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Dokumentenidentifikation DE10065666B4 02.10.2008
Titel DNA-Chip zur kausalen Diagnose von Bluthochdruck
Anmelder Wiesner, Rudolf, Prof. Dr., 50931 Köln, DE
Erfinder Wiesner, Rudolf, Prof. Dr., 50931 Köln, DE
Vertreter Dehmel & Bettenhausen Patent- und Rechtsanwälte, 80331 München
DE-Anmeldedatum 29.12.2000
DE-Aktenzeichen 10065666
Offenlegungstag 11.07.2002
Veröffentlichungstag der Patenterteilung 02.10.2008
Veröffentlichungstag im Patentblatt 02.10.2008
IPC-Hauptklasse C12Q 1/68(2006.01)A, F, I, 20051017, B, H, DE

Beschreibung[de]

Die vorliegende Erfindung betrifft einen DNA-Chip zur kausalen Diagnose des Bluthochdrucks (Hypertonus), der eine frühe Diagnose und eine hochwirksame, auf den jeweiligen Patienten massgeschneiderte und möglichst nebenwirkungsfreie Therapie ermöglicht. Die vorliegende Erfindung betrifft ferner einen DNA-Chip zur Entwicklung neuer blutdrucksenkender Pharmaka und zur Stratifizierung von Patienten in frühen Phasen der klinischen Prüfung solcher neuen Pharmaka.

Etwa 15 Millionen Menschen leiden in Deutschland an Bluthochdruck, davon etwa 5 Millionen unerkannt (Deutsche Bluthochdruckliga, 2000). Bluthochdruck stellt mit seinen Folgeerkrankungen (Arteriosklerose, Herzinfakt, Schlaganfall, Herzhypertrophie und Herzinsuffizenz) die weitaus häufigste Ursache für Krankheit und Tod in allen westlichen Industrienationen dar, noch vor malignen Entartungen (Krebs). Bluthochdruck beruht auf einer übermässigen Engstellung der Blutgefässe oder auf einer unzureichenden Flüssigkeitsausscheidung durch die Niere. An der Regulation des Muskeltonus der glatten Muskulatur in den Blutgefässen und damit der Gefässweite als auch an der Flüssigkeitsausscheidung durch die Niere sind eine Vielzahl von zentralnervösen Mechanismen und Hormonsystemen beteiligt. Diese steuern und regeln den Blutdruck, der physiologischerweise bei körperlicher Arbeit, Angst, Stress, Erregung etc. ansteigt. Eine Entgleisung eines oder mehrerer dieser Systeme führt letztendlich zum Bluthochdruck. In neun von zehn Fällen sind die eigentlichen Ursachen des Bluthochdrucks nicht bekannt (essentielle Hypertonie). Eine genetische Vorbelastung (Prädisposition) durch Mutation von Genen, die für Proteine kodieren, die in blutdruckregulierende Signalkaskaden involviert sind, manchmal erst in Kombination mit äußeren Faktoren (Stress, Rauchen, Übergewicht, mangelnde körperliche Bewegung, Fehlernährung), ist jedoch höchst wahrscheinlich.

Hypertonus kann zur Zeit nur rein symptomatisch diagnostiziert werden, routinemässig durch einfache Messung nach Riva-Rocci (Arm-Manschette, Stethoskop) oder in der Intensiv-Medizin blutig-invasiv über arterielle Katheter. Das heisst, dass bei Diagnose-Stellung die Krankheit und evtl. auch negative Folgeerscheinungen bereits manifestiert sind. Die Diagnose ist bei Grenzwert-Hypertonie auch nicht unproblematisch, da schon physiologischerweise grosse Schwankungen im Blutdruck zu beobachten sind (z. B. Tagesrythmik) und ausserdem viele Einflüsse den Blutdruck variieren können (z. B. Angst vor der Untersuchung; vor der Diagnose; „Weisskitteleffekt"). Eine Früherkennung, also eine Möglicheit den Beginn der Erkrankung noch vor einer signifikanten Blutdrucksteigerung zu diagnostizieren, gibt es nicht. Auch ist es bei einer solchen Volkskrankheit mit einer so grossen Zahl von Betroffenen vollkommen unbefriedigend, nur eine einzige physikalische Methode der Diagnose zu haben, d. h. auf pathologische, klinisch-chemische oder andersgeartete apparative Möglichkeiten ganz verzichten zu müssen. Auch kann essentieller Bluthochdruck nur rein symptomatisch durch Ausprobieren verschiedener blutdrucksenkender Wirkstoffe als Monotherapie oder in Kombinationstherapie behandelt werden ("einstellen"), da die primäre, kausale Ursache jeweils nicht bekannt ist. Ein grosser Teil der Patienten bleibt aber therapieresistent, und auch bei erfolgreich behandelten Patienten verschlechtern sich die Befunde oft wieder mit zunehmendem Alter. Es ist daher einmal dringend erforderlich, eine Früherkennungsmethode zu etablieren, die bereits einen entstehenden Hypertonus erkennt, noch bevor der physikalisch messbare Blutdruck signifikant erhöht ist, um rechtzeitig anatomische Veränderungen der Blutgefässe; die dann irreversibel sind, und weitere Folgeschäden zu verhindern.

Im Stand der Technik ist bereits bekannt, dass Mikroarrays zur Untersuchung der Beteiligung von Genen bei der rheumatoiden Arthritis verwendet werden können; Heller et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 94, 2150–2155, 1997. Für diesen Zweck wurden Sonden für die Nukleinsäure der induzierbaren NO-Synthase (INOS) und des Interleukin-6 (Il-6) auf einem Mikroarray aufgebracht. Dabei sind INOS und Il-6 jeweils in dem gleichen blutdruckregulierenden System, nämlich im Ca2 +-Haushalt, involviert.

Die DNA-Chip-Technologie ist ein sehr effizientes Verfahren, unter anderem zum Nachweis von DNA-Polymorphismen. Diesen Nachweis mit Hilfe der DNA-Chip-Technologie nutzt ein bereits bestehendes Verfahren zur kausalen Diagnose von Bluthockdruck, d. h. es werden Unterschiede in der DNA-Sequenz von, Genen zwischen verschiedenen. Individuen, die für Proteine kodieren, die für blutdruckregulierende Mechanismen verantwortlich sind, nachgewiesen: Dieses Verfahren hat jedoch den Nachteil, dass nur wenige Arten der essentiellen Hypertonie monogenetisch sind, die meisten Fälle werden auf eine Kombination von Mutationen zurückzuführen sein, von denen jede einzelne nur wenig prädiktiven Wert hat. Ein weiterer Nachteil ist, dass sich aus ethischen Gründen die DNA-Analyse im Hinblick auf die Prädisposition für eine schwere Erkrankung wie Bluthochdruck nicht durchsetzen lassen wird Dennoch ist es dringend wünschenswert, bei jedem Patienten abzuklären, welcher der vielen möglichen, blutdruckregulierenden Mechanismen gestört und damit für seinen individuellen Hochdruck verantwortlich ist. Erst die kausale Diagnose der Ursachen, die zum Bluthochdruck eines jeden einzelnen Patienten führen, also des Hormonsystems oder zentralnervösen Mechanismus, die im individuellen Fall entgleist sind, wird eine maßgeschneiderte, auf den jeweiligen Patienten hin orientierte Therapie ermöglichen. Auch unerwünschte Nebenwirkungen einer ungeeigneten Medikation können so weitestgehend vermieden werden. Damit würden die Heilungserfolge dieser größten Volkskrankheit erheblich verbessert und somit Morbidität und Mortalität erheblich gesenkt werden.

Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, Mittel zur kausalen Diagnose von Bluthochdruck zur Verfügung zu stellen. Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung eines Verfahrens zur Früherkennung von Bluthochdruck.

Die Aufgaben werden durch den in den Patentansprüchen definierten Gegenstand gelöst.

Der hier verwendete Ausdruck "Subklasse" bezeichnet eine Gruppe von Patienten mit Bluthochdruck, wobei die kausale Ursache des Bluthochdrucks auf eine Störung desselben blutdruckregulierenden Systems zurückzuführen ist. Die Patienten einer Subklasse reagieren daher auf ein blutdrucksenkendes Medikament gleich.

Der hier verwendete Ausdruck "blutdruckregulierende Systeme" bezeichnet zentralnervöse Mechanismen oder hormonelle Systeme, die an der Regulation des Kontraktionszustands der glatten Muskulatur der Blutgefässe (Gefässweite) oder an der Resorptionsleistung des Nierenepithels beteiligt sind. Gestörte blutdruckregulierende Systeme sind solche, die für einen Bluthochdruck kausal verantwortlich sind.

Der hier verwendete Ausdruck "Bluthochdruck" bezeichnet jede Art der Hypertonie der Stadien I, II, III und IV. Altersabhängig liegt üblicherweise bereits eine Hypertonie bei einem systolischen Wert über 140 mm Hg und einem diastolischen Wert von 90 bis 94 mm Hg vor. Eine Hypertonie liegt üblicherweise auch bei alleiniger Erhöhung des diastolischen Werts vor, wobei folgende Einteilungen vorgenommen werden können: milde Hypertonie bei 95 bis 104 mm Hg, mittelschwere Hypertonie bei 105 bis 114 mm Hg, Schwere Hypertonie bei über 115 mm Hg.

Das An- und Abschalten von Genen ist Grundlage aller biologischen Prozesse und ausserdem eine extrem sensitive Antwort auf veränderte äussere Bedingungen. DNA-Chips werden daher die Biomedizin und Molekularbiologie in den nächsten Jahren revolutionieren. Mit der Extraktion der RNA aus einer biologischen Probe, dem Einwirken von markierter cDNA auf einen DNA-Chip (Hybridisierung) und seine Analyse ist innerhalb kürzester Zeit eine grosse Fülle von Informationen über das Genexpressionsprofil und damit über den Zustand der Zellen in der biologischen Probe unter veränderten Bedingungen möglich. Die auf der Hybridisierung von Nukleinsäuren basierende Technologie hat den Vorteil einer extrem hohen Spezifität, Sensitivität und relativ leichten Durchführbarkeit, im Gegensatz z. B. zur Analyse von Proteinmustern.

Geschieht das An- und Abschalten von Genen in Blutgefässen oder Nierentubuluszellen in nichtphysiologischer Weise, so kann es die Ursache des Bluthochdrucks sein oder kann als messbares Zeichen für die jeweils gestörten blutdruckregulierenden Mechanismen verwertet werden. Hintergrund dafür ist, dass alle intrazellulären Signalkaskaden, die an der Regulation des Gefässtonus oder des Nierenepithel-Transports beteiligt sind, entweder direkt oder indirekt auch Transkriptionsfaktoren und damit die Aktivität von Genen beeinflussen. Ist die Expression eines oder mehrerer Gene codierend für Proteine, die an diesen blutdruckregulierenden Systemen beteiligt sind, gestört, oder tragen diese Gene Mutationen, die die Funktion der entsprechenden Proteine beeinträchtigen, so wirkt sich dies auf den Blutdruck aus.

Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung besteht daher in der Bereitstellung eines DNA-Chips zur kausalen Diagnose des Bluthochdrucks, umfassend mindestens zwei verschiedene Nukleinsäuren, codierend für je ein Polypeptid, wobei die Polypeptide in verschiedenen blutdruckregulierenden Systemen involviert sind, und die Nukleinsäuren als Indikator für mindestens zwei gestörte blutdruckregulierende Systeme dienen, und gegebenenfalls ferner umfassend eine oder mehrere Nukleinsäuren, codierend für Polypeptide, die in jeder Zelle exprimiert werden und zur Grundausstattung einer Zelle gehören, (sogenannte Housekeeping-Gene) zur Normierung der erhaltenen Signale. Bevorzugt ist ein DNA-Chip, wobei ein, zwei, drei, vier, fünf, sechs oder mehr Nukleinsäuren mindestens zweier blutdruckregulierender Systeme enthalten sind. Ferner bevorzugt ist ein DNA-Chip mit mindestens je einer Nukleinsäure, codierend für je ein Polypeptid, von drei, vier, fünf, sechs, sieben, acht, neun, zehn, elf, zwölf, dreizehn, vierzehn, fünfzehn, sechzehn oder siebzehn blutdruckregulierender Systeme.

Die auf dem DNA-Chip verwendeten Nukleinsäuren codieren für Peptide, die an biochemischen Prozessen beteiligt sind, die insbesondere in einem oder mehreren der folgenden blutdruckregulierenden Systemen involviert sind:

  • • Das sympathisch-adrenerge Nervensystem und das adrenerge System des Nebennierenmarks
  • • Das parasympathische Nervensystem
  • • Das Renin-Angiotensin-System
  • • Das Aldosteron-System
  • • Das Hypophysen-Adiuretin (Vasopressin)-System
  • • Das Atriale-Natriuretische-Peptid-System
  • • Das renale Kallikrein-Kinin-System
  • • Das NO (Stickoxid)-System
  • • Das EDHF-System (endothelial derived hyperpolarization factor)
  • • Das Prostaglandin-System
  • • Das Endothelin-System
  • • Das PTHrP-System (parathormon related peptide)
  • • Das Histamin-System
  • • Das Serotonin-System
  • • Das Purinerge System
  • • lokale Wachstumsfaktoren und/oder
  • • Der Calcium-Haushalt der glatten Gefässmuskelzelle oder des Herzens

Die auf dem DNA-Chip verwendete Nukleinsäure kann jede Nukleinsäure sein, von der bekannt ist, dass sie für ein Peptid codiert, das in blutdruckregulierende Systeme involviert ist oder das bei Bluthochdruck vermehrt oder vermindert exprimiert ist. Für den erfindungsgemäßen DNA-Chip werden insbesondere Nukleinsäuren verwendet, die aus den folgenden Nukleinsäuren ausgewählt sind: glattmuskuläres &agr;-Actin, kardiales &agr;-Actin, skeletales &agr;-Actin, adrenerger Rezeptor &bgr;1, adrenerger Rezeptor &bgr;2, &bgr;-adrenerge Rezeptorkinase II, Adrenomedullin, Aldosteron-Synthase, Ang II-Rezeptor Typ I (AT 1), Angiotensin converting enzyme (ACE), Arginin Vasopressin (AVP), Arginin Vasopressin Rezeptor (VI), Atrialer Natriuretischer Faktor, Brain Natriuretic Peptide, Ca2 +-sarkoplasmatische Retikulum ATPase (SERCA), Calcium-Release Channel (Ryanodinrezeptor II), Collagen Typ I, Collagen Typ III, Collagen Typ IV, Collagen Typ V, Connexin 43 (Cx 43), Cytochrom P 450 CYP11-B2, Desmin, Endothelin I (ET-I), Endothelin III (ET III), Endothelin Rezeptor (ETA), Endothelin Rezeptor (ETB), lösliches E-Selectin, Fibroblast growth factor (FGF-II), Fibronectin, &agr;-Untereinheit des inhibitorischen G-Proteins (GI-&agr;), G-Protein-gekoppelte Rezeptorkinase II (GRK 2), &agr;1-Untereinheit der löslichen Guanylatcyclase, &bgr;1–Untereinheit der löslichen Guanylatcyclase, Heat Shock Protein 70 (hsp 70), Induzierbare NO-Synthase (INOS), Insulin Like Gowth Factor 1 (IGF1), Insulin Like Gowth Factor 1 Rezeptor, Interleukin 6, Interzelluläres Adhäsionsmolekül (ICAM-I), Kardiothrophin 1 (CT 1), Laminin, Medium-Chain Acyl-Coenzym A Dehydrogenase (MCAD), Membrancarrier für Elektrolyte, Membrancarrier für Aminosäuren, Membrancarrier für Harnstoff, Mitochondriale DNA, Monozyten Chemoattractant Protein I (MCP I), Schwere &agr;-Kette von Myosin, Schwere &bgr;-Kette von Myosin, Myosin-leichte Kette 2, Natrium-Kalium (Na+/K+) ATPase Isoformen I, II und III, Natrium-Protonenaustauscher (NHE-I), Nerve growth factor (NGF), NO-Synthase (Typ II), NO-Synthase Endotheliale (ENOS), Ornithindecarboxylase (ODC), Osteopontin, PAI-I, Parathormonähnliches Protein (PTH related Protein), Phosphodiesterase V, Phospholamban, Platelet derived growth factor PDGF-A receptor, Platelet derived growth factor PDGF-A, Platelet derived growth factor PDGF-B receptor, Platelet derived growth factor PDGF-B, Endothelin I, Procollagen &agr;-1 (I), Procollagen &agr;-1 (III), Procollagen &agr;-2 (IV), Prostacyclin Synthetase (PGI-II Synthetase), S-100 b-Protein, Superoxid-Dismutase, Thrombospondin, Tissue plasminogen activator (tPA), Transforming growth factor &bgr;, Tropoelastin, &agr;-skeletales Tropomyosin, kardiales Troponin I, skeletales Troponin I, Vascular Natriuretic Peptide, Vasculäres Zelladhäsionsmolekül (VCAM-I), Vascular endothelial growth factor/permeability factor (VEGF), und Voltage-Gated-K+ Channel (KV1.2, KV1.5, KV&bgr;1, KV&bgr;2, KV&bgr;3).

Besonders bevorzugt ist ein erfindungsgemäßer DNA-Chip mit den nachstehend aufgeführten Nukleinsäuren, wobei die Nukleinsäuren Polypeptide codieren, die in den jeweils genannten blutdruckregulierenden Systemen involviert sind: Aldosteron-Synthase und Cytochrom P 450 CYP11-B2, involviert im Aldosteron-System, Ang II-Rezeptor Typ I (AT 1), Angiotensin converting enzyme (ACE), Interzelluläres Adhäsionsmolekül (ICAM-I), Vasculäres Zelladhäsionsmolekül (VCAM-I), Vascular endothelial growth factor/permeability factor (VEGF), Monozyten Chemoattractant Protein I (MCP I), PAI-I, Transforming. growth factor &bgr; und Fibroblast growth factor (FGF-II), involviert im Renin-Angiotensin-System, adrenerger Rezeptor &bgr;1, adrenerger Rezeptor &bgr;2, &bgr;-adrenerge Rezeptorkinase II und G-Protein-gekoppelte Rezeptorkipase II (GRK 2), involviert im Sympathisch/adrenerges System, und Induzierbare NO-Synthase (INOS), Interleukin 6 und Monozyten Chemoattractant Protein I (MCP-I), involviert im Ca2+-Haushalt.

Im Sinne der vorliegenden Erfindung bedeutet "in blutdruckregulierenden Systemen involvierte Proteine" einerseits, dass die Polypeptide an biochemischen Prozessen in Blutgefässen, im Herzmuskel oder im Nierentubulusepithel beteiligt sind, die bei einer Fehlfunktion zu einem Bluthochdruck führen. Andererseits sind damit auch solche Proteine gemeint, deren Expression aufgrund eines Bluthochdrucks herunter- oder hochreguliert wird (surrogat marker- knapp formuliert – Glückwunsch!). Daher können in Gewebeproben von Bluthochdruckpatienten (z. B. weisse Blutzellen, blutgefässreiches Gewebe, Herzmuskelgewebe, Nierengewebe) auch Gene in ihrer Expression verändert sein, deren Produkte den Bluthochdruck nicht kausal hervorrufen. Solche Gene können ebenfalls indikativ für die blutdruckregulatorischen Systeme sein, die im jeweiligen Patienten gestört sind.

Die gegebenenfalls zur Normierung der Signale auf dem erfindungsgemäßen DNA-Chip verwendeten Nukleinsäuren können solche sein, von denen bekannt ist, daß sie in jeder Zelle exprimiert werden und zur Grundausstattung der Zellen gehören. Üblicherweise werde die Gene, die für diese Nukleinsäuren kodieren, auch als Housekeeping-Gene bezeichnet. Eine beispielhafte Auswahl für solche Nukleinsäuren ist nachfolgend wiedergegeben: zelluläres &bgr;-Actin, Cyclophilin, Glycerinaldehydphosphatdehydrogenase (GAPDH), Glycero-3-phosphatdehydrogenase (GPDH), Histone, Phospholipase, Ribosomale Proteine, Tubulin, Ubiquitin.

Die Nukleinsäuresequenzen der auf dem DNA-Chip verwendeten Nukleinsäuren können aus den allgemein zugänglichen Datenbanken (z. B. GeneBank, EMBL) entnommen und nach den üblichen Kriterien ausgesucht werden. Bevorzugt sind dabei solche Sequenzen, die einmalig (unique) sind, keine GC-reichen Regionen aufweisen, keine intramolekulare Hybridisierung erlauben und keine Loops bilden. Vorzugsweise wird eine einzelsträngige Nukleinsäure auf den erfindungsgemäßen DNA-Chip aufgebracht. Dabei kann sowohl der Sense- als auch der Antisense-Strang verwendet werden. Es kann aber auch eine doppelsträngige Nukleinsäure auf den erfindungsgemäßen DNA-Chip aufgebracht werden. Die Länge der Nukleinsäuren ist dabei nach oben oder unten nicht begrenzt, solange die Länge für eine spezifische Hybridisierung ausreicht. Die Nukleinsäuren können ferner DNA-, RNA- oder Hybrid-Moleküle sein. Die Herstellung solcher Nukleinsäuren ist Stand der Technik und es können als Oligonukleotide, PCR-Produkte, klonierte DNA- oder cDNA-Fragmente oder cRNAs nach in-vitro Transkription (natürlich oder modifiziert) mit Standard-Techniken auf einen Träger aufgebracht und immobilisiert werden. Bei einzelsträngigen Nukleinsäuren wird vorzugsweise die zur cDNA komplementäre Sequenz (bei Verwendung von cDNA aus der biologischen Probe) oder die zur RNA komplementäre Sequenz (bei Verwendung von RNA aus der biologischen Probe) aufgetragen.

Der Träger, auf den die Nukleinsäuren aufgetragen. werden, kann jeder Träger sein, der üblicherweise für DNA-Arrays oder DNA-Chips verwendet wird. Die Verfahren zum Auftragen und Immobilisieren der Nukleinsäuren sind ebenfalls Stand der Technik und dem Fachmann bekannt.

Der erfindungsgemäße DNA-Chip kann z. B. zur sensitiven Früherkennung eines sich entwickelnden Hypertonus verwendet werden, noch bevor sich klinisch ein Bluthochdruck manifestiert. Der DNA-Chip kann ferner zur Einteilung der Patienten in Subgruppen verwendet werden. Anhand der auf dem DNA-Chip vorhandenen Gene lassen sich die blutdruckregulatorischen Systeme nachweisen, die bei den jeweiligen Bluthochdruckpatienten gestört sind. Die Patienten-Subgruppen können dann mit individuell geeigneten Wirkstoffen oder Wirkstoffkombinationen therapiert werden, die nicht nur das Symptom Bluthochdrucks beseitigt, sondern auch der kausalen Verursachung des Bluthochdrucks entgegenwirkt. Ferner kann der erfindungsgemäße DNA-Chip zur Entwicklung neuer blutdrucksenkender Pharmaka oder zur Stratifizierung von Patienten in frühen Phasen der klinischen Prüfung solcher neuen Pharmaka eingesetzt werden. Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft daher die Verwendung des erfindungsgemäßen DNA-Chips zur Diagnose von Bluthochdruck, auch zur Frühdiagnose, zur Einteilung von Bluthochdruckpatienten in Subgruppen mit unterschiedlichen Bluthochdruckauslösenden Ursachen und zur Überwachung der Therapie von Bluthochdruck.

Dazu wird den zu untersuchenden Patienten Blut oder Gewebeproben entnommen. Aus diesen Patienten-Proben kann RNA mit Standardtechniken isoliert und entweder als qGesamt-RNA oder nach Fraktionierung als PolyA+-RNA weiterverwendet werden. Die RNA kann mit Hilfe von reverser Transkriptase in cDNA umgeschrieben und dabei mit einer Markierung, z. B. mit einer fluoreszierenden Gruppe oder einem Isotop etc., versehen werden. Ferner kann die RNA direkt markiert oder unmarkiert zur Hybridisierung auf dem DNA-Chip eingesetzt werden. Nach Hybridisierung der Probe-Nukleinsäuren mit den Ziel-Nukleinsäuren auf dem Träger, nachfolgenden Waschschritten etc, wird die Bindung von Proben-Nukleinsäuren mit den auf dem Träger befindlichen Ziel-Nukleinsäuren analysiert. Dies kann durch optische Verfahren im Falle einer Fluoreszenzmarkierung, durch Autoradiographie oder durch jedes andere Verfahren erfolgen, das in der Lage ist, eine erfolgreiche Hybridisierung von Proben-Nukleinsäuren mit Ziel-Nukleinsäuren zu erkennen.

Das den Patienten entnommene Gewebe kann als Biopsie, z. B. aus dem blutgemssreichen Mund-Nasenbereich oder aus jedem anderen blutgefässreichen, aber relativ risikoarm zu entnehmenden Gewebe, oder aus dem Herzmuskel, z. B. im Rahmen einer Herz-Katheterisierung zur Bestimmung der Kontraktilität und Herzleistung, entnommen werden. Ferner können dem Patienten Lymphozyten (weisse Blutzellen) aus dem Blut entnommen werden.

Erfindungsgemäß lassen sich die Patienten anhand ihres Genexpressionsprofils (Genaktivität: ON-OFF; hoch-niedrig) in Subgruppen einteilen, d. h. in Subgruppen in denen ein oder mehrere der vorstehend beschriebenen hormonellen oder zentralnervösen Signalwege (blutdruckregulierenden Systeme) gestört sind.

Beispielsweise sind in Bluthochdrück-Patienten mit Hyperaldosteronismus (Aldosteron-System) die Gene für Aldosteron-Synthase und für Cytochrom P 450 CYP11-B2 in weissen Blutzellen aktiviert. Diese Patienten sollten mit einem Aldosteron-Antagonisten, z. B. mit Spirolacton, behandelt werden.

Beispielsweise sind in Bluthochdruck-Patienten mit erhöhtem zirkulierenden Angiotensin II (erhöhte Plasma-Renin-Aktivität; Renin-Angiotensin-System) einerseits die Expression des Angiotensin II Rezeptors (Typ 1, AT1) in weissen Blutzellen, andererseits die Expression des Angiotensin Converting Enzyme, des Interzellulären Adhäsionsmolekül (ICAM-I), des Vaskulären Adhäsionsmoleküls (VCAM-I), des Vascular endothelial growth factor/permeability factor (VEGF), des Monozyten Chemoattractant Proteins (MCP I), des PAI-1, des Transforming growth factor &bgr; und des Fibroblast growth factor (FGF-II) in Blutgefässen oder die Expression des Brain Natriuretic Peptide (BNP) im Herzmuskel erhöht. Diese Patienten sollten mit einem Angiotensin II – Rezeptor-Antagonisten, z. B. mit Irbesartan, oder einem angiotensin converting enzyme (ACE)-Hemmer, z. B. mit Enalapril oder Captopril, behandelt werden.

Beispielsweise sind in Bluthochdruck-Patienten mit stimuliertem sympathisch-adrenergen System (sympathisch-adrenerges Nervensystem und das adrenerge System des Nebennierenmarks) einerseits die Expression der G-Protein-gekoppelten Rezeptorkinase II in weissen Blutzellen, andererseits die Expression der adrenergen Rezeptoren (&bgr;1 und &bgr;2) und der &bgr;&bgr;-adrenergen Rezeptor-Kinase in Blutgefassen oder die Expression der Omithindecarboxylase (ODC) im Herzmuskel erhöht. Diese Patienten sollten mit einem &bgr;-adrenergen Rezeptor-Blocker, z. B. mit Atenolol oder Bisoprolol, behandelt werden.

Beispielsweise sind in Bluthochdruck-Patienten mit gestörtem Ca++-Haushalt der Gefässmuskelzellen (Calcium-Haushalt der glatten Gefässmuske1ze11e oder des Herzens) die Expression von Interleukin 6 in Blutgefassen erniedrigt. Diese Patienten sollten mit einem Ca++-Kanal-Blocker, z. B. mit Verapamil, Nifedipine oder Amlodipine behandelt werden.

Beispielsweise sind in Bluthochdruck-Patienten mit gestörtem NO-System die Expression in Blutgefässen einerseits der endothelialen NO-synthase (eNOS) erniedrigt, andererseits des Angiotensin-Converting-Enzyms (ACE) oder des Kollagen Typ I erhöht. Diese Patienten sollten mit NO-Donatoren, z. B. mit Nitraten behandelt werden.

Die folgenden Figuren und Beispiele dienen nur der Erläuterung und beschränken in keiner Weise den Umfang der Erfindung.

Entnahme einer Submucosa-Biopsie aus dem Mund oder der unteren Nasenmuschel (extrem blutgefässreiches Gewebe), aus dem Herzen oder Gewinnung von weissen Blutzellen

Sowohl die Unterlippe als auch die untere Nasenmuschel sind zur Biopsieentnahme geeignet, da. sie gut zugänglich sind, zur Anästhesie das Aufsprühen eines Lokalanästhetikums ausreicht, das Gewebe sehr reich an Arteriolen und Venolen ist, aber keine größeren Gefäße oder Nerven aufweist und die Entnahmedefekte nicht sichtbar sind und schnell heilen.

1. Unterlippe

Bei 8 Patienten wurde nach Applikation von 1%igem Xylocainspray mit Epinephrinzusatz (Xylocain1%®, Astra Chemie) die Unterlippe eleviert und in Höhe der Gingiva mit einem Skalpell Größe 15 ein 2–4 mm langer oberflächlicher Schleimhautschnitt angelegt. Mit dem schneidenden Zängchen nach Grünwald (Storz) wurde durch den Schnitt submucös jeweils ein Gewebefragment von ca. 250 mg Gewicht entnommen und in flüssigem Stickstoff schockgefroren. In der Regel war eine weitere Versorgung des Entnahmedefektes nicht erforderlich, eine Reepithelisierung war nach 2 bis 3 Tagen abgeschlossen. Vereinzelt kam es perioperativ zu einer stärkeren Blutung, so daß der Defekt mit einer Einzelknopfnaht mit resorbierbarem Nahtmaterial (Vicryl 3/0, Ethicon) verschlossen wurde.

2. Untere Nasenmuschel

Bei 10 Patienten erfolgte zunächst Einsprühen der Nasenschleimhäute mit Pantocain/Privin (1/1, Pantoprivin2%®, Astra Chemie). Nach erfolgter Oberflächenanästhesie erfolgte mit dem schneidenden Zängchen nach Grünwald (Storz) jeweils die Entnahme eines ca. 250 mg messenden Gewebsfragments submucös vom lateralen Anteil des Kopfes der Concha inferior. Das Gewebe wurde sofort in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Bei stärkerer Blutung erfolgte bipolare Koagulation. Eine Gewebsnaht war nicht erforderlich. Der Defekt heilte in 3–4 Tagen ab.

3. Herzmuskelbiopsie

Bei drei Patienten wurde im Rahmen einer Links-Herz-Kathetensierung zur Diagnose der linksventrikulären Funktion eine Biopsie von ca. 500 mg aus der freien Kammerwand mit einer Stanze entnommen. Das Gewebe wurde sofort in flüssigem Stickstoff schockgefroren.

4. Weisse Blutzellen:

Bei 15 Patienten wurden 100 ml Blut entnommen und auf konventionelle Weise in Erythrozyten, Thrombozyten und Lymphozyten subfraktioniert (Lymphoprep, Nycomed, Pharma AS oder "durch Dichtegradientenzentrifugation auf einem Ficoll/Metrizoat-Gradienten"). Die Lymphozytenfraktion wurde sofort weiterverarbeitet.

5. RNA-Gewinnung:

Aus den Gewebeproben bzw. den weissen Blutzellen wurde mit verschiedenen Extraktionsverfahren mit Hilfe kommerziell erhältlicher "kits" die Gesamt-RNA gewonnen. Die Ausbeute betrug etwa 0.5 mg RNA pro g Herzmuskel; 0.1 mg RNA pro g Submukosa-Gewebe und etwa 0.1 mg RNA pro Lymphozyten-Präparation. Die RNA wurde mit konventionellen Methoden (Blots, Hybridisierung mit radioaktiv oder nicht-radioaktiv markierten Sonden) hinsichtlich der Expression der involvierten Gene untersucht.


Anspruch[de]
Verwendung einer Vorrichtung umfassend einen Träger, an den mindestens zwei verschiedene Nukleinsäuremoleküle aufgebracht sind, die eine Sequenz fähig zur spezifischen Hybridisierung mit ausgewählten Nukleinsäuremolekülen ausgewählt aus glattmuskuläres &agr;-Actin (Datenbank-Nummer: J05192); kardiales &agr;-Actin (AF053356); skeletales &agr;-Actin (AF053356); adrenerger Rezeptor ß1 (J03019); adrenerger Rezeptor &bgr;2 (M15169), &bgr;-adrenerge Rezeptorkinase II M80776); Adrenomedullin (D14874); Angiotensin II-Rezeptor Typ I (AT 1) (D13814); Angiotensin converting enzyme (ACE) (J04144); Arginin Vasopressin (AVP) (M25647); Arginin Vasopressin Rezeptor (VI)(L25615); Atrialer Natriuretischer Faktor (M30262); Brain Natriuretic Peptide (M25296); Ca2+-sarkoplasmatische Retikulum ATPase (SERCA) (M63603); Calcium-Release Channel (Ryanodinrezeptor II) (J05200); Collagen &agr;-1 (I) (AF017178); Collagen &agr;-1 (III) (M11134); Collagen &agr;-1 (IV) (NM_001845); Collagen &agr;-2 (IV) (M33653); Collagen Typ V (BC008760); Connexin 43 (Cx 43) (M65188); Cytochrom P 450 CYP11-B2 (D13752); Cytochrom P 450 CYP11-B1 (Aldosteronsynthase) (NM_000497); Desmin (U59167); Elastin (Tropoelastin) (M36860); Endothelin I (ET-I) (NM 001955); Endothelin 111 (ET III) (J05081); Endothelin Rezeptor (ETA) (L06622); Endothelin Rezeptor (ETB) (L06623); lösliches E-Selectin (D38257); Fibroblast growth factor (bFGF) (M27968); Fibronectin (X02761); G-Protein, &agr;-Untereinheit des inhibitorischen (GI-&agr;) (BC014627); G-Protein-gekoppelte Rezeptorkinase II (L16862); Guanylatcyclase, &agr;1-Untereinheit der löslichen (X66534); Guanylatcyclase, &bgr;1–Untereinheit der löslichen (X66533); Heat Shock Protein 70 (hsp 70) (L12723); Insulin Like Growth Factor 1 (IGF 1)(M29644); Insulin Like Growth Factor 1 Rezeptor (NM_000875); Interleukin 6 (M54894); Interzelluläres Adhäsionsmolekül (ICAM-I) (J03132); Kardiotrophin 1 (CT 1) (BC012939); Laminin (M20206); Medium-Chain Acyl-Coenzym A Dehydrogenase (MCAD) (M16827); Mitochondriale DNA (J01415); Monozyten Chemoattractant Protein I (MCP 1) (D29984); Natriuretic Peptide Rezeptor A (X15357); Myosin, schwere &agr;-Kette (D00943); Myosin, schwere &bgr;-Kette (NM 000257); Myosin-leichte Kette 2 (AB046614); Natrium-Kalium (Na+/K+) ATPase alpha-1 Untereinheit (U16798); Natrium-Protonenaustauscher (NHE-I) (S68616); Nerve growth factor (NGF) (M57399); NO-Synthase Endotheliale (ENOS) (M95296); NO-Synthase Induzierbare (INOS) (AF051164); Ornithindecarboxylase (ODC)(M16650); Osteopontin (J04765); Plasminogen activator inhibitor (PAI-I) (M16006); Parathormonähnliches Protein (PTH/parathyroidhormone related Protein) (M17183); Phosphodiesterase (L20965); Phospholamban (M63603); Platelet derived growth factor (PDGF-alpha) (L20965); Platelet derived growth factor (PDGF-beta) (X98706); Platelet derived growth factor PDGF-alpha receptor (NM_006206); Platelet derived growth factor PDGF-beta receptor (L20965); Prostacyclin Synthetase (PGI-II Synthetase) (D38145); S-100 beta-Protein (P04271); Superoxid-Dismutase (K00065); Thrombospondin (NM_003246); Tissue plasminogen activator (tPA) (M15518); Transforming growth factor &bgr; (M38449); Tropomyosin, &agr;-skeletales (M19713); Troponin I, kardiales (M38449); Troponin I, skeletales (J04760); Vasculäres Zelladhäsionsmolekül (VCAM-I) (X53051); Vascular endothelial growth factor/permeability factor (VEGF) (AY047581); Voltage-Gated-K+ Channel (KV 1.2) (XM_010737); Voltage-Gated-K+ Channel (KV1.5) (M83254); Voltage-Gated-K+ Channel &bgr; subunit (X83127) aufweisen zur Entwicklung neuer blutdrucksenkender Pharmaka, zur Stratifizierung von Patienten in frühen Phasen der klinischen Prüfung solcher neuen Pharmaka, zur kausalen Diagnose von Bluthochdruck, zur Frühdiagnose von Bluthochdruck, zur Einteilung von Bluthochdruckpatienten in Subgruppen mit unterschiedlichen Bluthochdruck-auslösenden Ursachen oder zur Überwachung der Therapie von Bluthochdruck, wobei die ausgewählten Nukleinsäuremoleküle Polypeptide codieren, die in verschiedenen blutdruckregulierenden Systemen involviert sind, und wobei die Nukleinsäuremoleküle als Indikator für mindestens zwei blutdruckregulierende Systeme dienen. Die Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Vorrichtung ferner eine oder mehrere Nukleinsäuren mit einer Sequenz fähig zur spezifischen Hybridisierung mit Nukleinsäuremolekülen codierend für Polypeptide umfasst, die in jeder Zelle exprimiert werden und zur Grundausstattung einer Zelle gehören. Die Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, wobei die blutdruckregulierenden Systeme ausgewählt sind aus dem sympathisch-adrenergen Nervensystem und adrenergen System des Nebennierenmarks, parasympathischem Nervensystem, Renin-Angiotensin-System, Aldosteron-System, Hypophysen-Adiuretin (Vasopressin)-System, Atrialen-Natriuretischen-Peptid-System, renalen Kallikrein-Kinin-System, NO(Stickoxid)-System, EDHF-System(endothelial derived hyperpolarization factor), Prostaglandin-System, Endothelin-System, PTHrP-System(parathormon related peptide), Histamin-System, Serotonin-System, Purinergen System, lokale Wachstumsfaktoren, und Calcium-Haushalt der glatten Gefässmuskelzelle oder des Herzens.






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