Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Feststellen von kolorektalen Adenomen und von kolorektalem Krebs und insbesondere ein Verfahren zum Feststellen solcher Adenome und solchem Krebs unter Verwendung der Protonenmagnetresonanzspektroskopie.

Kolorektaler Krebs ist eine der häufigsten Krebsarten, in den USA und Kanada mit ungefähr 146.000 neuen Fällen in 1999. Das lebenslange Risiko, dass ein Individuum in Nordamerika kolorektalen Krebs entwickeln wird, beträgt ungefähr 5–6 %. Mit kolorektalem Krebs verbundene Symptome, einschließlich Blut im Stuhl, Anämie, Schmerzen im Unterleib und Veränderung des Eingeweideverhaltens („bowel habits"), werden nur offensichtlich, wenn die Krankheit deutlich vorangeschritten ist. Bekanntlich hängt die Prognose für einen Patienten großteils vom Stadium der Krankheit zur Zeit der Diagnose ab. Während die Fünf-Jahres-Überlebensrate für einen Patienten, dessen kolorektaler Krebs zu einem frühen Zeitpunkt entdeckt wird, 92 % ist, sinkt die Überlebensrate bei Patienten mit regionaler Ausbreitung auf ungefähr 60 % und bei denen mit entfernten Metastasen auf ungefähr 6 %. Daher ist es wichtig, die Vorläuferadenome und Vorläuferkrebszellen so früh wie möglich zu entdecken, um die Chancen eines erfolgreichen therapeutischen Eingriffs zu erhöhen.

Das „Screening" nach einer Krankheit erfordert, dass die Krankheit in einem großen Teil der Population verbreitet ist und dass eine frühzeitige Erkennung der Krankheit die Sterblichkeit verringert und die Lebensqualität verbessert. Kolorektaler Krebs erfüllt diese Anforderungen (Mandel JS, Church TR, Ederer F, Bond JH, Colorectal cancer mortality: effectiveness of biennial screening for fecal occult blond. J Natl Cancer Inst 1999; 91: 434–437 and Mandel JS, Bond JH, Church TR, Snover DC, Bradley GM, Schuman LH, Ederer F, Reducing mortality from colorectal cancer by screening for fecal occult blond. Minnesota colon cancer control study, N Eng J Med 1993; 328; 1365–1371) und ist daher ein idealer Kandidat für solch ein Programm. Die Entwicklungsgeschichte von kolorektalem Krebs, nämlich der Verlauf vom Adenom zum Adenkarzinom, der über eine Zahl von Jahren (5–15) erfolgt, macht es auch zu einem geeigneten Ziel. Die Kosten-Nutzen-Analyse für die Früherkennung von kolorektalem Krebs wurde ebenfalls als günstig dargestellt (Bolin, TD. Cost benefit of early diagnosis of colorectal cancer, Scand J Gastroenterol 1996; 31 Suppl 220: 142–146).

Die Screeningmethode als solche muss auch eine Serie von Kriterien, wie etwa hohe Sensitivität und Spezifität, geringe Kosten, sichere Durchführung und Einfachheit, erfüllen. Derzeit werden für diesen Zweck digitale Rektaluntersuchung (digital rectal examination; DER), Test auf okkultes Blut im Stuhl (fecal occult blond test; FOBT), Bariumeinlauf und direkte Kolonvisualisierung (Sigmoidoskopie und Kolonoskopie) verwendet.

DER schließt das Untersuchen des Rektums unter Verwendung eines Fingers ein. Dieses Verfahren stellt Krebs fest, der ertastet werden kann und in Reichweite des Fingers ist. Eine negative DER bietet eine geringe Rückversicherung, dass ein Patient frei von Krebs ist, weil weniger als 10 % von kolorektalem Krebs mit dem Untersuchungsfinger ertastet werden können.

FORT stellt mit chemischen Mitteln verborgenes Blut im Stuhl fest. Obwohl es die am wenigsten teure und einfachste Methode ist, hat FORT eine geringe Sensitivität, eine moderate Spezifität und ist gewöhnlich für die Früherkennung nicht ausreichend. Gemäß der zur Verfügung stehenden Daten ist es ein großer Nachteil dieses Verfahrens, dass mehr als die Hälfte der durch dieses Verfahren entdeckten Krebsgeschwüre, gefolgt von Röntgenuntersuchung oder Endoskopie, in der Regel über die Grenze eines frühen Stadiums hinaus ist. Eine falsch positive Rate von 10–12 % wird erwartet, wenn die Patienten bei uneingeschränkter Ernährung untersucht werden. Einschätzungen der positiven Voraussagewerte reichen von 2,2 bis 50 %. Die Guaiac-Tests haben eine sehr geringe Sensitivität, allgemein etwa 50 % (Ransohoff DF, Lang CA. Screening for colorectal cancer with the fecal occult blond test; a background paper. Ann Intern Med 1997; 126: 811–822). Die Verwendung von FORT basiert auf der Annahme, dass kolorektaler Krebs mit Blutungen assoziiert ist. Jedoch bluten einige kolorektale Krebsarten periodisch und andere überhaupt nicht.

Ein Bariumeinlauf bringt eine Röntgenuntersuchung der Eingeweide unter Verwendung eines Kontrastmittels mit sich. Der Einlauf kann ein Einfach- oder ein Doppelkontrasteinlauf sein. Die wesentlichen radiologischen Anzeichen eines Malignoms beinhalten Unterbrechungen der Schleimhaut, abrupte Trennung und Schulterbildung und lokale Läsionen mit scharfer Abgrenzung von nichtbeteiligten Arealen. Die geschätzte Sensitivität eines Doppelkontrastbariumeinlaufs für Krebs und große Polypen beträgt nur ungefähr 65–75 % und noch weniger für kleine Adenome. Ungeachtet seines besseren diagnostischen Ergebnisses hat der Doppelkontrastbariumeinlauf eine falsch negative Rate von 2–18 %. Darüber hinaus beinhaltet dieses Verfahren die Belastung mit Strahlung, wobei wiederholte Anwendung nicht sicher sein mag. Perforation durch Bariumeinläufe ist extrem selten, aber wenn sie erfolgt, kann sie tödlich sein oder zu schweren Langzeitproblemen aufgrund des Eindringens von Barium in die Bauchhöhle führen.

Eine Vielzahl von Instrumenten (allgemein als Endoskope bezeichnet) wird zum Untersuchen der Eingeweide verwendet. Endoskope können starr oder flexibel mit unterschiedlicher Länge sein. Flexible Sigmoidoskope sind 60 cm lang. Ein Kolonoskop ist ein 130–160 cm langes flexibles Untersuchungsinstrument zum Untersuchen des gesamten Darms. Biopsien können von verdächtig aussehenden Arealen genommen werden, während der Darm durch das Endoskop betrachtet wird. Die flexible Sigmoidoskopieuntersuchung ist auf die linke Seite des Kolons und des Rektums begrenzt. Wenigstens ein Drittel der krebsartigen Tumore tritt in Bereichen nahe der Flexura coli sinistra („splenic flexure") auf, die mit der Sigmoidoskopie nicht erreichbar ist. Kolonoskopie hat eine hohe Sensitivität und bleibt der Goldstandard zur Visualisierung des Kolons und dem Feststellen krebsartiger Abnormalitäten. Jedoch ist sie invasiv, recht teuer und setzt den Untersuchten dem Risiko einer Perforation der Eingeweide aus. Magnetresonanzspektroskopie (magnetic resonance spectroscopy; MRS) ist ein Verfahren, dass das Potential hat, kleine und frühe biochemische Veränderungen, die mit Vorgängen einer Krankheit assoziert sind, zu erkennen und hat sich als nützlich bei der Untersuchung von Gewebebiopsien von Krebspatienten erwiesen. (Smith I.C.P, Bezabeh T. Tissue NMR Ex Vivo. In: Young IR, ed Methods in Biomedical magnetic resonance imaging and spectroscopy, Chichester, UK; Wiley, 2000: 891-7). Es ist insbesondere nützlich, um kleine mobile chemische Spezies in einer gegebenen biologischen Probe festzustellen, die von diagnostischem Interesse sind. Das Erhalten von Gewebeproben für solch eine Untersuchung jedoch schließt gewöhnlich ein invasives Vorgehen ein.

Es gibt eine Anzahl von zur Zeit verfügbaren Verfahren zum Feststellen von Krebs in seinen Stadien. Biophysikalische Verfahren wie etwa herkömmliche Röntgenuntersuchungen, Nuklearmedizin, geradlinige Scanner, Ultraschall, CAT und MRI, spielen alle eine wichtige Rolle bei der Früherkennung und Behandlung von Krebs. Klinische Labortests für Tumormarker können ebenso als Unterstützung in der Früherkennung von Krebs verwendet werden. Tumormarkertests messen entweder tumorassoziierte Antigene oder andere bei Krebspatienten vorhandene Substanzen, die bei der Diagnose, der Einteilung in Stadien, dem Krankheitsfortschritt, dem Überwachen der Antwort auf eine Therapie und dem Feststellen einer wiederkehrenden Krankheit helfen. Unglücklicherweise weisen die meisten Tumormarkertests keine ausreichende Spezifität auf, um in kosteneffektiver Weise als Screening-Werkzeuge verwendet zu werden. Selbst hochspezifische Tests leiden an einem geringen Vorhersagewert, weil die Prävalenz eines bestimmten Krebs in der Gesamtpopulation relativ gering ist. Die Mehrzahl von erhältlichen Tumormarkertests ist bei der Diagnose von Krebs bei Patienten mit Symptomen nicht nützlich, weil erhöhte Mengen von Markern ebenso in einer Vielzahl von leichten Erkrankungen beobachtet werden. Der hauptsächliche klinische Wert von Tumormarkern liegt in der Einteilung von Tumoren nach ihrem Verlauf, Überwachen therapeutischer Antworten, Vorhersagen der Patientenentwicklung und Feststellen von wiederkehrendem Krebs.

Die US Patente 4,912,050 und 4,918,021, erteilt für E.T. Fossel am 27. März 1990 und 17. April 1990 offenbaren eine Methode zum Feststellen von Krebs durch Protonkernmagnetresonanztomographie (nuclear magnetic resonance; NMR) von Blut, Blutserum oder Blutplasma. US Patent Nr. 5,261,405, erteilt für denselben Erfinder am 16. November 1993, beschreibt eine Vorrichtung und ein Verfahren zum Automatisieren dieses Prozesses.

US Patent Nr. 5,318,031, erteilt für Mountford et al. am 7. Juni 1997, beschreibt ein Verfahren zum Bestimmen chemischer Zustände von lebenden Tieren oder menschlichem Gewebe unter Verwendung eindimensionaler NMR und 2D-COSY (zweidimensionale Korrelations) NMR Spektroskopie und Vergleichen der gemessenen Werte mit Referenzmessungen von normalem, abnormalem und Übergangszustandsgewebe.

C. L. Lean et al. (Magn Reson Med 20: 306–311, 1991; Biochemistry 3: 11095–11105, 1992 and Magn Reson Med 30: 525–533, 1992) beschreiben die Verwendung von Magnetresonanzspektroskopie, um Kolonzellen und Gewebeproben zu untersuchen.

Jedoch besteht noch immer ein Bedarf an einem kostengünstigen nicht-invasiven Verfahren zum Feststellen von kolorektalem Krebs und kolorektalen Adenomen. Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein relativ einfaches, nicht-invasives Verfahren zum Feststellen kolorektaler Adenome und von kolorektalem Krebs bereitzustellen, das die oben definierten Kriterien von hoher Sensitivität und Spezifität, geringen Kosten und sicherer Durchführung erfüllt.

Die internationale PCT Veröffentlichung Nr. WO 02/12879 A2 am 14. Februar 2002 beschreibt ein Verfahren zum Feststellen der Anwesenheit von kolorektalen Adenomen und kolorektalem Krebs in einem Patienten mit den Schritten Unterwerfen einer Stuhlprobe eines Patienten der Magnetresonanzspektroskopie; und Vergleiches des resultierenden Spektrums mit den Magnetresonanzspektra von Stuhl von nicht von Krebs betroffenen Subjekten, wobei die beobachteten Unterschiede in den Spektren indikativ für Krebs oder klinisch signifikante Adenome sind.

Das Durchführen der Spektralanalyse von menschlichem Stuhl bietet gegenüber anderen Verfahren einen deutlichen Vorteil, weil das Aufnehmen der Probe nicht-invasiv ist und kein Risiko für den Patienten darstellt. Darüber hinaus ist vor der Analyse keine besondere Verarbeitung der Probe erforderlich.

Eine Alternative zu dem in der oben genannten PCT Veröffentlichung beschriebenen Verfahren, bei der eine flüssige Suspension der Stuhlprobe der Magnetresonanzspektroskopie unterworfen wird, wurde durch den Erfinder der vorliegenden Erfindung entwickelt. Der Grundgedanke hinter diesem neuen Verfahren ist derjenige, dass die diagnostischen Marker in einer Probe mehr als wahrscheinlich kleine, wasserlösliche Spezies sind.

Speziell stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Feststellen des Vorhandenseins von kolorektalen Adenomen und kolorektalem Krebs bei einem Patienten bereit, bei dem eine Stuhlprobe eines Patienten Gegenstand der Magnetresonanzspektroskopie ist und das resultierende Spektrum mit den Magnetresonanzspektren von nicht an Krebs erkrankten Patienten verglichen wird, wobei beobachtete Unterschiede in den Spektren indikativ für Krebs oder klinisch signifikante Adenome sind, dadurch gekennzeichnet, dass die Stuhlprobe des Patienten mit einem Puffer zum Bilden einer flüssigen Suspension gemischt wird und die Suspension zentrifugiert wird, um einen Überstand zu erhalten, der der Magnetresonanzspektroskopie unterworfen wird.

Eine Zentrifuge wurde verwendet, um Überstandsproben aus dem Stuhl der Patienten zu präparieren. Der Stuhl wurde homogenisiert und dann heruntergedreht. Wie oben erwähnt, besteht der Grundgedanke, dass die diagnostischen Marker in der Probe mehr als wahrscheinlich kleine, wasserlösliche Spezies sind. Vom Überstand wird angenommen, dass dieser die diagnostische Information enthält und die Spektren durch Beseitigung fester Materie verbessert werden.

Die verwendeten Stuhlproben waren diejenigen, die in der oben genannten PCT Veröffentlichung WO 02/12879 A2 beschrieben sind, i. e. Stuhlproben von Personen, die für Kolonoskopie oder Operation vorgesehen waren. Sogenannte „Normal-Proben" schließen diejenigen von Personen mit einem Zustand des Darms ein, der nicht krebsartig ist. Beispiele sind Divertikulose, hyperplastische Polypen und innere Hämorrhoiden.

Speziell wurde eine homogenisierte Rohstuhlprobe einer –70° C Tiefkühltruhe entnommen und für ungefähr 14–15 Minuten in eine Sterilbank („biohood") (bei Raumtemperatur) gestellt. Während dieser Zeit taute die Probe nicht vollständig auf, aber wurde etwas weicher und ein kleines Stück konnte leicht abgeschnipselt werden. Ungefähr 2 g der Probe wurden unter Verwendung eines Spatels entnommen und in ein kleines Glasgefäß gebracht. Nach vollständigem Auftauen wurden 6 ml PBS/D₂O Puffer zum Gefäß hinzugegeben, wodurch ein Verhältnis von Puffer zu Stuhl von ungefähr 3:1 entstand. Die Suspension wurde dann (unter Verwendung von Vortex-2 Genie) für 2 Minuten bei einer Geschwindigkeit von 5 gemischt (gevortext). Die Suspension wurde in mehrere 1,5 ml Zentrifugenröhrchen gegossen und für 3 Minuten in einer Labortischzentrifuge (Biofuge Pico) bei 3200 UpM zentrifugiert. Der Überstand wurde sorgfältig abgenommen und in 3–4 Kryogefäßen gesammelt und in einer –70°C Tiefkühltruhe eingefroren.

Nach einem Gefrierzeitraum von wenigstens 12 Stunden wurden die Gefäße herausgenommen und in eine Sterilbank gestellt. Nachdem eine Probe vollständig aufgetaut war, wurden 600 &mgr;l entnommen und in ein 5 mm NMR Röhrchen überführt (das bereits 50 &mgr;l TSP/D₂O enthielt). Das TSP wurde als eine chemische Verschiebungsbezugsgröße (0 ppm) und zum Abgleich der Spektren während der Datenvorverarbeitung verwendet.

Alle Proben wurden mit einem Avance 360 Spektrometer (Bruker Instruments) ohne Drehen ausgeführt. Ein Standard wurde jeden Morgen vor den aktuellen Proben ausgeführt, um sicherzustellen, dass das Spektrometer richtig arbeitet. War dies geschehen, wurde die Probe in den Magneten eingeführt und die Zeit notiert. Die Temperatur wurde auf 298 K gesetzt und die Verriegelung auf das Deuteriumsignal ausgeführt (Verriegelungskraft = –20dB, Phase = 113,5, Verstärkung = 100). Manueller Ausgleich wurde ausgeführt mit dem Fokus auf Z, Z², Z³, X und Y. Der Sondenkopf wurde dann abgestimmt und angepasst. Ein neues Experiment wurde für jede Probe geschrieben und darauf wurden die Erfassungsparameter eingestellt. Wassersuppression wurde durch Verwendung der Vorsättigungsmethode („presaturation technique") ausgeführt. Die Linienbreite und O1 (Wasserfrequenz) wurden für jedes Experiment notiert.

Die Erfassungsparameter waren: Pulsprogramm Zgpr, Temperatur, TE = 298 K; Senderfrequenz, SF01 = 360,3316979 MHz, Anzahl von Scans, NS = 32; Dummy Scans, DS = 2; 90 Grad Pulsbreite, P1 = &mgr;sec; Vorsättigungsenergiegrad, PL9 = 40 dB; Zeitbereichsdatenpunkte, TD = 16K; Größe des tatsächlichen Spektrums, SI = 16K; Interscan Verzögerung, D1 = 3,0 sec; Spektralbreite, SW = 4990,02 Hz; Erfassungszeit, AQ = 1,64; Verzögerungszeit, D9 = 60 ms.

Insgesamt wurden bis heute 271 Proben (MR Spektren) vollständig analysiert unter Verwendung der dreistufigen statistischen Klassifikationsstrategie. Zweihundertfünfundvierzig von diesen (147 normal, 98 Krebs und/oder Adenome) wurden (im Trainingssatz) verwendet, um die Klassifizierer zu entwickeln. Die insgesamte Genauigkeit der Trainingsdaten (einschließlich Fuzzy Klassifikationen) war 87 %. Die insgesamte Genauigkeit des Validierungssatzes (n = 26; 11 normal und 15 Krebs/Polypen) war 88,5 %. Die Sensitivität war 93,3 % und die Spezifität war 81,8 %.

In der oben genannten dreistufigen statistischen Klassifikationsstrategie ist die erste Stufe ein Vorverarbeitungsschritt, der sich für eine zuverlässige Klassifizierung als essentiell erwiesen hat. Er besteht aus Auswählen einiger maximal diskriminatorischer Teilregionen aus den Spektren unter Verwendung eines optimalen Regionsauswahlalgorithmus (optimal region selection; ORS) basierend auf einer von einem Genetischen Algorithmus (GA) angetriebenen Optimierungsmethode (Nikulin A E, Dolenko B, Bezabeh T, Smorjai R L, NMR in Biomedicine 11, 209–217 (1998) „Near-optimal region selection for feature space reduction: Novel preprocessing methods for classifying MR Spectra". Bezabeh, T et al. The use of ¹H Magnetic Resonance Spectroscopy in Inflammatory Bowel Disease, Am. J. Gastroenterol 2001; 96:442-448 and Somorjai, R.L. et al, Distinguishing Normal from Rejecting Renal Allographs; Application of a Three-Stage Classification Strategy to MR and IR Spectra of Urine, Vibrational Spectroscopy 28 (1) 97–102 (2002)). Für die Verlässlichkeit der Klassifikation sollte die Anzahl dieser Subregionen in einer Größenordnung kleiner als die Anzahl der zu klassifizierenden Proben sein. Um zu sehr optimistische Klassifizierungsergebnisse zu vermeiden, die ein direkter Resubstitutionsansatz liefern würde, entwickelten die in der oben genannten PCT Veröffentlichung WO 02/12879 A2 genannten Erfinder eine Vergleichsprüfung unter Verwendung einer Bootstrap-Methodik.

Das Bootstrap-Verfahren teilt die Daten (mit Ersetzungen) wiederholt in ungefähr gleich große zufällige Trainings- und Testuntersätze auf. Für jeden der zufälligen Trainingsuntersätze wird ein optimaler Klassifizierer gefunden und dessen Genauigkeit anhand des zufälligen Testuntersatzes validiert. Dieser Vorgang wird eine Anzahl wiederholt (1000 Mal bei der am wenigstens kritischen ORS Präprozessierungsstufe, 5000 Mal für den endgültigen Klassifizierer). Wurden die optimalen Subregionen einmal identifiziert, findet die zweite Stufe den letzten Klassifizierer als das gewichtete Mittel der Klassifiziererkoeffizienten der 5000 individuellen Komponentenklassifizierer. Diese Herangehensweise verwendet effektiv alle n Proben. Ein standardmäßiges multivariates statistisches Verfahren, Lineare Diskriminanzanalyse (LDA) ist die Wahl für alle Klassifizierer in allen Stufen aufgrund ihrer Geschwindigkeit und Robustheit. Das Konzept der Festigkeit („crispness") eines Klassifizierers wird auch verwendet, weil die Klassifizierer Klassenwahrscheinlichkeiten produzieren. Eine 2-Klassenklassifikation einer Probe wird fest („crisp") genannt, wenn die Klassen-Zuordnungswahrscheinlichkeit für diese Probe größer als 75% ist.

Für schwierige Klassifizierungsprobleme besteht eine dritte Stufe aus dem Kombinieren der Ergebnisse mehrerer Klassifizierer über Aggregationsverfahren (computerisierte Consensus-Diagnose, CCD) in einem Gesamtklassifizierer, der mehr zuverlässig und genauer als die individuellen Klassifizierer ist. Die speziell verwendete Klassifiziereraggregation ist Wolperts Gestapelter Generalisierer (Wolpert's Stacked Generalizer; WSG). WSG verwendet die von den individuellen Klassifizierern erhaltene Ausgabe-Klassenwahrscheinlichkeiten als Eingangsmerkmale für den letzten Klassifizierer. Für 2-Klassen-Probleme ist die Zahl von Merkmalen 1 pro Klassifizierer (mit K-unabhängigen Klassifizierem ergibt dieses K Wahrscheinlichkeiten als Eingabemerkmale). Die Gesamtklassifizierungsqualität ist generell höher. Die Festigkeit der Klassifizierer ist immer größer. Dieses ist in einer klinischen Umgebung wichtig, weil weniger Patienten wiederholt untersucht werden müssen.

Die multivariate Analyse der eindimensionalen Spektren ist besonders erfolgreich für Krebsbiopsien (Somorjai, R. et al, J Mag Reson Imaging 6, 437 (1996)). Diese Spektren benötigen nur Minuten zur Aufnahme, bieten eine große Vielfalt von Datenpunkten und können automatisch analysiert werden, wenn der diagnostische Algorithmus gesichert ist.