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Dokumentenidentifikation DE102004014637B4 19.02.2009
Titel Nicht-metabolisierbares Aminosäureanalogon
Anmelder Eberhard-Karls-Universität Tübingen Universitätsklinikum, 72076 Tübingen, DE
Erfinder Wieland, Hagen, 85395 Attenkirchen, DE;
Neumeister, Birgid, Dr., 72070 Tübingen, DE;
Lang, Florian, Prof. Dr., 72076 Tübingen, DE
Vertreter Witte, Weller & Partner, 70173 Stuttgart
DE-Anmeldedatum 22.03.2004
DE-Aktenzeichen 102004014637
Offenlegungstag 20.10.2005
Veröffentlichungstag der Patenterteilung 19.02.2009
Veröffentlichungstag im Patentblatt 19.02.2009
IPC-Hauptklasse C07C 229/50  (2006.01)  A,  F,  I,  20051017,  B,  H,  DE

Beschreibung[de]

Die vorliegende Erfindung betrifft ein nicht-metabolisierbares Aminosäureanalogon, dessen Verwendung zur Behandlung von Infektionen durch intrazelluläre, von der Aufnahme von Aminosäuren abhängige Krankheitserreger sowie eine pharmazeutische Zusammensetzung, die das nicht-metabolisierbare Aminosäureanalogon enthält.

Im Kontext dieser Erfindung werden unter intrazellulären Krankheitserregern sowohl bakterielle als auch nicht-bakterielle Organismen, bspw. Trypanosomen, Sporozoen, Plasmodien, Pilze und sonstige Parasiten verstanden, die in menschliche oder tierische Zellen invadieren und dort persistieren. Diese Krankheitserreger sind durch einen stark an die Wirtszelle angepassten Stoffwechsel charakterisiert. Sie sind deshalb abhängig von der Zufuhr und Aufnahme von metabolisierbaren Nährstoffen aus dem Cytoplasma, wie bspw. Aminosäuren, um überleben und sich vermehren zu können. Diese Krankheitserreger liegen in der Zelle während ihrer Vermehrungsphase häufig in Replikationsvakuolen vor.

Intrazelluläre Krankheitserreger stellen für Mensch und Tier eine zunehmende Bedrohung dar. Sie bilden die Ursache für eine Vielzahl von Krankheiten, wie Lungenentzündungen, bspw. hervorgerufen durch Legionella pneumophila, entzündliche Destruktion des Zahnhalteapparates (Paradontitis), bspw. hervorgerufen durch Porphyromonas gingivalis, Hauterkrankungen, Infertilität, etc., die insbesondere bei immungeschwächten, bspw. an AIDS erkrankten Personen, oder älteren Menschen häufig lebensbedrohliche Ausprägungen annehmen.

Bislang werden derartige Infektionen üblicherweise mit klassischen Antibiotika behandelt, z. T. im Rahmen von Intensivtherapien, also durch massive Verabreichung von einer oder mehreren derartigen Substanzen. Diese Art von Behandlung birgt eine Vielzahl von Nachteilen. So bilden sich häufig schon nach kurzer Behandlungszeit Resistenzen aus, die den Krankheitserreger unempfindlich gegenüber dem eingesetzten Antibiotikum machen. So sind bspw. bei Chlamydien erste Resistenzen gegenüber klassischen Antibiotika zu beobachten. Ferner existieren vollständig resistente Erregerstämme von Staphylococcus aureus (Wundinfektion), Enterokokken, Mycobacterium tuberculosis (Tuberkulose) und dem Malariaerreger. Diese zum Teil hoch ansteckenden Krankheiten sind deshalb mit klassischen Antibiotika praktisch nicht behandelbar und führen häufig zum Tode der betroffenen Patienten.

Klassische Antibiotika sind häufig sehr unspezifisch in ihrer Wirkung und meist nicht gegen einen bestimmten Krankheitserreger gerichtet. Damit verbunden ist häufig eine Vielzahl von Nebenwirkungen, wie bspw. die Schädigung der Magen-Darm-Flora, des Nervensystems, der Augen, des Gleichgewichtsinnes, der Leber und Nieren, das Auftreten eines anaphylaktischen Schocks, Erbrechen, Übelkeit, Allergien, Herzschäden, etc. Ein weiteres Problem klassischer Antibiotika liegt in der oft spät eintretenden Wirkung, so dass betroffene Patienten trotz einer Behandlung häufig versterben.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es deshalb, eine Substanz bereitzustellen, mittels derer Infektionen durch intrazelluläre, von der Aufnahme von Aminosäuren abhängige Krankheitserreger behandelt werden können, die jedoch nicht die Nachteile der klassischen Antibiotika aus dem Stand der Technik aufweist. Insbesondere sollen bei der Verwendung einer solchen Substanz Resistenzbildungen bei den Krankheitserregern weit gehend vermieden werden, bei systemischer oder lokaler Applikation beim Wirt bzw. behandelten Patienten möglichst geringe Nebenwirkungen auftreten und eine schnelle Wirksamkeit gewährleistet sein.

Diese Aufgabe wird durch die Bereitstellung eines nicht-metabolisierbaren Aminosäureanalogons zu vorstehend genannter Verwendung gelöst, wobei hierzu 2-Aminobicyclo[2,2,1]heptan-2-carboxylsäure (BCH) oder deren Derivate vorgesehen werden.

Unter einem nicht-metabolisierbaren Aminosäureanalogon wird erfindungsgemäß eine chemisch definierte Verbindung verstanden, die strukturelle Ähnlichkeit mit einer natürlichen Aminosäure aufweist, vom Wirtsorganismus und Krankheitserreger jedoch nicht verwertet, d. h. nicht verstoffwechselt, in der Regel hydrolysiert und so weder zur Energiegewinnung noch zur Proteinsynthese herangezogen werden kann. Im Stand der Technik sind verschiedene nicht-metabolisierbare Aminosäureanaloga bekannt, wie bspw. 2-Aminobicyclo[2,2,1]heptan-2-carboxylsäure (BCH), ein Leucin-Analogon; 2-(Methylamino)Isobutyrilsäure (MeAIB), ein Alanin-Analogon; &egr;-Amino-n-Capronsäure (EACA), ein Lysin-Analogon; Squaramat, ein Glutamat-Analogon; DL-1-Aminocyclopen-tan-trans-1,3-dicarboxylat (t-ACPD), ein Glutamat-Analogon; 1-Aminocyclohexancarboxylsäure (ACHC); 3-Methylhistidin; D-Aspartat.

Die Erfinder haben erstmals erkannt, dass mit der erfindungsgemäßen Verwendung des nicht-metabolisierbaren Aminosäureanalogons eine universelle Behandlung von eingangs genannten Krankheitserregern möglich ist, ohne dass die Gefahr der Resistenzbildung gegeben ist. Das Aminosäureanalogon gelangt auf Grund seiner strukturellen Ähnlichkeit zu dem natürlichen Aminosäurependant nach der Applikation über Aminosäuretransporter in der Zellmembran der Wirtszelle in das Cytoplasma. Dort kann das Aminosäureanalogon jedoch nicht verstoffwechselt werden und steht somit dem Krankheitserreger zur Energiegewinnung und zur Proteinsynthese nicht zur Verfügung.

Das Aminosäureanalogon kompetitiert mit dem natürlichen Aminosäurependant um die Aufnahme in die Zelle. Bei ausreichend konzentrierter Applikation von Aminosäureanaloga wird ein Ungleichgewicht zuungunsten der natürlichen Aminosäuren herbeigeführt, die damit im Cytoplasma zunehmend verarmen. Damit wird den Krankheitserregern praktisch die gesamte Nahrungsgrundlage entzogen, diese werden gewissermaßen „ausgehungert". Eine Resistenzbildung gegenüber dieser Nährstoffminderversorgung ist praktisch nicht möglich, da dies eine vollständige Umgestaltung und Neuordnung des bakteriellen Stoffwechsels erfordern würde. Die Gefahr einer Resistenzbildung ist damit nahezu ausgeschlossen.

Wie die Erfinder festgestellt haben, wird in der Wirtszelle nach der Aufnahme des nicht-metabolisierbaren Aminosäureanalogons gleichzeitig der metabolische Flux, d. h. der Energiedurchsatz, erhöht und somit noch vorhandene natürliche freie Aminosäuren schnell verstoffwechselt, was zusätzlich zu einer Erniedrigung der intrazellulären Aminosäurekonzentration führt. Dadurch wird die Lebensfähigkeit der intrazellulären Krankheitserreger weiter reduziert.

Besonders überraschend war, dass die Wirtszelle bei der Verwendung des erfindungsgemäßen nicht-metabolisierbaren Aminosäureanalogons nicht geschädigt wird. Von Seiten der Erfinder wird vermutet, dass die Wirtszelle die Aminosäureminderversorgung auf Grund von effektiven metabolischen Kompensationsmechanismen ausgleichen kann. Für die Wirtszelle sind deshalb bereits äußerst geringe Aminosäurekonzentrationen ausreichend, um sämtliche Stoffwechselprozesse, zumindest über den Zeitraum der therapeutisch erforderlichen Applikation des Aminosäureanalogons, aufrechtzuerhalten. Das Aminosäureanalogon wird im Laufe von mehreren Tagen unverändert aus der Zelle bzw. über die Nieren aus dem Wirtsorganismus ausgeschieden.

Besonders vorteilhaft ist es, dass durch die erfindungsgemäße Vorgehensweise auch antibiotikaresistente Erreger behandelbar sind, da auch solche Stämme auf die externe Zufuhr von Aminosäuren angewiesen sind. Ferner wird durch den natürlicherweise relativ hohen Aminosäureturnover in der Wirtszelle die schnelle Wirksamkeit des Analogons gewährleistet und gleichzeitig eine hohe Spezifität auf die zu behandelnden intrazellulären Krankheitserreger sichergestellt.

Erfindungsgemäß werden als nicht-metabolisierbares Aminosäureanalogon 2-Aminobicyclo[2,2,1]heptan-2-carboxylsäure (BCH) oder deren Derivate verwendet. BCH ist auch bekannt unter der Bezeichnung 2-Amino-2-norbornan-carboxylsäure.

Bei BCH handelt es sich um ein Analogon zu der Aminosäure Leucin, das eine starke Affinität zu einem Hauptaminosäuretransporter eukaryotischer Zellen aufweist, der dem sog. B0+-Aminosäuretransportsystem angehört und die Bezeichnung hATB0,+ trägt; vgl. hierzu Sloan, J. L. and Mager, S. (1999), Cloning and Functional Expression of a Human Na+ and Cl-dependent Neutral and Cationic Amino Acid Transporter B0+*, The Journal of Biological Chemistry, Vol. 274, Nr. 34, S. 23740–23745. Des Weiteren ist in der Literatur eine BCH-vermittelte Hemmung des B0,+-Aminosäuretransportsystems beschrieben worden (Sloan and Mager, a. a. O.). BCH konkurriert konzentrationsabhängig mit den drei natürlichen Aminosäuren Glutamin, Cystein und Serin um die Aufnahme in die Wirtszelle und bewirkt bei entsprechend dosierter Applikation eine Verarmung von deren intrazellulären Konzentrationen.

Die Erkenntnisse der Erfinder, dass nämlich BCH selbst in hohen Konzentrationen für die Wirtszelle nicht toxisch ist, prädestiniert diese Substanz für eine systemische Applikation. Auch bei systemischer Applikation von BCH ist eine zielgerichtete Behandlung von intrazellulären Infektionen, insbesondere der Atemwege, möglich. So wurde nämlich beobachtet, dass der für die Aufnahme von BCH mitverantwortliche Aminosäuretransporter hATB0,+ am stärksten in den Zellen der Atemwege exprimiert wird, die bspw. primäre Infektionsziele von Legionellen darstellen, ferner in Zellen des Augenlides, der Brustdrüse, der Bauchspeicheldrüse und des Enddarms (vgl. Sloan, J. L. and Mager, S. (a. a. O.), Hatanaka, T. et al. (2003), Transport of Amino acidbased Prodrugs by the Na+- and Cl-coupled Amino Acid Transporter ATB0,+ and Expression of the Transporter in Tissues Amenable for Drug Delivery, JPET, Nr. 57109). Aber auch in anderen Zellen wird der hATB0,+-Aminosäuretransporter exprimiert, wenngleich auf niedrigerem Level, wie bspw. im Cortex (vgl. Sloan, J. L. and Mager, S. (a. a. O.). Auf Grund dieser Begebenheiten kann BCH ohne zusätzliche Trägersubstanz appliziert werden, wobei eine solche jedoch im Einzelfall und um ggf. die Spezifität zu erhöhen vorgesehen werden. Derartige Trägersubstanzen sind dem Fachmann bekannt und werden bspw. im Zusammenhang mit dem sog. „drug targeting" beschrieben.

Wie die Erfinder in Zellkulturversuchen festgestellt haben, führt dort eine Konzentration von 5 bis 10 mM BCH zu guten Ergebnissen, bei denen die intrazellulären Krankheitserreger effektiv bekämpft werden und sich keinerlei toxische Auswirkungen auf die Wirtszellen zeigen. Die für eine erfindungsgemäße Verwendung zu wählende Konzentration von nicht-metabolisierbarem Aminosäureanalogon bzw. von BCH ist im Einzelfall festzulegen und abhängig von verschiedensten Faktoren, wie bspw. von der konkret zu therapierenden Infektion, dem Zustand und Alter des Patienten, der Darreichungsform und Galenik, der Therapieform, etc. Dementsprechend kann die Konzentration an Aminosäureanalogon von einem Fachmann, bspw. einem Pharmakologen, Biochemiker oder klinischen Chemiker über Routineversuche im Einzelfall ermittelt werden. Dies gehört zum handwerklichen Können eines solchen Fachmanns und erfolgt weitgehend nach Standardmethoden der vorklinischen und klinischen Arzneimittelentwicklung.

BCH wird im Stand der Technik bislang zu rein wissenschaftlichen, nicht-medizinischen Zwecken verwendet, bspw. im Rahmen von stoffwechselphysiologischen Versuchen oder elektrophysiologischen Transportmessungen an Versuchstieren; siehe bspw. Mc. Givan, J. D., Pastor-Anglada, M. (1994), Regulatory and molecular aspects of mammalian amino acid transport, Biochem J., Vol. 299 (Pt 2), S. 321–34; Campa, M. J., Kilberg, M. S., (1989), Characterization of neutral and cationic amino acid transport in Xenopus oocytes, J Cell Physiol., Vol. 141(3), S. 645–52; Taylor, P. M., Hundal, H. S., Rennie, M. J., (1989), Transport of glutamine in Xenopus laevis oocytes: relationship with transport of other amino acids, J Membr Biol., Vol. 112(2), S. 149–57; Mackenzie, B., Harper, A. A., Taylor P. M., Rennie, M. J., (1994), Na+/amino acid coupling stoichiometry of rheogenic system B0,+ transport in Xenopus oocytes is variable, Pflugers Arch., Vol. 426(1–2), S. 121–8; Cativiela, L., López, P., Mayoral, J. A. (1991) Asymmetric synthesis of 2-Aminonorbornane-2-carboxylic acids by Diels-Alder reaction, Tetrahedron: Asymmetry, Vol. 2(12), S 1295–1304.

Die Erfinder hingegen beschreiben zum ersten Mal eine Anwendung von BCH auf medizinischem Gebiet mit einer konkreten therapeutischen Zweckbestimmung, nämlich der Behandlung von Infektionen durch intrazelluläre, von der Aufnahme von Aminosäuren abhängige Krankheitserreger.

Derartige Infektionen können erfindungsgemäß ebenfalls mit Derivaten von BCH behandelt werden. Darunter werden in engem Verwandtschaftsgrad zu BCH stehende chemische Abkömmlinge von BCH verstanden, die gleichermaßen nicht-metabolisierbare Aminosäureanaloga darstellen und die gleiche Funktion wie BCH erfüllen.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner ein vorstehend erläutertes, nicht-metabolisierbares Aminosäureanalogon zur Behandlung der genannten Infektionen, das an einen therapeutischen Wirkstoff gekoppelt ist.

Im Rahmen der Erfindung wird unter „therapeutischer Wirkstoff" jegliche chemisch, biochemisch oder biologisch definierte Substanz verstanden, die die Vitalfunktionen von Zellgewebe, Organen oder Organismen beeinflussen, wie bspw. Arzneimittel, Vitamine, Enzyme, Hormone, Toxine, Pro-Drugs, etc. Diese Maßnahme macht die Erkenntnis zunutze, dass es sich bei hATB0,+ um einen hochpotenten Aminosäuretransporter handelt, über den gezielt bspw. eine Aufnahme von Arzneimitteln, bspw. antiviralen Wirkstoffen, in die Zellen erfolgen kann. Damit wird ein Problem, das sich bei vielen therapeutischen Wirkstoffen ergibt, gelöst, nämlich dass diese häufig schlecht oder gar nicht von Zellen aufgenommen werden. Durch die Ankopplung eines solchen therapeutischen Wirkstoffes an ein nicht-metabolisierbares Aminosäureanalogon wie BCH wird effizient eine hohe Affinität zu dem hATB0,+-Aminosäuretransporter geschaffen, was die Aufnahme des therapeutischen Wirkstoffes als sog. Pro-Drug in die Zelle ermöglicht. Durch diese Maßnahme kann ggf. die oben beschriebene Wirkungsweise von BCH noch verstärkt werden, obwohl über den angekoppelten therapeutischen Wirkstoff auch dann eine gezielte Behandlung intrazellulärer Infektionen ermöglicht werden kann, selbst wenn BCH per se gegen die entsprechenden Krankheitserreger keine Wirksamkeit zeigt, d. h. lediglich als Trägersubstanz fungiert, wie dies bspw. im Rahmen einer Behandlung der Tuberkulose möglich wäre, da BCH gegen Mycobakterien wenig bis gar keine Wirkung zeigt.

Erfindungsgemäß ist es bevorzugt, wenn die Krankheitserreger ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus: Bakterien der Gattungen Legionella, Brucella, Bordetella, Listeria, Mycobakterium, Coxiella, Porphyromonas, Chlamydia, Rickettsia; Parasiten der Gattungen Leishmania, Toxoplasma, Plasmodium; parasitäre Pilze.

Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass somit die wichtigsten intrazellulären Krankheitserreger erfasst werden, die ursächlich sind für Krankheiten, wie bspw. der Legionärskrankheit, Brucellosen, Keuchhusten, Listeriose, Tuberkulose, Lepra, Buruli-Krankheit, Q-Fieber, Infektionen in der Mundhöhle (z. B. Parodontose), Hauterkrankungen, Lungenentzündung, Lymphogranuloma inguinale, Trachom, Psittakose, Rickettsiosen, Rocky-Mountain-Fleckfieber, Leishmaniose, Toxoplasmose, Malaria, Mycosen.

Aus diesem Grunde ist es weiter bevorzugt, wenn die erfindungsgemäße Verwendung zur Behandlung einer der vorstehend genannten Krankheiten erfolgt.

Bei vielen intrazellulären Krankheitserregern ist der Mechanismus der Energiegewinnung nach wie vor unbekannt. Dieser lässt sich jedoch im Einzelfall über dem Fachmann bekannte Routineversuche ermitteln. Deshalb können mit der erfindungsgemäßen Verwendung auch solche Krankheiten bedingt durch Krankheitserreger behandelt werden, deren Energiegewinnungsmechanismus zum jetzigen Zeitpunkt noch nicht aufgeklärt ist, sofern dieser auf der Metabolisierung von cytoplasmatisch zugeführten Aminosäuren basiert.

Erfindungsgemäß ist es ferner bevorzugt, wenn das Arzneimittel, das das nicht-metabolisierbare Aminosäureanalogon enthält, zu topischen Applikation, vorzugsweise als Inhalationsspray, Augentropfen, Mundspülung oder Zahnpflegekaugummi ausgebildet ist.

Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass die Verabreichung des Wirkstoffes auf den Infektionsherd, bspw. bei Verabreichung eines Sprays auf die Lunge, begrenzt wird, wenn beabsichtigt ist, eine isolierte Infektion der Atemwege zu behandeln. Gleiches gilt für die Behandlung einer lokalen Infektion der Augen, bspw. durch Chlamydia trachomatis, bei Verabreichung von Augentropfen. Parodontale Entzündungen der Mundhöhle, bspw. hervorgerufen durch Porphyromonas gingivialis, lassen sich bei Verwendung von Mundspülungen oder Zahnpflegekaugummi gezielt behandeln. Etwaige Nebenwirkungen, bspw. durch Hilfs- oder Zusatzstoffe bzw. weitere Wirkstoffe, werden durch diese Maßnahme nochmals reduziert.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist vor diesem Hintergrund auch eine pharmazeutische Zusammensetzung, die eingangs erwähnte, nicht-metabolisierbare Aminosäureanaloga sowie einen pharmazeutisch akzeptablen Träger und ggf. weitere pharmazeutische Hilfs- oder Wirkstoffe enthält, wobei diese Zusammensetzung vorzugsweise zur topischen Applikation, bspw. als Inhalationsspray, Augentropfen, Mundspülung oder Zahnpflegekaugummi, ausgebildet ist.

Geeignete pharmazeutisch akzeptable Träger sowie Hilfsstoffe sind dem Fachmann bekannt und finden sich bspw. in Kibbe, A., Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3. Auflage (2000), American Pharmaceutical Association and Pharmaceutical Press, ISBN 0-917330-96-X.

Denkbar ist ferner die Bereitstellung einer solchen pharmazeutischen Zusammensetzung, die weitere Wirkstoffe enthält, wodurch eine noch höhere therapeutische Wirksamkeit und ein breiteres Anwendungsspektrum erzielt werden kann.

Es versteht sich, dass die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in der jeweils angegebenen Kombination, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung verwendbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.

Die vorliegende Erfindung wird nun anhand von Ausführungsbeispielen unter Bezugnahme auf die Figuren erläutert, aus denen sich weitere Eigenschaften und Vorteile ergeben. Es zeigen:

1 die Inhibition der intrazellulären Vermehrung von Legionella pneumophila in Mono Mac6-Zellen durch BCH im Vermehrungs- und Phagocytoseassay;

2 die Inhibition der intrazellulären Vermehrung von Legionella pneumophila in primären menschlichen Blutmonozyten durch BCH im Vermehrungsassay;

3 dass BCH keine direkte Inhibition des Wachstums von Legionella pneumophila bei isolierter Inkubation in Flüssigkulturen bewirkt;

4 dass BCH keine toxischen Auswirkungen auf Zellkulturen von Mono Mac6-Zellen hat.

Ausführungsbeispiele Beispiel 1: Einfluss von BCH auf die phagocytotische Aufnah me und intrazelluläre Vermehrung von Legionella pneumophila

Der Einfluss von BCH (Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland; die Synthese von BCH ist beschrieben in Christensen, H. N. et al. (1969), Bicyclic Amino Acid to Improve Discriminations among Transport Systems, The Journal of Biological Chemistry, Vol. 244, Nr. 6, Seiten 1510–1520) auf die phagocytotische Aufnahme von Legionella pneumophila in die Wirtszelle wurde mittels des sog. Phagocytoseassays untersucht: Als Zielzellen wurden sog. Mono Mac6-Zellen (MM6) verwendet (vgl. Ziegler-Heitbrock, H. W. et al. (1988), Establishment of a Human Cell Line (Mono Mac 6) with Characteristics of Mature Monocytes, Int. J. Cancer, Vol. 41, Seiten 456–461). Die MM6-Zellen wurden in Kulturmedium (RPMI 1640-Basismedium (Gibco, Eggenstein, Deutschland), 10% fötalem Kälberserum, einfach „minimum essential amino acids" (Gibco), 2 mM L-Glutamin, OPI „growth supplement = Oxalacetat, Pyruvat, Insulin (Sigma-Aldrich)) kultiviert. Zur Durchführung des Assays wurden die MM6-Zellen aliquotiert, wobei ein Aliquot für 30 Minuten mit 10 mM BCH in Infektionsmedium (entspricht Kultivierungsmedium ohne fötales Kälberserum) vorinkubiert wurde, so dass BCH seine Wirkung entfalten kann. Das andere Aliquot bleibt als Kontrollansatz ohne BCH.

Zu den Ansätzen wurden Legionellen hinzugegeben und es erfolgte eine zweistündige Inkubation beider Ansätze. Im Anschluss erfolgte die Zugabe des Antibiotikums Gentamicin und eine einstündige Inkubation. Sämtliche Bakterien, die nicht von den MM6-Zellen phagocytiert wurden und deshalb noch extrazellulär vorhanden waren, wurden abgetötet. Nach der Inkubation wurden die Ansätze dreimal gewaschen. Dabei wurde das Gentamicin und das BCH des einen Ansatzes ausgewaschen. Beide Ansätze wurden für weitere 72 Stunden (0 bis 72 h) in reinem Infektionsmedium ohne jegliche Zusätze inkubiert.

Würde BCH die Aufnahme der Legionellen in die Wirtszelle verhindern, dann ließen sich beim 0h-Wert des BCH-Ansatzes wesentlich weniger bzw. gar keine Bakterien im Inneren der MM6-Zellen im Vergleich zum Kontrollansatz nachweisen. Wenn hingegen BCH die Phagocytose der Legionellen nicht behindert, dann müssten in beiden Ansätzen beim 0h-Wert vergleichbare Bakterienmengen in den MM6-Zellen nachweisbar sein. Ferner würde man erwarten, dass bei unbeeinflusster Phagocytose sich die aufgenommenen Legionellen intrazellulär normal weitervermehren, da das BCH vor der Weiterinkubation in reinem Infektionsmedium bereits ausgewaschen wurde.

Beiden Ansätzen wurden zum Zeitpunkt 0 h, 24 h, 48 h und 72 h Proben entnommen. Die Wirtszellen wurden mit Ultraschall lysiert, was jedoch die Legionellen nicht schädigt. Dadurch wurden die intrazellulären Bakterien freigesetzt. Anschließend wurden die entnommenen und wie vorstehend beschrieben behandelten Proben auf einem Bakteriennährboden ausplattiert und für drei Tage inkubiert.

Nach der Inkubation auf dem Nährboden erfolgte eine statistische Auswertung der Kolonienzahl und man erhält als Endergebnis die Bakterienzahl/ml der Probe [CFU/ml]. Dabei zeigt der 0h-Wert an, wie viele Bakterien unmittelbar nach Infektionsbeginn von den MM6-Zellen aufgenommen wurden (= Phagocytoserate). Das Ergebnis dieses Experimentes ist in 1 dargestellt.

Dabei zeigte sich, dass die Phagocytoserate durch die Gegenwart von BCH nicht beeinflusst wird (0h-Wert). In beiden Ansätzen, d. h. in Gegenwart von 10 mM BCH (-x-; 1) als auch in Abwesenheit von BCH (-♦-; K) wurden von den MM6-Zellen vergleichbar viele Bakterien phagocytiert. Auch das sich daran anschließende Wachstum über 72 Stunden hinweg verlief in beiden Ansätzen gleich.

Der Einfluss von BCH auf die intrazelluläre Vermehrung der phagocytierten Bakterien wurde mittels des sog. Vermehrungsassays untersucht: Dieser Assay verlief entsprechend dem Phagocytoseassay, wobei keine vorherige Vorinkubation eines Ansatzes mit BCH erfolgte. In Kürze: Die Legionellen wurden mit MM6-Zellen in Infektionsmedium zusammengegeben, so dass es während der anschließenden zweistündigen Inkubation zur Phagocytose der Bakterien kommen konnte. Im Anschluss wurde Gentamicin zugegeben und abermals einstündig inkubiert. Die Ansätze wurden dreimal gewaschen, anschließend erfolgte zu einem Ansatz die Zugabe von 10 mM BCH, während ein Ansatz als Kontrolle unbehandelt blieb. Die Inkubation beider Ansätze erfolgte wie beschrieben über 72 Stunden mit entsprechenden Probenahmen. Das Ergebnis eines solchen Experimentes ist ebenfalls in 1 gezeigt.

Die Inkubation der infizierten Zellen mit 10 mM BCH (-*-; 2) führte zu einer Blockierung der intrazellulären Vermehrung von Legionella pneumophila in den Mono Mac6-Zellen und in der Folge zu einem Absterben der Legionellen; vgl. untere Kurve. In der Kontrolle ohne BCH (-♦-; K) hingegen zeigten die Legionellen intrazellulär ein Wachstum um 2,5 logs.

In einem weiteren Experiment wurde die intrazelluläre Vermehrung von Legionella pneumophila in primären menschlichen Blutmonozyten untersucht. Dabei wurde analog ein wie zuvor beschriebener Vermehrungsassay durchgeführt, wobei die MM6-Zellen entsprechend gegen Blutmonozyten ausgetauscht wurden. Das Ergebnis dieses Experimentes ist in 2 dargestellt.

Dabei zeigte sich, dass nach 48 h der Kultivierung die intrazelluläre Vermehrung der Legionellen im Ansatz mit BCH (rechte dunkle Säulen; 10 mM BCH) stark abnahm und die Bakterien nach 72 h sogar nicht mehr messbar waren, wohingegen im Kontrollansatz (linke helle Säulen; K) eine zunehmende Vermehrung der Legionellen beobachtet wurde.

Aus diesem Experiment ergibt sich, dass BCH auch gesunde, d. h. Nichttumorzellen, vor einer Infektion durch Legionellen schützt. Bei der erfindungsgemäßen Verwendung handelt es sich also um ein universelles zelltypunabhängiges und damit auf den Gesamtorganismus anwendbares Prinzip der Behandlung von intrazellulären Infektionen.

Beispiel 2: Vermehrungsfähigkeit von Legionella pneumophila bei direkter Inkubation mit BCH

Es wurden Flüssigkulturen von Legionella pneumophila in BYE-Medium (Oxoid, Wesel, Deutschland) mit einer optischen Dichte von 0,02 bei 578 nm hergestellt. Von diesem Ansatz wurde ein Aliquot mit 10 mM BCH inkubiert, wohingegen ein weiteres Aliquot unbehandelt blieb. Die Kulturen wurden für 42 h bei 37°C und 230 rpm in einem Schüttler inkubiert. Während dieser Zeit wurden zu verschiedenen Zeitpunkten Proben entnommen und das Wachstum über die Bestimmung der optischen Dichte vermessen. Ein repräsentatives Ergebnis aus drei solchen unabhängigen Experimenten ist in 3 dargestellt.

Hier zeigte sich sowohl im Ansatz ohne BCH (-♦-; L. pn. -BCH) als auch im Ansatz mit BCH (

L. pn. + 10 mM BCH) ein gleichmäßiges Wachstum der Kulturen. Die direkte Inkubation der Bakterien mit BCH führte zu keiner Reduktion der Bakterienkonzentration, d. h. zu keiner Inhibition der Vermehrungsfähigkeit der Bakterien. Daraus ergibt sich dass BCH keinen direkten auf das Wachstum von Legionella pneumophila inhibitorischen Einfluss ausübt und deshalb per se für die Bakterien nicht toxisch ist. Der erfindungsgemäß erkannte und therapeutisch nutzbare Effekt des Aminosäureanalogons ist vielmehr ein indirekter, der an der infizierten Wirtszelle ansetzt.

Beispiel 3: Einfluss von BCH auf die Lebensfähigkeit der Wirtszelle

Es wurden Zellkulturen von Mono Mac6-Zellen angelegt. Dabei wurde ein Ansatz durch Zugabe in das Medium mit 10 mM BCH versehen, wohingegen ein weiterer Ansatz als Kontrolle unbehandelt blieb. Die Zellen wurden unter den in Beispiel 1 genannten Kultivierungsbedingungen in Infektionsmedium inkubiert und über einen Zeitraum von 72 h hinweg wurde die Lebensfähigkeit über die bekannte Trypanblaufärbemethode bestimmt, d. h. tote Zellen wurden mittels dieses Farbstoffes blau angefärbt, während lebende Zellen farblos blieben. Das Ergebnis dieses Versuches ist in 4 dargestellt.

Dabei zeigte sich, dass die Zellen aus dem Ansatz ohne zugegebenes BCH (-♦-; MM6 – BCH) die gleiche Lebensfähigkeit bzw. die gleiche Sterberate aufwiesen wie die Zellen im Ansatz mit zugegebenem BCH (

MM6 + 10 mM BCH). Die Totzellzahl stellt sich wie folgt dar: Totzellzahl [%] reines Inkubationsmedium Inkubationsmedium + 10 mM BCH 0 h 4 4 24 h 10 7 48 h 18 21 72 h 38 34

Dieses Experiment bestätigt, dass BCH keine toxischen Effekte auf die Wirtszelle bzw. die humane monozytäre Zelllinie Mono-Mac6 hat. BCH ist deshalb nicht nur per se für die Krankheitserreger, sondern auch insgesamt für die Wirtszellen unschädlich. BCH ist deshalb besonders als therapeutisches Agens geeignet, da es – im Gegensatz zu klassischen Antibiotika – keine wirtszellschädigenden Nebenwirkungen zeigt.

Die vorstehenden Daten belegen das erstmals von den Erfindern erkannte hohe therapeutische Potenzial von nicht-metabolisierbaren Aminosäureanaloga und im Speziellen von BCH zur Behandlung von Infektionen durch intrazelluläre, von der Aufnahme von Aminosäuren abhängige Krankheitserreger. Der Stand der Technik wird damit um ein völlig neues Behandlungs- und Therapiekonzept zur Bekämpfung von intrazellulären Krankheitserregern bereichert, durch das die bislang übliche Behandlung mittels Antibiotika und den damit verbundenen und eingangs geschilderten Nachteilen abgelöst werden kann.


Anspruch[de]
2-Aminobicyclo[2,2,1]heptan-2-carboxylsäure (BCH) oder deren Derivate zur Behandlung von Infektionen durch intrazelluläre, von der Aufnahme von Aminosäuren abhängige Krankheitserreger. BCH oder deren Derivate nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass dieses an einen therapeutischen Wirkstoff gekoppelt ist. Verwendung von 2-Aminobicyclo[2,2,1]heptan-2-carboxylsäure (BCH) oder deren Derivaten zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Infektionen durch intrazelluläre, von der Aufnahme von Aminosäuren abhängige Krankheitserreger. Verwendung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Krankheitserreger ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus: Bakterien der Gattungen Legionella, Brucella, Bordetella, Listeria, Mycobakterium, Coxiella, Porphyromonas, Chlamydia, Rickettsia; Parasiten der Gattungen Leishmania, Toxoplasma, Plasmodium; parasitäre Pilze. Verwendung nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass diese zur Behandlung einer Krankheit erfolgt, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Legionärskrankheit, Brucellosen, Keuchhusten, Listeriose, Tuberkulose, Lepra, Buruli-Krankheit, Q-Fieber, Infektionen in der Mundhöhle, Hauterkrankungen, Lungenentzündung, Lymphogranuloma inguinale, Trachom, Psittakose, Rickettsiosen, Rocky-Mountain-Fleckfieber, Leishmaniose, Toxoplasmose, Malaria, Mycosen. Verwendung nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Arzneimittel zur topischen Applikation, vorzugsweise als Inhalationsspray, Augentropfen, Mundspülung oder Zahnpflegekaugummi ausgebildet ist. Pharmazeutische Zusammensetzung enthaltend BCH oder/und deren Derivate nach Anspruch 1 oder 2 sowie einen pharmazeutisch akzeptablen Träger und ggf. weitere pharmazeutische Hilfs- oder Wirkstoffe. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass diese zur topischen Applikation, vorzugsweise als Inhalationsspray, Augentropfen, Mundspülung oder Zahnpflegekaugummi ausgebildet ist.






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