhalten wurden, geteilt wird. Die Fingerabdrücke für mehrere hundert Verbindungen, die bereits getestet waren, wurden dann auf das Vorhandensein oder die Abwesenheit dieses Merkmals abgesucht. Es wurden zwölf Verbindungen aufgefunden, und diese wurden auf ihre Fähigkeit zur Inhibition von COX-I getestet. Zwei Verbindungen zeigten eine mäßige und eine eine messbare, jedoch geringe Fähigkeit in dieser Hinsicht, obgleich keine NSAID-Aktivität für diese Verbindungen zuvor angegeben wurde.

Das Panel der Proteine wurde dann optimiert, wie es vorstehend allgemein beschrieben wurde, und zur Bewertung einer Gruppe von strukturell verschiedenen Verbindungen herangezogen, die sieben bekannte COX-Inhibitoren und sechs Inhibitoren anderer Ziele umfasste. Die erhaltenen Fingerabdrücke erlaubten eine vollkommen genaue Vorhersage, ob eine Verbindung ein COX-Inhibitor ist oder nicht, obgleich die Proteine in dem Panel keinerlei Proteine repräsentierten, die zu COX durch Homologie oder durch Enzymaktivität verwandt waren.

Die hier beschriebenen Referenzpanels und Referenzpanels im Allgemeinen können herangezogen werden, um eine Fingerabdruckdatenbank zu erzeugen, die Fingerabdrücke einer Bibliothek von Verbindungen in physikalisch gespeicherter Form enthält, so dass sie deren Abfrage erlaubt. Diese Form kann entweder eine „Papier"-Datenbank sein oder vorzugsweise eine computerlesbare Form. Die Datenbank enthält die Fingerabdrücke von im Allgemeinen über 1000 Verbindungen im Hinblick auf ein Panel von Proteinen oder anderen Mitgliedern, wobei die Anzahl an Panelmitgliedern kleiner ist als der dreifache Wert der Anzahl der Hauptkomponenten, die in dem Panel repräsentiert sind. Die Verbindungen repräsentieren einen Bereich von Bindungsaffinitäten für die Panelmitglieder, der größer ist als drei Log, dargestellt als IC₅₀-Werte. In der ausgewählten Datenbank stellen mehr als 95 % der Verbindungen Fingerabdrücke bereit, die sichtbar sind, d.h. größer sind als der Rauschabstand vom Ursprung, und die eine mittlere Trennung von ihrem nächsten Nachbarn von mehr als dreimal dem Rauschabstand haben.

Diese Datenbanken sind nützlich in einer Reihe von Zusammenhängen. Durch Anwendung multivariater statistischer Methoden können gleich diverse Untergruppen erhalten werden, so dass verifiziert werden kann, dass eine aus der Datenbank ausgewählte Untergruppe von gleichem Interesse hinsichtlich der Vielfachheit ist, die von einer alternativen Untergruppe repräsentiert wird, die nach einem anderen Verfahren erhalten wurde. Multivariate Statistiken können auch herangezogen werden, um eine Untergruppe mit maximaler Verschiedenheit bei einer definierten Größe der Bibliothek auszuwählen; wenn z.B. die gewünschte Größe dem fünffachen Wert der Anzahl der Mitglieder des Referenzpanels entspricht, dann kann sie herangezogen werden als ein Trainingssatz, wie vorstehend beschrieben. Die Datenbank kann auch als eine Quelle für einen verschiedenartigen Satz von Chromatographieliganden verwendet werden.

Die nachstehenden Beispiele sollen die Erfindung veranschaulichen, aber nicht beschränken.

Um ein Surrogat zu konstruieren, müssen sowohl das Referenzpanel als auch der Trainingssatz adäquat sein. Um erfolgreiche Kandidatensubstanzen für eine gewünschte Eigenschaft zu erhalten, muss auch die Bibliothek adäquat sein.

Eine Bestätigung dafür, dass das Referenzpanel eine adäquate Anzahl von richtig gewählten Proteinen enthält, kann erhalten werden, indem ein X-Y-Plot des Abstandes zwischen Punkten im n-dimensionalen Raum (X-Achse), aufgetragen gegen die Häufigkeit dieses beobachteten Abstandes (Y-Achse), erhalten wird (Abstandsverteilung). Es ist daran zu erinnern, dass jeder Punkt im n-dimensionalen Raum das Profil repräsentiert, das für eine einzelne Verbindung aus der Verbindungsbibliothek im Hinblick auf ein Referenzpanel von n Mitgliedern erhalten wurde. Die Höhe, Form und maximale Spannweite dieser Abstandsverteilung ergibt Informationen zur Angemessenheit des Panels und der Bibliothek. Idealerweise sollte eine Poisson-Verteilung erhalten werden, wobei das Maximum der Verteilung bei einem hohen Wert des Abstandes zwischen Paaren liegt.

Die 7a, 7b und 7c repräsentieren die Abstandsverteilungen für den gleichen Satz von Verbindungen im Hinblick auf Referenzpanels, die 5, 7 bzw. 10 Proteine enthalten. Es ist ersichtlich, dass bei Verwendung von nur fünf Proteinen in dem Panel die Form der Verteilung etwas unregelmäßig ist und der häufigste Abstand zwischen Punkten relativ gering ist. Wenn jedoch die Anzahl der Proteine in dem Panel erhöht wird, ergibt sich eine regelmäßiger geformte Poisson-Verteilung mit einem größeren Abstand zwischen Punkten an ihrem Maximum. Die Anzahl der Mitglieder in dem Panel ist angemessen, wenn das weitere Zufügen von Mitgliedern die Position und Form dieser Verteilung nicht mehr verbessert.

Umgekehrt spiegeln die 8a bis 8c einen Fortschritt im Hinblick auf die Erzielung einer idealen Verteilung durch einfache Erhöhung der Anzahl von zufällig ausgewählten Verbindungen in der Verbindungsbibliothek wider. Der Plot von paarweisen Abständen zwischen den Verbindungen in einer chemischen Bibliothek sollte eine zufällige Verteilung von Abständen ergeben, wenn die Sammlung der Verbindungen vollständig ist. Wenn es Diskontinuitäten gibt, ist die Sammlung unvollständig. Darüber hinaus zeigen große Werte des maximalen Abstandes zwischen Mitgliedern eines Paars eine größere Mannigfaltigkeit in einem Satz von Verbindungen. Dies ist in den 8a bis 8c veranschaulicht. 8a zeigt den Plot Häufigkeit, aufgetragen gegen Abstand, vier Punkte, die Fingerabdrücke repräsentieren, die gegen einen Satz von zehn Referenzproteinen für 50 zufällig ausgewählte Verbindungen bestimmt wurden. Die Daten führen nicht zu einer Poisson-Verteilung, und die maximale Spannweite des Abstandes liegt bei etwas über acht Einheiten. 8b zeigt ähnliche Ergebnisse, wenn die Fingerabdrücke von 100 Verbindungen eingeschlossen werden; die Verteilung ist regelmäßiger geworden, und die maximale Spannweite hat auf ungefähr 12 Einheiten zugenommen. Wenn Fingerabdrücke für 1000 Verbindungen erhalten und verglichen werden, erreicht die maximale Trennung zwischen den Punkten im n-dimensionalen Raum 15 Einheiten, und die Verteilung nimmt die typische Poisson-Form an (8c).

Ähnliche Vergleiche können herangezogen werden, um die Angemessenheit von kleinen Anzahlen von möglicherweise stärker repräsentativen Verbindungen zu bewerten, z.B. um die Angemessenheit von kombinatorischen Bibliotheken zu bewerten, die vollständig aus Peptiden bestehen. 9b zeigt die Abstandsverteilung für 50 kommerziell erhältliche Arzneistoffe. Ein Vergleich dieser Verteilung mit der, die in 9a (entspricht 8a) für 50 strukturell verschiedene zufällige Verbindungen gezeigt ist, ergibt, dass die Verteilungen recht ähnlich sind. Wenn diese Verteilungen jedoch mit der verglichen werden, die für eine Bibliothek von Peptiden im Bereich von Dipeptiden bis zu 32-Meren erhalten wird, wie in 9c gezeigt, dann ist der überspannte Anteil des Raums um mehr als eine Einheit kleiner. Dies führt zu dem Schluss, dass Peptidbibliotheken als solche möglicherweise nicht angemessen sind, um den gesamten chemischen Raum zu repräsentieren.

Der Charakter der Abstandsverteilung kann auch herangezogen werden als ein Maß für die Mannigfaltigkeit eines speziellen Satzes von Kandidatenverbindungen, z.B. Substanzen, die als chromatographische Liganden erhältlich sind. Unter Verwendung der Abstandsverteilung als ein Kriterium kann eine minimale Anzahl von Liganden bereitgestellt werden, um das größtmögliche Spektrum des Trennungswirkungsgrades zu bieten. Mit anderen Worten können derartige Abstandsverteilungen herangezogen werden, um die maximale Mannigfaltigkeit von Panels von chromatographischen Liganden, die konstruiert wurden, wie in US-Patent 4,963,263 beschrieben, zu verifizieren oder nichtpolymere Verbindungen zu wählen, die als verschiedenartige chromatographische Liganden dienen.

Eine Datenbank von einem Fingerabdruckbestimmung unterzogenen Verbindungen, die Fenoprofen, Flufenaminsäure, Ibuprofen, Endoprofen, Ketoprofen, Mefenaminsäure, Naproxen, Piroxicam und Sulindac umfasste, wurde erstellt. Ein Panel von Proteinen wurde hergestellt, wobei die Proteine kommerziell erhalten oder rekombinant in E. coli expremiert und gereinigt wurden. Alle diese Proteine waren Enzyme im Anfangspanel, und ein IC₅₀-Wert wurde in einem enzymatischen Assay bestimmt. Ein überarbeitetes Panel umfasste weitere Proteine, und die Bindung konnte durch Fluoreszenzpolarisation bestimmt werden. Keines dieser Proteine hatte irgendeine Homologie zu einem Ziel der NSAIDs, nämlich Cyclooxygenase.

Die Verifikation der vorhergesagten COX-Inhibitoren erfolgte durch Bewertung der COX-Aktivität in Gegenwart und Abwesenheit der der Fingerabdruckabdruckbestimmung unterzogenen Verbindung. Sowohl COX-I vom Widder als auch COX-II vom Schaf wurden getestet. Die Assays wurden durch Inkubation des Enzyms bei 37°C in 0,1 mM Arachidonsäure, enthalten in 0,1 M TRIS, pH-Wert: 8,0, mit 20 mM Phenol durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde kräftig gerührt, um eine signifikante Konzentration an gelöstem Sauerstoff zu erhalten, und zwar für 3 Minuten. Die Reaktion wurde dann durch Zugabe von 5 mM Zitronensäure abgebrochen, und die Proben wurden verdünnt. Die PGE₂-Konzentration wurde durch EIA unter Verwendung eines Standardkits von Caymen Chemicals gemessen.

Die ersten mehreren hundert Verbindungen, die gegen das Anfangspanel von 10 Enzymen getestet wurden, enthielten Ibuprofen und Indomethacin, zwei bekannte NSAIDs. Die 10 Enzyme in diesem Panel sind die, die hier in 10 gezeigt und im nachstehenden Beispiel 3 aufgelistet sind. Beide wiesen gemeinsame Merkmale in ihren Fingerabdrücken auf, von denen versuchsweise angenommen wurde, dass sie diagnostisch für einen NSAID sind. Bei der Bewertung der restlichen Verbindungsfingerabdrücke wurden 12 zusätzliche Verbindungen gewählt, die diese Merkmale teilten. Diese wurden auf ihre Fähigkeit zur Inhibition von COX-I und COX-II untersucht. Es wurden zwei COX-I-Inhibitoren mit mäßiger Affinität und ein COX-I-Inhibitor mit niedriger Affinität gefunden. Neun Verbindungen, die versuchsweise identifiziert worden waren, inhibierten also diese Enzyme nicht, es wurden jedoch zwei neue Leitverbindungen ohne Screening der gesamten Bibliothek gegen COX gefunden. Diese neuen Leitverbindungen waren in ihrer Struktur signifikant verschieden von den bekannten NSAIDs: Ibuprofen und Indomethacin.

Das Referenzpanel wurde dann überarbeitet, so dass Enzyme eingeschlossen waren, die das Panel durch Erweiterung des Bereiches von Chemikalien, die einem Fingerabdruck unterzogen werden können, und durch Erhöhung der mittleren und maximalen Abstände zwischen Fingerabdrücken anreicherten. Die Proteine in dem Panel sind die, die in 13 und nachstehend im Beispiel 4 aufgelistet sind. Die Verbindungen wurden erneuten Fingerabdruckbestimmungen unterzogen. Von den neun Verbindungen, die ursprünglich ausgewählt wurden, die dann aber COX nicht inhibierten, blieben nur zwei mutmaßlich ähnlich zu dem NSAID-Profil gegenüber diesem überarbeiteten Panel.

Das überarbeitete Panel wurde herangezogen, um eine Gruppe von 13 nicht identifizierten Verbindungen Fingerabdruckbestimmungen zu unterziehen, und die Fingerabdrücke wurden mit dem NSAID-Konsensus-Fingerabdruck, der von Ibuprofen und Indomethacin erhalten wurde, verglichen. Beim Vergleich zeigten sieben der Verbindungen Merkmale, die vorhersagten, dass sie COX inhibieren würden, und sechs führten zur Vorhersage, dass sie dies nicht tun würden. Die Fingerabdrücke identifizierten in genauer Weise Flosulid, Phenylbutazon, Pirprofen, Prinomid, Oxindanac, Oxindanac-Analogon und Diclofenac als Inhibitoren von COX und die Verbindungen Chlordiazepoxid, Maprotilin, Imipramin, Metoprolol und Pentopril als Nichtinhibitoren. Zu diesen Nichtinhibitoren gehörte auch ein Diclofenac-Prodrug, das selbst dieses Enzym nicht inhibiert.

In diesem Beispiel sind die Panelmitglieder, deren Profile im Hinblick auf einen Trainingssatz von Verbindungen erhalten werden, Isoenzyme von Glutathion-S-Transferase (GST). Das Referenzpanel, das 10 derartige Isoenzyme enthält, ist oben in 10 gezeigt. Das Ziel war in diesem Beispiel Glutathionreductase (GRd), rechts gezeigt. Die ersten 20 Verbindungen, die oben aufgelistet sind, wurden als ein Trainingssatz verwendet, und beim Test auf die Bindung an Glutathionreductase erzeugten sie das Profil, das rechts mit GRd markiert ist. In dieser „Grauskala" gilt: je dunkler das Quadrat, umso fester bindet die Verbindung; je heller, desto weniger fest bindet sie. Die Liste der Verbindungen und Abkürzungen ist auf der linken Seite von 10 angegeben.

Für das Referenzpanel wurden die GSTs A1-1, P1-1, M1a-1a und M2-2 als rekombinante humane Enzyme bereitgestellt; R1-1, R8-8 sind Rattenenzyme der Alpha-Klasse; R1(25)-8 ist eine gerichtete Mutante von R8-8. HF2 und HF3 sind Stubenfliegen-GST-Enzyme, gereinigt durch Hexyl-glutathion-Affinitätschromatographie aus Zelllinien, die von M. Syvanen bei UC Davis bereitgestellt wurden; Schistosoma-GSTS1 ist erhältlich von Pharmacia als Teil eines Fusionsproteinklonierungsvektors. Glutathionreduktase aus Hefe wurde von Sigma bezogen.

Um den Grad der Bindung zwischen den GSTs und den Verbindungen auf der linken Seite der Tabelle zu testen, wurden fünf serielle 5-fach-Verdünnungen von 250 &mgr;M bis 0,4 &mgr;M getestet, und die 50%-ige Inhibitionskonzentration (IC₅₀) wurde aus einer Kurve, die an die Daten angepasst wurde, berechnet. Für Verbindungen mit einem abgeschätzten IC₅₀-Wert unter 0,4 &mgr;M wurden zusätzliche Verdünnungen getestet, bis der wahre IC₅₀-Wert eingeklammert war. Vier der GSTs und 20 Verbindungen wurden als maximal mannigfaltig ausgewählt. Die IC₅₀-Werte sind in der Figur auf einer Skala angezeichnet, und zwar von kleiner als 0,4 &mgr;M; kleiner als 2,0 &mgr;M; kleiner als 10,0 &mgr;M; kleiner als 50 &mgr;M; kleiner als 250 &mgr;M; und kleiner als 1000 &mgr;M. IC₅₀-Werte kleiner als 0,4 &mgr;M erscheinen schwarz auf dieser Skala; die mit IC₅₀-Werten kleiner als 1000 &mgr;M erscheinen weiß. Zwischenwerte haben variierende Grauschattierungen.

Die Spalte, die als „angepasste vorhergesagte Werte" in 10 markiert ist, wird durch lineare Kombination der Ergebnisse für die vier Enzyme, die in dem Panel von Referenzrezeptoren verwendet wurden, die gegen die 20 Verbindungen getestet wurden, die in dem Diagramm zuerst angegeben sind, erhalten. Diese gleiche Anpassungskombination wird dann herangezogen, um die GRd-Bindung der restlichen Verbindungen vorherzusagen. Die vorhergesagten Ergebnisse werden mit den tatsächlichen Ergebnissen gegenüber dem Ziel in den rechten Spalten der Figur verglichen. Es wird eine gute Korrelation erhalten; der Regressionskoeffizient beträgt 0,8 bei einem Dispersionsfaktor von 0,7, wie in den 11a und 11b gezeigt ist; dies ist mehr als angemessen, um Vorhersagen für neue Verbindungen zu machen. 11a zeigt die Daten für die 80 Testverbindungen von 10, die in dem Anpassungsverfahren nicht berücksichtigt wurden, und 11b zeigt die Reste (experimentell vorhergesagt) aus 11a.

Die mathematische Form für die lineare Regression lautet: log(IC₅₀)_i,T = &Sgr;nj=1 C^Rj log(IC₅₀)_i,Rj(1)

Wie in dieser Formel angegeben, wird der IC₅₀-Wert für Verbindung i gegenüber Ziel T oder Referenzprotein R_j gemessen, gewichtet durch den Anpassungskoeffizienten C^Rj.

Die erfolgreiche Korrelation, die vorstehend erhalten wurde, ist überraschend, da GRd, die aus Hefe stammt, ein NADPH-abhängiges Protein ist, das eine andere enzymatische Funktion als GST hat. Diese Enzyme teilen keine Sequenzhomologie, und ein Vergleich der Kristallstrukturen von GST und GRd zeigt keine Tertiärstrukturähnlichkeiten. Die gemeinsame Nutzung von Glutathion scheint zur Korrelation nicht beizutragen, da die sechs Peptidvarianten von Glutathion, die an verschiedene GSTs binden, nicht besonders gut an GRd binden.

Das allgemeine Verfahren, das in Beispiel 3 angegeben ist, wurde befolgt, jedoch unter Verwendung eines anderen Referenzpanels und einer erweiterten Verbindungsbibliothek.

Ein Anfangssatz von acht Proteinen wurde durch primäres Screening von etwa 100 Proteinen gewählt, von denen allgemein erwartet wurde, dass sie eine breite Kreuzreaktivität gegenüber kleinen organischen Molekülen zeigen. Die acht Panelmitglieder wurden auf der Basis der Anreicherung des Panels der GSTs, das in Beispiel 3 verwendet wurde, wie vorstehend beschrieben, gewählt. Vier der schließlichen Panelmitglieder waren Glutathion-S-Transferase (GST)-Isoenzyme: humanes A1, Ratten-R8, Stubenfliegen-HF2 und Schistosoma-S1. Die restlichen Panelmitglieder waren D-Aminosäureoxidase (DAO) aus Schweineniere (EC 1.4.3.3); Butyrylcholinesterase (BCh) aus Pferdeserum (EC 3.1.1.8); Papain (Pap) (EC 3.4.22.2) und Schlangengiftphosphodiesterase I (PDE) aus Crotalus adamantaeus (EC 3.1.4.1). Kreuzreaktivitätsprofile wurden im Hinblick auf dieses Panel von acht Proteinen für eine repräsentative Probe von 122 verschiedenartigen Verbindungen, die zusammen mit ihren Identifikationscodes in 12 aufgelistet sind, erhalten.

Aus Gründen der Zweckmäßigkeit wurde bei der Bestimmung der Fingerabdrücke die Bindung der einzelnen Verbindungen an die einzelnen Proteine quantitativ bestimmt als die Konzentration, die erforderlich ist, um 50 % der Proteinaktivität zu hemmen (IC₅₀). Die IC₅₀-Werte erstrecken sich über einen Bereich von mehr als vier logarithmischen Einheiten von 1 mM bis weniger als 0,05 &mgr;M.

Eine Untergruppe von 12 der 122 zunächst getesteten Verbindungen wurde auf der Basis einer hohen Selektivität dieser Verbindungen zu dem einen oder anderen Protein in dem Referenzpanel ausgewählt. Dieser anfängliche Trainingssatz von 12 Verbindungen wurde auf die inhibitorische Aktivität im Hinblick auf die beiden Zielenzyme Glutathionreduktase (GRd) und Aldehyddehydrogenase (AdDH) untersucht. Diese beiden Proteine sind nicht miteinander verwandt, und sie sind nicht durch Aminosäurehomologie oder Aktivität zu irgendeinem der Referenzproteine in dem Panel verwandt. Die 12 ausgewählten Verbindungen für den Trainingssatz sind die ersten 12 Verbindungen, für die Ergebnisse in 13 gezeigt sind. Ein Surrogat wurde auf der Basis dieses Trainingssatzes durch Anwendung einer linearen Regression auf die Daten erhalten, um die Koeffizienten in der vorstehenden Gleichung (1) zu erhalten. Dies führte zu den folgenden Regressionsgleichungen für diese Iteration:

Für Glutathionreduktase: 0,11 BCh + 0,19 HF2 + 1,79;

Für Aldehyddehydrogenase: 0,55 PDE + 1,35.

Das resultierende Surrogat wurde herangezogen, um für jedes Ziel einen zweiten Satz von 10 Verbindungen (aus den restlichen 110) auszuwählen, von denen angenommen wurde, dass sie stärker repräsentativ für den Bereich der Potenzen für diese Ziele waren. Diese 10 Verbindungen (markiert durch senkrechte Balken in 13 und in den meisten Fällen verschieden für die Ziele) wurden dann direkt gegenüber den Zielverbindungen getestet, und die aus diesen Tests erhaltenen Daten wurden herangezogen, um die Ergebnisse der ersten 12 Verbindungen zu ergänzen, wobei ein gesamter Trainingssatz von 22 Verbindungen für jedes Ziel bereitgestellt wurde. Eine lineare Regression, angewandt auf diesen neu definierten Trainingssatz, ergab die folgenden Formen von Gleichung (1) für die beiden Ziele:

Für Gluthationreduktase: 0,21 BCh + 0,72 HF2 + 0,24 S1 – 0,05;

Für Aldehyddehydrogenase: 0,58 PDE + 0,25 R8 + 0,43.

Die Vorhersagen auf der Basis dieser zweiten Iteration für die restlichen 100 Verbindungen wurden dann mit den tatsächlichen empirischen Werten, die getrennt gemessen wurden, wie in den 14a und 14b gezeigt, verglichen. Jeder dieser Graphen repräsentiert einen Korrelationsplot der Werte –logIC₅₀ für das Ziel, wie experimentell bestimmt (auf der X-Achse), mit den vorhergesagten Werten –logIC₅₀ (auf der Y-Achse).

Die auf diese Weise erhaltenen statistischen Parameter zeigten, dass eine vernünftige Korrelation erhalten wurde und dass die Korrelation durch die zweite Iteration verbessert wurde. Für Glutathionreduktase betrug der Regressionskoeffizient (R), der die Korrelation zwischen Experiment und Vorhersage misst, 0,72 für die erste Iteration und 0,85 für die zweite. Die Dispersionen (&sgr;), die die Streuung um die Regressionslinie für den Trainingssatz oder den Vorhersagesatz messen, betrugen 0,22 bzw. 0,59 für die Iteration 1 und 0,41 bzw. 0,46 für die Iteration 2. Der F-Testwert (F), der die Verbesserung der Anpassung als das Verhältnis der Dispersion für die gegenwärtige Anpassung, verglichen mit der vorherigen Iteration, unter Verwendung von zufälligen Daten für den Anfangsvergleich misst, betrug 4,7 für Iteration 1 und 15,9 für Iteration 2.

Für Aldehyddehydrogenase betrug R 0,4 für Iteration 1 und 0,86 für Iteration 2, eine erhebliche Verbesserung. Die Sigma-Werte für den Trainingssatz und den Vorhersagesatz betrugen 0,51 bzw. 0,6 für Iteration 1 und 0,50 bzw. 0,48 für Iteration 2. Der F-Wert betrug 6,9 für Iteration 1 und 27,4 für Iteration 2.

Die mathematischen Techniken, die angewandt wurden, um die vorstehenden Daten zu erzeugen, werden in J.R. Green et al., „Statistical Treatment of Experimental Data" (Elsevier, Amsterdam 1978) und D. Massart et al., Chemometrics (Elsevier, New York 1988) beschrieben.

Die in Beispiel 4 beschriebenen Techniken wurden auf verschiedene Ziele zusätzlich zu Aldehyddehydrogenase und Glutathionreduktase unter Verwendung eines Panels von 13 Proteinen angewandt, das weiter angereichert war gegenüber dem Panel von Beispiel 4, und zwar in der gleichen Weise, in der Beispiel 4 ein Panel nutzte, das im Hinblick auf das von Beispiel 3 angereichert war. Surrogate wurden gegenüber den zusätzlichen Zielen konstruiert: Östrogenrezeptor, Glycerolkinase, Schistosoma-GST, Nucleosid-5'-diphosphatkinase, humaner Faktor Xa, Trypsin und Glyoxalase I. In jedem Fall wurde ein mannigfaltiger Satz von 15 bis 50 Verbindungen, genommen aus einem Datenbankkatalog von über 1000 Verbindungen, für die Anpassung verwendet. Für jede Bestimmung umfasste das Panel mindestens die folgenden Enzyme: GST A1-1; saures &agr;-1-Glycoprotein; GST P1-1; Humanserumalbumin; Papain; GST Ratte 12:12 (&thgr;); GST Stubenfliege 3; Butyrylcholinesterase; GST Ratte 8:8; Trypsin; und Alkoholdehydrogenase. Selbstverständlich wurde Trypsin nicht in das Panel aufgenommen, für das Trypsin das Gegenstückziel war. In einigen Fällen wurde GST Ratte 8:8 durch Plasmin ersetzt, und/oder Alkoholdehydrogenase wurde durch Antitrypsin ersetzt.

Diese Surrogate wurden mit experimentell bestimmter Bindung korreliert, wie es in 15 gezeigt ist. Die Korrelationen zeigten im Allgemeinen eine gute Übereinstimmung zwischen dem Surrogat und dem tatsächlichen Ziel. In jedem Fall ergab eine andere lineare Kombination der Referenzproteine die beste Anpassung. In keinem Fall gab es eine Sequenzhomologie zwischen Ziel und Anpassungsproteinen.