Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Detektion von Bakterien in aus Blut abgeleiteten Proben, insbesondere in Thrombozyten-Konzentraten, mit Hilfe einer generischen Realtime-PCR. Durch die Verwendung von spezifischen Primern und Sonden lassen sich universell alle transfusionsmedizinisch relevanten Bakterien in einem Amplifikationsschritt nachweisen. Es werden eine nicht kompetitive oder eine kompetitive interne Kontroll-Nukleinsäure und mit Fluoreszenzfarbstoffen markierte Sonden verwendet. Das Verfahren ermöglicht somit eine schnelle Detektion von Bakterien in aus Blut abgeleiteten Proben, insbesondere Thrombozyten-Einzelproben und ist somit besonders zum Durchsuchen („Screening") von Blutspendern geeignet. Es werden Sensitivitäten von zwischen 2 CFU/ml und 50 CFU/ml in Abhängigkeit vom untersuchten Bakterium erreicht.

Menschliches Blut ist für die Medizin ein sehr wertvoller und bisher unverzichtbarer Rohstoff, aus dem heute eine Vielzahl von Komponenten und Produkten gewonnen bzw. hergestellt wird. Der sogenannte AIDS-Skandal Anfang der 90er Jahre hat die Virussicherheit von Blut und Blutprodukten in der Öffentlichkeit wie in Fachkreisen schlagartig in den Mittelpunkt des Interesses gerückt.

Das virologische Restrisiko ist aufgrund der verschiedenen Maßnahmen, wie Spenderselektion, ELISA-Testung und NAT-Testung, für die untersuchten transfusionsrelevanten Viren auf ein bisher nicht gekanntes, unvorstellbar geringes Maß gesunken. So ist das Restrisiko, das in Deutschland nach Einführung der PCR für die drei transfusionsrelevanten Viren HCV, HIV, HBV noch verbleibt, mit 1:5,5 Mio. für HIV, 1:4,4 Mio. für HCV und 1:620.000 Mio. für HBV (mit Pool-PCR) und 1:820.000 für HBV mit einer Einzelproben-PCR so gering geworden, dass man fast von keinem wirklichen virologischen Restrisiko mehr sprechen kann (1).

Demgegenüber steht jedoch ein bakterielles Restrisiko in Thrombozyten-Konzentraten von 1:2000 bis 1:3000 (2–4). Dadurch, dass Thrombozyten-Konzentrate bei Raumtemperatur gelagert werden, stellen sie für viele Bakterien ein ideales Nährmedium dar und sind somit besonders gefährdet. Ferner unterscheiden sich bakterielle von den viralen Kontaminationen darin, dass die Ausgangskonzentration zunächst sehr gering ist (< 10 CFU/ml). Darum benötigt man ein sehr sensitives Nachweisverfahren für die Bakteriendetektion.

Dreier et al. (J. Clin. Microbiol. 2004; 42(10):4759–4764.) offenbaren ein RT-PCR-Verfahren zum Nachweis bakterieller Kontamination in Thrombozytenkonzentraten, bei welchem Primer und Sonden verwendet werden, die spezifisch für konservierte Regionen eubakterieller 23S rRNA sind. Der PCR-Mastermix, einschließlich der Primer, wird mit 8-MOP behandelt und anschließend mit UV bestrahlt, um DNA-Kontaminationen, die z.B. in den PCR-Reagenzien vorkommen können, zu entfernen. Bei der von Dreier et al. beschriebenen Behandlung mit 8-MOP und anschließender UV-Bestrahlung handelt es sich jedoch nicht um eine schonende Behandlung, die zudem dazu führen kann, daß eine anschließende Amplifikation nicht mehr möglich ist.

Mohammadi et al. (Transfusion 2005; 45(5):731–736.) beschreiben ein real time PCR-Verfahren zum Nachweis bakterieller Kontamination in Thrombozytenkonzentraten, bei welchem ein universelles Primerset, das spezifisch für konservierte Regionen eubakterieller ribosomaler DNA, nämlich der 16S rDNA, ist, verwendet wird. Eine Vorbehandlung der Reagenzien wird nicht beschrieben.

US 6,849,430 B2 beschreibt quantitative kompetititve und nicht-kompetitive RT-PCR unter der Verwendung eines internen homologen RNA-Standards für die Überwachung von Mikroorganismen in Systemen für die biologische Behandlung von Abwasser.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, ein Verfahren zu entwickeln, das eine schnelle und vor allem auch sensitive Detektion von Bakterien in aus Blut abgeleiteten Proben, insbesondere in Thrombozyten-Konzentraten, zur Verfügung stellt.

Die Aufgabe wird erfindungsgemäß durch das zur Verfügung stellen eines Verfahrens zur Detektion von Bakterien in aus Blut abgeleiteten Proben gelöst.

Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst die folgenden Schritte:

In einem ersten Schritt (a) werden von aus Blut abgeleitete Proben zur Verfügung gestellt.

Im nächsten Schritt (b) werden, gegebenenfalls und bevorzugt, aus den Blut abgeleiteten Proben Aliquote steril entnommen. Dies wird bevorzugt unter Laminar-Flow-Bedingungen durchgeführt.

Im nächsten Schritt (c) werden, gegebenenfalls und bevorzugt, die Aliquote (aus Schritt b) zu einer Nährbouillon-Lösung zugegeben. Die Nährbouillon-Lösung umfasst Fleischpepton, Casein-Pepton, Hefeextrakt, NaCl und Glukose und hat einen pH-Wert von 6,8 bis 7,8.

Im nächsten Schritt (d) erfolgt, gegebenenfalls und bevorzugt, eine Inkubation der Nährbouillon-Lösung, mit den zugegebenen Aliquoten, bei 30 bis 40°C für mindestens 2 Stunden.

Bevorzugt ist eine Nährbouillon (Heipha Diagnostika, Heidelberg, Deutschland) (Artikel-Nummer: 303r) enthaltend:

7,8 g Fleischpepton (meat peptone),

7,8 g Caseinpepton,

2,8 g Hefeextrakt,

5,6 g NaCl,

2,0 g Glukose,

pH 7,3 ± 0,2

Angaben beziehen sich auf einen Liter.

Die Nährbouillon ist klar und gelblich gefärbt und als Traubenzucker-Bouillon erhältlich (bei Heipha Diagnostika).

Im nächsten Schritt (e) werden die aus Blut abgeleiteten Proben konzentriert.

Im nächsten Schritt (f) werden die Nukleinsäuren aus den Bakterien extrahiert unter der Verwendung eines Lyse-Puffers, der eine erste interne Kontroll-Nukleinsäure umfasst, und unter der Verwendung von erhitztem Nuklease-freiem Wasser zur Elution.

Im nächsten Schritt (g) werden die bakteriellen Nukleinsäure-Extrakte aus dem vorhergehenden Schritt (f) erhalten.

Im nächsten Schritt (h) wird ein PCR-Mastermix, ohne DNA-Polymerase, hergestellt. Der PCR-Mastermix umfasst einen Satz Oligonukleotide von je einem Sense-Primer, einem Antisense-Primer und einer Sonde, wobei der eine Satz Oligonukleotide spezifisch für bakterielle Nukleinsäuren ist. Der PCR-Mastermix umfasst noch eine weitere Sonde, die spezifisch für die interne Kontroll-Nukleinsäure ist. Die zwei Sonden, die vom PCR-Mastermix umfaßt sind, sind jeweils mit zwei Fluoreszenzfarbstoffen markiert.

Im nächsten Schritt (i) werden der PCR-Mastermix (von Schritt h) und die (in Schritt g) erhaltenen bakteriellen Nukleinsäure-Extrakte durch Zugabe von DNAse I und nachfolgende Zugabe von Proteinase K behandelt.

Im nächsten Schritt (j) wird DNA-Polymerase zum behandelten PCR-Mastermix (aus Schritt i) zugegeben.

Im nächsten Schritt (k) werden die behandelten bakteriellen Nukleinsäure-Extrakte (aus Schritt i) zum behandelten PCR-Mastermix, einschließlich DNA-Polymerase, zugegeben. Es wird Nukleinsäure-Amplifizierung und die Detektion der amplifizierten Nukleinsäuren durchgeführt.

Das Verfahren zur Detektion von Bakterien in aus Blut abgeleiteten Proben der vorliegenden Erfindung umfasst die folgenden Schritte:

• a) zur Verfügung stellen von aus Blut abgeleiteten Proben,
• e) Konzentrieren der aus Blut abgeleiteten Proben,
• f) Extraktion der Nukleinsäuren aus den Bakterien unter der Verwendung eines Lyse-Puffers, der eine interne Kontroll-Nukleinsäure umfaßt, und unter der Verwendung von erhitztem Nuklease-freiem Wasser zur Elution,
• g) Erhalten der bakteriellen Nukleinsäure-Extrakte aus Schritt f),
• h) Herstellen eines PCR-Mastermixes ohne DNA-Polymerase, umfassend einen Satz Oligonukleotide von je einem Sense-Primer, einem Antisense-Primer und einer Sonde, wobei der eine Satz Oligonukleotide spezifisch für bakterielle Nukleinsäuren ist, und weiter umfassend eine weitere Sonde, die spezifisch für die interne Kontroll-Nukleinsäure ist, und wobei die zwei Sonden jeweils mit zwei Fluoreszenzfarbstoffen markiert sind,
• i) Behandlung des PCR-Mastermixes von Schritt h) und der in Schritt g) erhaltenen bakteriellen Nukleinsäure-Extrakte durch Zugabe von DNAse I und nachfolgende Zugabe von Proteinase K,
• j) Zugabe von DNA-Polymerase zum behandelten PCR-Mastermix aus Schritt i),
• k) Zugabe der behandelten bakteriellen Nukleinsäure-Extrakte aus Schritt i) zum behandelten PCR-Mastermix, einschließlich DNA-Polymerase, und Durchführen der Nukleinsäure-Amplifizierung, und
• l) Detektion der amplifizierten bakteriellen Nukleinsäuren.

Das Verfahren zur Detektion von Bakterien in aus Blut abgeleiteten Proben der vorliegenden E umfasst bevorzugt weiterhin die folgenden Schritte:

• b) sterile Entnahme von Aliquoten der aus Blut abgeleiteten Proben unter Laminar-Flow-Bedingungen,
• c) Zugabe der Aliquote aus b) zu einer Nährbouillon-Lösung, umfassend Fleischpepton, Casein-Pepton, Hefeextrakt, NaCl und Glukose, mit einem pH-Wert von 6,8 bis 7,8,
• d) Inkubation bei 30 bis 40°C für mindestens 2 Stunden.

Erfindungsgemäß handelt es sich bei den aus Blut abgeleiteten Proben um Blutproben oder um Bestandteile des Blutes enthaltende Proben, insbesondere handelt es sich um Vollblut, Plasma, Serum oder zelluläre Blutbestandteile enthaltende Proben. Die zellulare Blutbestandteile enthaltenden Proben sind dabei ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Thrombozyten enthaltende Proben, Thrombozyten-Konzentrate, Einzelproben aus Pool-Thrombozyten-Konzentraten oder Thrombozyten-Apherese-Konzentrate.

Das Verfahren eignet sich sowohl zum Screening von Einzelproben aus Pool-Thrombozyten-Konzentraten als auch aus Apherese-Konzentraten. Von jeder für das Screening vorgesehenen Probe werden bevorzugt mindestens 3000 &mgr;l (3 ml) Probe, wie Thrombozyten-Konzentrat-Probe, benötigt.

Erfindungsgemäß umfasst eine interne Kontroll-Nukleinsäure mindestens eine Region, an die eine Sonde hybridisieren bzw. sich spezifisch anlagern kann. Erfindungsgemäß umfasst eine interne Kontroll-Nukleinsäure außerdem Regionen, an denen sich Primer, wie Sense-Primer und Antisense-Primer, spezifisch anlagern können, so dass die interne Kontroll-Nukleinsäure amplifiziert werden kann.

Erfindungsgemäß ist die mindestens eine Region der internen Kontroll-Nukleinsäure, an die eine Sonde hybridisieren bzw. sich spezifisch anlagern kann, unterschiedlich zu Sequenzen des Zieltargets, der Nukleinsäuren der Bakterien, die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren nachgewiesen werden sollen. Das heißt eine Sonde, die spezifisch für die bakteriellen Nukleinsäuren ist, wird nicht an die interne Kontroll-Nukleinsäure hybridisieren bzw. sich spezifisch anlagern. Daher wird im erfindungsgemäßen Verfahren eine weitere Sonde verwendet, deren Sequenz von der internen Kontroll-Nukleinsäure abgeleitet wurde. Bevorzugt hat die weitere Sonde die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO. 8.

Es wird bevorzugt, dass die interne Kontroll-Nukleinsäure eine kompetitive oder eine nicht kompetititve Nukleotidsequenz ist bzw. eine Nukleinsäure ist, die eine kompetitive oder eine nicht kompetititve Nukleotidsequenz umfasst.

Erfindungsgemäß zeichnet sich eine kompetitive Nukleotidsequenz bzw. Nukleinsäure dadurch aus, dass sich die Regionen, an denen sich Primer spezifisch für eine Amplifikation anlagern können, nicht unterscheiden von den respektiven Regionen der Nukleinsäuren der Bakterien, die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren nachgewiesen werden sollen. Das heißt dieselben Primer, wie Sense-Primer und Antisense-Primer, führen zur Amplifikation der nachzuweisenden bakteriellen Nukleinsäuren und zur Amplifikation der internen kompetitiven Kontroll-Nukleinsäure.

Dahingegen sind die Regionen einer nicht kompetitiven Nukleotidsequenz bzw. Nukleinsäure, an denen sich Primer spezifisch für eine Amplifikation anlagern können, verschieden zu den respektiven Regionen der bakteriellen Nukleinsäuren. Das heißt die Primer, wie Sense-Primer und Antisense-Primer, die zur Amplifikation der nachzuweisenden bakteriellen Nukleinsäuren führen, amplifizieren nicht zugleich die interne nicht kompetitive Kontroll-Nukleinsäure.

Weiter bevorzugt handelt es sich bei einer internen Kontroll-Nukleinsäure um eine Nukleotidsequenz, deren Zuckerbestandteil Ribose ist. Weiter bevorzugt handelt es sich bei einer internen Kontroll-Nukleinsäure um eine Nukleotidsequenz aus RNA, oder modifizierten Nukleotiden, aber auch um RNA-Konstrukte, insbesondere synthetisierte RNA-Konstrukte. Eine interne Kontroll-Nukleinsäure kann auch eine Nukleotidsequenz aus DNA sein.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist die interne Kontroll-Nukleinsäure eine nicht kompetitive Nukleotidsequenz und hat die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO. 1 oder ein Komplementär davon.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die interne Kontroll-Nukleinsäure eine kompetitive Nukleotidsequenz und hat die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO. 2 oder ein Komplementär davon.

Unter einer Multiplex-PCR versteht man die Amplifikation von mindestens zwei Nukleinsäuresequenzen in einem Amplifikationsschritt. In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden alle bekannten Bakterien universell durch eine geeignete Wahl der Primer- und Sonden-Sequenzen amplifiziert, sofern sie (die Bakterien) in der Untersuchungsprobe vorhanden sind. Ferner wird die zugegebene interne Kontroll-Nukleinsäure amplifiziert und überwacht damit die Amplifikation, vor allem in negativen Untersuchungsproben, in denen keine Amplifikation bakterieller Nukleinsäuren stattfindet.

Das erfindungsgemäße Verfahren verwendet einen PCR-Mastermix, umfassend einen Satz Oligonukleotide von je einem Sense-Primer, einem Antisense-Primer und einer Sonde und umfassend eine weitere Sonde.

Methoden für die Präparation und Verwendung von Sonden und Primern werden zum Beispiel beschrieben in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Aufl., Vol. 1–3, Hrsg. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989; Current Protocols in Molecular Biology, Hrsg. Ausubel et al., Greene Publishing and Wiley Interscience, New York, 1987 (mit periodischen Aktualisierungen) und Innis et al., PCR-Protokolle. A Guide to Methods and Applications, Academic Press: San Diego, 1990. PCR-Primer-Paare können von einer bekannten Sequenz zum Beispiel unter der Verwendung von Computerprogrammen, welche für diesen Zweck entwickelt wurden, wie zum Beispiel PRIMER3 (http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi) abgeleitet werden.

Der eine erfindungsgemäße Satz Oligonukleotide aus je einem Sense-Primer, einem Antisense-Primer und einer Sonde ist spezifisch für bakterielle Nukleinsäuren. Die Sequenzen des Sense-Primers, des Antisense-Primers und der Sonde werden bevorzugt abgeleitet von der 16S RNA-Region von Bakterien. Dabei wurden die in den Gendatenbanken veröffentlichen Nukleotidsequenzen der Bakterien zugrundegelegt. Bevorzugt entsprechen die Sequenzen der Primer einem Teilbereich der 16S rRNA, der in allen bekannten Bakterien sehr konserviert ist.

In einer bevorzugten Ausführungsform hat der 1. Sense-Primer die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO. 3 oder ein Komplementär davon, der 1. Antisense-Primer die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO. 4 oder ein Komplementär davon und die Sonde 1 die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO. 5 oder ein Komplementär davon.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform, wenn eine nicht kompetitive Kontroll-Nukleinsäure verwendet wird, umfaßt der PCR-Mastermix einen weiteren Satz Oligonukleotide, der aus einem weiteren Sense-Primer, einem weiteren Antisense-Primer und der weiteren Sonde besteht, die jeweils spezifisch für die interne (nicht kompetitive) Kontroll-Nukleinsäure sind. Die Sequenzen des Sense-Primers, des Antisense-Primers und der Sonde werden bevorzugt abgeleitet von der Sequenz der internen (nicht kompetitiven) Kontroll-Nukleinsäure, wie SEQ ID NO. 1.

In einer bevorzugten Ausführungsform hat der weitere Sense-Primer die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO. 6 oder ein Komplementär davon, der weitere Antisense-Primer die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO. 6 oder ein Komplementär davon und die weitere Sonde die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO. 8 oder ein Komplementär davon.

Bei der internen (nicht kompetitiven) Kontroll-Nukleinsäure mit SEQ ID NO. 1 handelt es sich um ein synthetisiertes RNA-Konstrukt, welches als Target für die Primer mit den SEQ ID NOs. 6 und 7 sowie für die zugehörige Sonde mit SEQ ID NO. 8 dient.

Die weitere Sonde mit SEQ ID NO. 8 erkennt sowohl die interne Kontroll-Nukleinsäure mit SEQ ID NO. 1 als auch die interne Kontroll-Nukleinsäure mit SEQ ID NO. 2.

Die erfindungsgemäß jeweils verwendeten Sense-Primer, Antisense-Primer, Sonden und internen Kontroll-Nukleinsäuren, wie SEQ ID NOs. 1 bis 8, sind bevorzugt Nukleinsäuren, deren Zucker eine Ribose ist, insbesondere handelt es sich um RNA.

Die Sonden, die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, sind mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert, insbesondere solche, die für Realtime-PCR geeignet sind. Dabei handelt es sich bevorzugt um einen Fluoreszenzdonor oder -reporter und einen Fluoreszenzakzeptor oder -quencher sind. Eine Sonde ist bevorzugterweise mit einem Paar aus jeweils einem Fluoreszenzdonor oder -reporter und einem Fluoreszenzakzeptor oder -quencher markiert.

Erfindungsgemäß geeignete Fluoreszenzdonoren oder -reporter sind ausgewählt aus der Gruppe bestehend, aus FAM, VIC, Joe, und Hex oder vergleichbaren Fluoreszenzdonoren/-reportern. Erfindungsgemäß geeignete Fluoreszenzakzeptoren oder -quencher sind ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus TAMRA, BodyPi 564/570, Cy5, Black Hole Quencher 2, Black Hole Quencher 3 oder vergleichbaren Fluoreszenzakzeptoren/-quenchern.

In einer besonderen Ausführungsform ist eine Sonde mit FAM und TAMRA markiert und die andere Sonde ist mit VIC und TAMRA markiert. Weiter bevorzugt ist die Sonde, die für die bakteriellen Nukleinsäuren spezifisch ist, mit FAM/TAMRA markiert, und die weitere Sonde, die für die interne Kontroll-Nukleinsäure spezifisch ist, mit VIC/TAMRA (5).

Bevorzugterweise umfasst das Konzentrieren der Proben in Schritt e) des erfindungsgemäßen Verfahrens Zentrifugieren. Dabei werden bevorzugterweise, die in der Probe enthaltenen Bestandteile, wie Thrombozyten und Bakterien, angereichert. In einer bevorzugten Ausführungsform werden mit Barcode etikettierte Gefäße, die die Proben enthalten, 15 Minuten bei mind. 5000 × g zentrifugiert. Anschließend wird der Überstand verworfen.

Erfindungsgemäß werden der PCR-Mastermix vor Zugabe der DNA-Polymerase (aus Schritt h) und die bakteriellen Nukleinsäure-Extrakte (aus Schritt g) vor der Nukleinsäure-Amplififizierung behandelt. Durch diese Behandlung wird die Sensitivität des erfindungsgemäßen Verfahrens bei der Detektion von bakteriellen Nukleinsäuren in der nachfolgenden Realtime-PCR signifikant erhöht. Die erreichte Sensitivität ist abhängig vom untersuchten Bakterium und schwankt zwischen 2 CFU/ml und 50 CFU/ml.

Im Gegensatz dazu erreichen bisherige Verfahren eine Sensitivität von 1000 CFU/ml (wie Scansystem^TM, Hemosystem, Marseille, Frankreich).

Diese Behandlung (in Schritt i) des erfindungsgemäßen Verfahrens) umfasst zum einen die Zugabe von DNAse I und eine Inkubation bei 30 bis 40°C, weiter bevorzugt bei 37°C, und ein anschließendes Erhitzen auf über 90°C bis 110°C, weiter bevorzugt auf 95°C. Die Inkubation bei 30 bis 40°C, weiter bevorzugt bei 37°C, erfolgt bevorzugt über einen Zeitraum von mindestens 60 min, weiter bevorzugt 30–120 min, noch weiter bevorzugt 60 min. Das Erhitzen auf über 90°C, weiter bevorzugt auf 95°C, wird über einen Zeitraum von 5–30 min, weiter bevorzugt 10 min, durchgeführt.

Diese Behandlung (in Schritt i) des erfindungsgemäßen Verfahrens) umfasst weiterhin die nachfolgende Zugabe von Proteinase K und eine Inkubation bei 50 bis 60°C, weiter bevorzugt bei 56°C, und anschließendes Erhitzen auf über 90°C bis 110°C, weiter bevorzugt auf 95°C. Die Inkubation bei 50 bis 60°C, weiter bevorzugt bei 56°C, erfolgt bevorzugt über einen Zeitraum von mindestens 10 min, weiter bevorzugt 5–30 min, noch weiter bevorzugt 10 min. Das Erhitzen auf über 90°C, weiter bevorzugt auf 95°C, wird über einen Zeitraum von 5–30 min, weiter bevorzugt 10 min, durchgeführt.

In Schritt j) wird die DNA-Polymerase zum behandelten PCR-Mastermix zugegeben. Geeignete RNA-Polymerasen und DNA-Polymerasen sind dem Fachmann bekannt. Besonders geeignet sind Taq-Polymerase, Superscript III, Tth, Superscript I.

Die Nukleinsäure-Amplifizierung in Schritt k) ist bevorzugt eine Multiplex-PCR, weiter bevorzugt eine Multiplex-Realtime-PCR. Bevorzugt erfolgt zunächst eine reverse Transkription, bei der die vorhandene bakterielle RNA und die interne Kontroll-RNA in eine cDNA umgeschrieben wird. Im weiteren erfolgt dann die Amplifikation der cDNA durch eine DNA-Polymerase.

Die Detektion der amplifizierten bakteriellen Nukleinsäuren erfolgt mittels des Realtime-Prinzips. Bindet/hybridisiert dabei eine Sonde an ihrer Zielsequenz, wird der Reporter der Sonde durch die Exonukleasefunktion der DNA-Polymerase, wie Taq-Polymerase, im Verlauf der Amplifikation abgespalten. Der Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET) vom Reporter zum Quencher kann somit aufgrund der räumlichen Distanz nicht mehr erfolgen. Die emittierte Energie des Reporters wird als positives Signal aufgezeichnet. Da der Reporter der für die bakteriellen Nukleinsäuren spezifischen Sonde (z.B. FAM-markierte Sonde) Fluoreszenz in einem anderen Wellenbereich emittiert als der Reporter der weiteren Sonde, die für die interne Kontroll-Nukleinsäure spezifisch ist (z.B. VIC-markierte Sonde), können beide Amplifikationen voneinander unterschieden werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt es, alle transfusionsrelevanten Bakterien (z. B. Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Escherichia coli, Bacillus cereus und Klebsiella pneumoniae) zu detektieren.

In einer bevorzugten Ausführungsform amplifizieren die verwendeten Primer und Sonden in einem sehr konservierten Bereich der bakteriellen 16S mRNA. Von daher ist eine universelle Amplifikation in allen Bakterien möglich. Gezeigt werden konnte dies bisher für folgende Bakterien:

• – Staphylococcus chonii
• – Streptococcus saccharolyticus
• – Bacillus suppecies
• – Micrococcus luteus
• – Propionibakterium acnes
• – Klebsiella pneumoniae
• – Escherichia coli
• – Staphylococcus aureus
• – Staphylococcus epidermidis

Weiter bevorzugt kann die Anwesenheit dieser Bakterien, insbesondere Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Escherichia coli, Bacillus cereus und Klebsiella pneumoniae, gleichzeitig detektiert werden, d.h. die Bakterien bzw. deren bakterielle Nukleinsäuren werden in nur einem Verfahren, das einen Amplifikationsschritt (Schritt k) umfasst, nachgewiesen.

Es werden dabei Sensitivitäten von zwischen 2 CFU/ml und 50 CFU/ml in Abhängigkeit vom untersuchten Bakterium erreicht.

Durch die Verwendung von unterschiedlichen Sonden in der erfindungsgemäßen Kombination von einer spezifischen Sonde für die Bakterien und einer Sonde für die interne Kontroll-Nukleinsäure (mit VIC als Reporter und TAMRA als Quencher) ist eine generische Amplifikation von transfusionsmedizinisch relevanten Bakterien (wie zum Beispiel S. aureus, S. epidermidis, K. pneumoniae, B. Cereus) möglich. Somit ist das erfindungsgemäße Verfahren für das Screening von Thrombozytenproben von Einzelproben geeignet.

Der Vorteil einer gemeinsamen Amplifikation in einem Reaktionsansatz liegt im geringeren Materialverbrauch an Reagenzien (Enzymen, Primer) sowie in einer Reduzierung der Amplifikationsgeräte (Thermocycler). Die Anwendung des erfindungsgemäßen Primerdesigns ermöglicht die parallele Amplifikation von Bakterien und einer internen Kontroll-Nukleinsäure, ohne dass die Amplifikationseffizienz bei Bakterien relevant reduziert wird.

Durch die spezielle Vorbehandlung des PCR-Mastermixes sowie der bakteriellen Nukleinsäure-Extrakte kann eine unspezifische Amplifikation bei den Negativkontrollen sowie bei den Wasserkontrollen vermieden werden. Eine Reduzierung der Amplifikationseffizienz würde deutlich werden in einer Verschiebung des CT-Wertes (Cycle Treshold-Wert = der Amplifikationscyclus, in dem das spezifische Fluoreszenzsignal gegenüber dem Hintergrund detektiert wird). Eine Verschiebung des CT-Wertes bei den Positivkontrollen tritt nicht auf. Durch die spezielle Behandlung wurde die Sensitivität des Bakterien-Realtime-PCR signifikant erhöht.

Die vorliegende Erfindung wird in den folgenden Figuren und Beispielen illustriert. Durch die beschriebenen Beispiele/Figuren wird gezeigt, dass die erfindungsgemäßen Primer/Sonden-Kombinationen der Bakterien-Multiplex-PCR zuverlässig alle untersuchten transfusionsmedizinisch relevanten Bakterien nachweist. Ferner ist die Durchführung der beschriebenen Kombination aus spezifischen Primern, Sonden und interner Kontrolle zum Screening von Thrombozyteneinzelproben geeignet. Die Sensitivität ist abhängig vom untersuchten Bakterium und schwankt zwischen 2 CFU/ml und 50 CFU/ml.

Untersucht wurde das Bakterium Staphylococcus aureus (PEI-23-03). Proben mit einer Bakterienkonzentration von 10⁴ CFU/ml und 10⁵ CFU/ml zeigen einen stärkeren Signalanstieg als Proben mit einer geringeren Bakterienkonzentration. Aufgrund dessen, dass auch negative Kontrollproben einen Signalanstieg zeigen, liegt die Nachweisgrenze für diese PCR bei > 1000 CFU/ml.

Untersucht wurde das Bakterium Klebsiella pneumoniae (PEI-08-07).

A

ohne DNAse I-Behandlung.

B

mit DNAse I-Behandlung und nachfolgender Proteinase K-Behandlung.

Durch die Behandlung mit DNAse I und Proteinase K kommt es zu einer Reduktion des unspezifischen Signals bei den Negativkontrollproben sowie bei den Wasserkontrollenproben (NTC = No Template Control), ohne dass dadurch der CT-Wert der Positivproben verschoben wird.

Untersucht wurden 4 transfusionsrelevante Bakterien: Staphylococcus aureus (S. aureus), Escherichia coli (E. coli), Bacillus cereus (B. cereus) und Klebsiella pneumoniae (K. pneumoniae). Die Thrombozytenkonzentrate wurden mit zwei unterschiedlichen Bakterienkonzentrationen gespikt, 10 CFU/ml (A und B) und 10 CFU/Beutel (C und D).

Folgende Enzyme wurden verwendet: Produkt RNasin DNAse 1 Proteinase K Superscript III Lieferant Promega Roche Fermentas Invitrogen Katalognr. Lieferant N2515 776785/001 EO049 18080-085 Inhaltsstoffe Ribonuklease-Inhibitor DNAse I Proteinase K M-MLV RT mit RNase H Aktivität Konzentration 40 IU/&mgr;l 10000 U/ml 600u/ml 200 IU/&mgr;l (10U/&mgr;l) (20mg/ml)

Folgendes Oligonukleotid wurde als interne Kontroll-Nukleinsäure verwendet und zu dem Lyse-Puffer vor der Extraktion addiert wird („gespikt"). Dabei handelt es sich bevorzugt um ein RNA-Konstrukt, das als nicht kompetitive Kontrolle fungiert. Produkt Interne Kontrolle Hersteller BSD BaWüHe Stocklösung Lotnr. Bak-IC Inhaltsstoffe Oligonukleotid (RNA) Sequenz 5'-GGG AGA AAC CCA CUG CUU AAG CCU CAA UAA AGC UUG CCU UGA GCU AGA CUC CCU AGC AAU CAA UGC AUU UCU CUA GCA GUG GCG CCC GAA CAG GGA CCU GAA AAA AAA AAA AAA = SEQ ID NO. 1 AAA AAA AAA AAA AA-3' Konz. Stammlösung 3,84 × 10¹² Kopien/&mgr;l Konz. Aliquot Soll Ct 24 ± 4 Ct Konz. pro PCR-Ansatz ca. 150 Kopien/PCR

Folgendes Oligonukleotid kann als interne Kontroll-Nukleinsäure verwendet und zu dem Lyse-Puffer vor der Extraktion addiert werden („gespikt"). Dabei handelt es sich um ein RNA-Konstrukt, das als kompetitive Kontrolle fungiert. Produkt Interne Kontrolle Hersteller BSD BaWüHe Stocklösung Lotnr. Inhaltsstoffe Oligonukleotid (RNA) Sequenz 5'-GGG AGA AAC CCA CUG CUU AAC UCA AAG GAA UUG ACG GG GCU AGA CUC CCU AGC AAU CAA UGC AUU UCU GUC GUC AGC UCG UGU CGU GGA CCU GAA AAA AAA AAA AAA AAA = SEQ ID NO. 2 AAA AAA AAA AA-3' Konz. Stammlösung 3,84 × 10¹² Kopien/&mgr;l Konz. Aliquot Soll Ct 24 ± 4 Ct Konz. pro PCR-Ansatz ca. 150 Kopien/PCR

Folgende Primer und Sonden wurden für eine Multiplex-PCR verwendet, bei welcher eine nicht kompetitive interne Kontroll-Nukleinsäure (SEQ ID NO. 1) verwendet wurde. Bei den Primern und Sonden handelt es sich bevorzugt um RNA (Nukleotid T entspricht dann U). Produkt 1. Sense

Primer 1. Antisense

Primer Sonde 1 2. Sense

Primer IC 2. Anti-Sense

Primer IC Sonde 2

IC Kennzeichnung BAC 1 BAC 2 BAC 3 IC 1 IC 2 IC 3 Lieferant variabel Variabel variabel variabel variabel ABI Katalognr. online online online online online online Bestellung Bestellung Bestellung Bestellung Bestellung Bestellung Inhaltsstoffe Oligo Oligo Oligo Oligo Oligo Oligo nukleotid nukleotid nukleotid nukleotid nukleotid nukleotid Sequenz 5' AAC 5' ACG 5' CAC 5' AAG 5' GTT 5' CTA TCA ACA AAG CCT CGG GAC AAG CGA CGG CAA GCG TCC GAA GCT TGG TAA CCA CTA TTG GAC AGC AGC CTG GCA ACG GAC 3' ATG TTG CTA G 3' ATC GG 3' TGG T 3' CCT AAT TGA 3' GCA TT 3' SEQ ID NO. 3 4 5 6 7 8 Fluoreszenzfarbstoffe n. a. n. a. 5'FAM

3'TAMRA n. a. n. a. 5'VIC

3'TAMRA Aufreinigung HPLC HPLC HPLC HPLC HPLC HPLC

Der 1. Sense-Primer, der 1. Antisense-Primer und Sonde 1 bilden einen Satz Oligonukleotide. Der weitere (2.) Sense-Primer, der weitere (2.) Antisense-Primer und die weitere Sonde (2) bilden einen weiteren Satz Oligonukleotide, der spezifisch für die interne Kontroll-Nukleinsäure ist und deren Sequenzen von der internen Kontroll-Nukleinsäure abgeleitet wurden.

Folgende bakterielle Positivkontrolle wurde verwendet: Produkt Positivkontrollen (100 CFU/ml) Hersteller BSD BaWüHe Inhaltsstoffe K. pneumoniae (PEI-08-07) Plasmakonservennr. 020150871 Konz der Plasmakonserve 2,77 × 10⁸ CFU/ml Kalibriert PEI Standard

Dazu wird ein kommerzieller Extraktionskit verwendet, bevorzugt ein Qiagen Viral Extraktions Kit [Qiagen 52904 Qiamp Viral RNA mini Kit (5)]. Es wird nach dem folgenden modifizierten Protokoll verfahren:

Alle Extraktionsreagenzien werden entsprechend der Herstellerangaben (Qiagen) vorbereitet. Aliquote des Nuklease-freien Wassers werden bei 2–8°C aufbewahrt und nur einmal verwendet. Alle anderen Reagenzien werden bei Raumtemperatur gelagert. Der Puffer AVL (Bestandteil des Qiagen-Kits) wird bei 2–8°C im Kühlschrank aufbewahrt. Vor Verwendung müssen durch Erwärmen auf 80°C für maximal 5 Minuten die präzipitierten Salze gelöst werden.

Die interne Kontroll-Nukleinsäure überwacht die Effizienz der Extraktion und vor allem der späteren Amplifikation. Die Zugabe der internen Kontroll-Nukleinsäure (IC) muss mit gestopften Pipettenspitzen durchgeführt werden. Es wurde die interne Kontroll-Nukleinsäure SEQ ID NO. 1 verwendet.

• • Zu dem Zellpellet werden 400&mgr;l mit IC gespiktes AVL pipettiert, es wird gut gevortext, in der Minifuge wird kurz herunter zentrifugiert und 10 min. bei RT stehen gelassen.
• • 400&mgr;l Ethanol werden zur Probe pipettiert, es wird gut ge-vortext und herunter zentrifugiert (Minifuge).
• • Die Hälfte der Lösung wird mit einer Einmaltransferpipette auf die Säule gegeben, 1 min. bei 8000 U/min (6082 × g) zentrifugiert, Collection Tube wird verworfen und Säule in ein neues Collection Tube gegeben.
• • Die zweite Hälfte der Lösung wird mit einer Einmaltransferpipette auf die Säule gegeben, 1 min. bei 8000 U/min (6082 × g) zentrifugiert, Collection Tube wird verworfen und Säule in ein neues Collection Tube gegeben.
• • 500&mgr;l AW 1 (Waschlösung Kit Bestandteil des Qiamp Viral RNA min Kit) wird auf die Säule pipettiert, 1 min. bei 8000 U/min zentrifugiert, Collection Tube wird verwerfen und Säule in ein neues Collection Tube gegeben.
• • 500&mgr;l AW 2 (Waschlösung Kit Bestandteil des Qiamp Viral RNA min Kit) wird auf die Säule pipettiert, 1 min. bei 8000 U/min zentrifugiert, Collection Tube wird verworfen und Säule in ein neues Collection Tube gegeben.
• • Es wird 2 min. bei 13.000 U/min (16.060 × g) zentrifugiert und Collection Tube wird verworfen.
• • Säulen werden auf vorbereitete etikettierte RNase-freie Reaktionsgefäße gesetzt.
• • Es wird 40&mgr;l 80°C heißes Nuklease-freies Wasser auf die Säule pipettiert, 1 min. bei 8000 U/min zentrifugiert – nicht mehr als 6–8 Proben auf einmal
• • Säule wird verworfen, Eluat = bakterielles Nukleinsäure-Extrakt

Die Extrakte werden bis zur Weiterverarbeitung maximal 1 Stunde bei Kühlschranktemperatur aufbewahrt. Bei längerfristiger Aufbewahrung sind die Extrakte bei –20°C zu lagern.

Dabei wird wie folgt vorgegangen:

• 1. Herstellen des Mastermixes (Zusammensetzung, siehe Tabelle 1) ohne die DNA-Polymerase (z.B. Taq)
• 2. Zugabe von 1&mgr;l DNAse I zu dem Mastermix sowie zu den bakteriellen Nukleinsäure-Eluaten der Proben
• 3. Inkubation bei 37°C für 60 min, anschließend Erhitzen auf 95°C für 10 min
• 4. Zugabe von Proteinase K (1&mgr;l [20mg/ml]), Inkubation bei 56°C 10 min, anschließend Erhitzen auf 95°C für 10 min

Die Einheiten „mM" und „&mgr;M" stehen im Folgenden für die Einheiten mmol/l bzw. mmol/l. Tabelle 1 Zusammensetzung des PCR-Mastermixes Material 1facher Mix

[&mgr;l] 60facher Mix

[&mgr;l] MgCl₂

(3mM) 7,67 460,2 TB-Puffer 5 300 U-Mix

(200&mgr;M) 4 240 1. Sense-Primer

(10&mgr;M)

SEQ ID NO. 3 3 180 1. Antisense-Primer

(10&mgr;M)

SEQ ID NO. 4 3 180 Sonde 1

(10&mgr;M)

SEQ ID NO. 5 0,5 30 2. Sense-Primer

(10&mgr;M)

SEQ ID NO. 6 3 180 2. Antisense-Primer (10&mgr;M)

SEQ ID NO. 7 3 180 Sonde 2

(10&mgr;M)

SEQ ID NO. 8 0,5 30 Taq-Polymerase

(1U/&mgr;l) 0,15 9 Rnase out (RNasin)

(40 IU/&mgr;l) 0,15 9 RT SS III

(200 IU/&mgr;l) 0,03 1,8 Gesamtvolumen 30 1800

Wählen Sie auf dem ABI PRISM^® 7000 SDS den unter File befindlichen Menüpunkt New an und stellen Sie für das neue Dokument die folgenden Grundeinstellungen ein: Assay: Absolute Quantitation; Container: 96-Well Clear; Template: Blank Document. Bestätigen Sie Ihre Eingaben (OK).

Es ist sinnvoll alle Einstellungen der Programmierung eines Bak-PCR-Laufs in Form eines Templates (SDS Template [*.sdf]) zu speichern, das dann jederzeit zur Verfügung steht.

Im Hauptmenü unter dem Punkt Tools-Detector Manger wählen Sie unter der Option File-New an und nehmen folgende Einstellungen vor: Nachweis Reporter Quencher Bakterien-RNA FAM TAMRA Interne Kontrolle (Bak-IC) VIC TAMRA

Durch Bestätigung der Eingaben mit OK kehren Sie zum Detector Mangager zurück. Markieren Sie die erstellten Detektoren und diese durch Anklicken der Option Add to Plate Document zum Well Inspector. Mit Done schließen Sie das Fenster.

Die unter View befindliche Option Well Inspector wird geöffnet. Markieren Sie die zum Bak Nachweis belegten Plattenpositionen und ordnen Sie diesen Positionen die ausgewählten Detektoren zu, indem Sie die Use-Option beider Detektoren aktivieren. Unter Sample Name können Sie die Probenbezeichnung eingeben. Wählen Sie dann für jeden Probentyp die Funktion (Task) fest: Probentyp Funktion (Task) Konzentration Reporter Quencher (Quantity) Probe Unknown – FAM TAMRA Negativkontrolle NTC – FAM TAMRA

Alternativ können Sie ein extern erstelltes Sample Setup mit allen Informationen zu Detektoren und Probenbezeichnung importieren indem Sie im Menü File-Import-Sample Setup die entsprechende Excel-Datei anwählen. Zur genauen Struktur dieser Liste lesen Sie bitte im ABI-7000 User Guide nach.

Außerdem muß darauf geachtet werden, dass als passive Referenz der Farbstoff ROX im Well Inspector eingestellt ist.

In der SDS-Software erfolgt die Programmierung der Thermocyclerbedingungen auf der Instrument-Ebene. Folgendes Temperaturprofil ist für die DRK Bak PCR zu verwenden:

Es muss darauf geachtet werden, dass der Emulation Mode aktiviert ist und ein Reaktionsvolumen von 50&mgr;l eingestellt wurde.

An dieser Stelle können Sie die eingegebenen Einstellungen (Setup) als Maske abspeichern, um sie für spätere Anwendungen in veränderter oder unveränderter Form erneut zu nutzen. Durch das Abspeichern der Einstellungen als SDS Template (*.sdt) in dem Ordner Template Directory (Lokales Laufwerk [C:]\Program Files\ABI PRISM 7000\Templates, angelegt von Applied Biosystems) ist diese Datei aus der Template Drop-down-Liste in dem New Document-Fenster direkt anwählbar. In anderen Ordnern gesicherte Vorlagen müssen über Browse geöffnet werden. Vor dem Starten des PCR-Laufs achten Sie bitte darauf, diesen erneut als SDS Document (*.sds) abzuspeichern. Damit stellen Sie die Speicherung der sich im Verlauf der PCR gesammelten Daten sicher.

Starten Sie den PCR-Lauf durch Anwählen der Option Start unter dem Menüpunkt Instrument oder des Feldes Start auf der Instrument-Ebene.

Eine vorliegende, gültige Kalbrierung der Farbstoffe (Pure Spectra Component File) und des Hintergrundes (Background Component File) ist bei Inbetriebnahme der Geräte unbedingt erforderlich. Diese Kalibrierungsdateien werden wie folgt zur exakten Berechnung der Ergebnisse benötigt:

Sämtliche die Messung beeinflussenden gerätebedingten Störsignale werden von der Sequence Detection Software der ABI PRISM^® Sequence Detection Systems mit Hilfe des Background Component Files eliminiert.

Zudem treten bei Multicolor-Analysen Interferenzen zwischen den Emissionssprektren der einzelnen Fluoreszenzfarbstoffe auf. Die Software der ABI PRISM^® SDS kompensiert diese Interferenzen durch Verrechnung mit den im Pure Spectra Component File gespeicherten Spektraldaten der einzelnen Farbstoffe. Die Zuordnung der im Verlauf der PCR über das gesamte messbare Spektrum gesammelten Fluoreszenzdaten zu den programmierten Detektoren nimmt die Software ebenfalls mit Hilfe der Pure Spectra Components vor. Anschließend werden die ermittelten Fluoreszenzdaten der einzelnen Farbstoffe zur Verrechnung von tube-to-tube Variationen (Fluoreszenzunterschiede zwischen verschiedenen PCR-Ansätzen) durch das Signal der passiven Referenz (ROX) geteilt. Die auf diese Weise normalisierten Signale können mit Hilfe des Amplification Plots ausgewertet werden.

Die bei der Auswertung eines PCR-Laufs genutzten Kalibrierungsdateien werden beim Abspeichern automatisch mitgesichert. Sollten keine Kalibrierungsdateien installiert sein, erstellen Sie diese Dateien bitte unter Beachtung der Anleitung im ABI PRISM^® SDS User Guide/Manual.

Untersucht wurde das Bakterium Staphylococcus aureus (PEI-23-03). Es erfolgte die in Beispielen 1 und 3 beschriebene Extraktion und Amplifikation, ohne dass der Master-Mix, wie in Beispiel 2 beschrieben, mit DNAse I und Proteinase K vorbehandelt wurde.

Der Amplifikationsblot (1) zeigt einen spezifischen Signalanstieg für alle Proben. Proben mit einer Bakterienkonzentration von 10⁴ CFU/ml und 10⁵ CFU/ml zeigen einen stärkeren Signalanstieg als Proben mit einer geringeren Bakterienkonzentration. Aufgrund dessen, dass auch negative Kontrollproben einen Signalanstieg zeigen, liegt die Nachweisgrenze für diese PCR bei > 1000 CFU/ml.

Untersucht wurde das Bakterium Klebsiella pneumoniae (PEI-08-07). Es erfolgte die in Beispielen 1 und 3 beschriebene Extraktion und Amplifikation. Vor der Durchführung der PCR wurden jedoch sowohl der Master-Mix als auch die extrahierten Eluate der Untersuchungsproben (= bakterielle Nukleinsäure-Extrakte), die Negativkontrollen und auch das Untersuchungswasser, wie in Beispiel 2 beschrieben, mit DNAse I und anschließend mit Proteinase K behandelt.

In diesem Experiment zeigt sich (siehe 2), dass es durch die Behandlung mit DNAse I und Protinase K zu einer Reduktion des unspezifischen Signals bei den Negativkontrollproben sowie bei den Wasserkontrollenproben kommt, ohne dass dadurch der CT-Wert (Cycle-Treshhold Wert) der Positivproben verschoben wird.

Es wird eine Verdünnungsstufe des Bakteriums Klebsiella pneumoniae (PEI-08-07) von 2 × 10⁶ CFU/ml bis 2 × 10⁰ CFU/ml pipettiert und anschließend extrahiert, behandelt und amplifiziert, wie in den Beispielen 1 bis 3 beschrieben.

Ergebnis: Mit Hilfe der erfindungsgemäßen Realtime-Bakterien-Multiplex-PCR lässt sich noch bei 2 CFU/ml eine spezifische Amplifikation des untersuchten Bakteriums nachweisen und von den Negativkontrollen und den Wasserkontrollen unterscheiden.

Untersucht wurde in einer abschließenden Vergleichsstudie die vorliegende Bakterien-PCR mit zwei weiteren bakteriellen Nachweisverfahren, und zwar der FACS-Methode und Scansystem^TM [Hemosystem, Marseille, Frankreich]. Untersucht wurden 4 transfusionsrelevante Bakterien, und zwar

• – Staphylococcus aureus (S. aureus)
• – Escherichia coli (E. coli)
• – Bacillus cereus (B. cereus) und
• – Klebsiella pneumoniae (K. pneumoniae)

Die Thrombozytenkonzentrate wurden mit zwei unterschiedlichen Bakterienkonzentrationen gespikt (10 CFU/ml und 10 CFU/Beutel). Jeder Versuch wurde in 10 Replikaten getestet. Bei den Beuteln handelt es sich um Beutel von Terumo Corporation, 051005S2, steriler Lagerungsbeutel für Thrombozyten.

Die 3A–D zeigen unabhängig vom Bakterium bezogen auf die untersuchten Nachweismethoden die höchste Sensitivität für die Realtime-Bakterien-Multiplex-PCR.

• 1. Offergeld R, Ritter S, Faensen D, Hamouda O. [Infection epidemiological data among blond donors in Germany 2003–2004. Report of the Robert Koch Institute in accordance with Article 22 of the Transfusion Act]. Bundesgesundheitsblatt Gesundheitsforschung Gesundheitsschutz 2005; 48(11):1273–87.
• 2. Schmidt M HM, Heck J, Weis C, Montag T, Nicol SB, Seifried E. Scansystem^TM Enables Rapid and Sensitive Bacterial Detection in Platelets Stored in Additive Solution with Implementation of Standard Positive Control Capsules. Transfus Med Hemother 2006.
• 3. Schmidt M HM, Wahl A, Nicol SB, Montag T, Roth WK, Seifried E. Fluorescence quencher improves Scansystem for rapid bacterial detection. Vox Sang 2006.
• 4. Schmidt M, Weis C, Heck J, et al. Optimized Scansystem platelet kit for bacterial detection with enhanced sensitivity: detection within 24 h after spiking. Vox Sang 2005; 89(3):135–9.
• 5. Schmidt M, Hourfar MK, Nicol SB, Wahl A, Heck J, Weis C, Tonn T, Spengler HP, Montag T, Seifried E and Roth WK. A comparison of three rapid bacterial detection methods under simulated real-life conditions. Transfusion 2006, accepted.
• 6. McDonald C, Pearce S, Wilkins K, Colvin J, Robbins S, Colley L, Taylor J and Barbara J. Pall eBDS: an enhanced bacterial detection system for screening platelet concentrates. Transfusion Medicine 2005; 15: 259–268.