Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum DNA-Nachweis mittels Amplifikation durch die PCR-Methode oder in Gewebeschnitten mittels in-situ-PCR.

Insbesondere können damit Bakterien, Viren und DNA anderer Herkunft nachgewiesen werden. Von Bedeutung ist vor allem die Diagnose pathogener Bakterien wie Tuberkelbakterien.

Anwendungsgebiete der Erfindung sind demzufolge die medizinische Diagnostik und die wissenschaftliche Forschung.

Die Polymerasekettenreaktion (PCR) hat seit ihrer Einführung 1985 entscheidende Fortschritte bezüglich Sensitivität und Spezifität gemacht und ist heutzutage aus der klinischen Forschung und Diagnostik nicht mehr wegzudenken.

Ein Nachteil dieser Technik ist allerdings die immer bestehende Gefahr der Probenkontamination mit Fremd-DNA, die zu falsch positiven Resultaten führen kann. Ein weiterer Nachteil ist, dass der gesuchte DNA- bzw. RNA-Abschnitt morphologisch nicht spezifischen Zellen bzw. Zellstrukturen zugeordnet werden kann. Für diese Fragestellung wurden in den letzten Jahren immer spezifischere Methoden der Insitu-Hybridisierung (isHyb) entwickelt. Sie verbinden die Sensitivität einer PCR mit dem Vorteil der isHyb, einzelne bestimmte Zellen zu lokalisieren, die einen gesuchten DNA-Abschnitt enthalten. Seit der Erstbeschreibung dieser Technik im Jahre 1990 [ P. I. Schiller et al. Der Pathologe, Vol. 19, Nr. 4(1998) ] sind in kürzester Zeit eine Vielfalt an Methoden und Protokollen entwickelt worden, die es heute erlauben, virale DNS, chromosomale Translokationen und virale RNS (mittels Reverse-Transkriptase-in-situ-PCR) darzustellen. Grundsätzlich werden 2 verschiedene Methoden des DNS-Nachweises verwendet: Bei der in-situ-PCR (isPCR) werden während der DNS-Amplifikation markierte Nukleotide eingebaut, die nachfolgend direkt immunhistochemisch nachgewiesen werden können (direkte Methode). Bei der zeitintensiveren aber spezifischeren PCR-in-situ-Hybridisierung (PCRisHyb) werden im Anschluss an die PCR durch eine in-situ-Hybridisierung markierte spezifische Oligonukleotidsonden an die gesuchten Amplifikationsprodukte gebunden und nachfolgend immunhistochemisch nachgewiesen (indirekte Methode).

Obwohl heutzutage viele gut funktionierende Protokolle bestehen, ist die Methode vor allem bei der Etablierung neuer Anwendungen oder bei Neueinsteigern oft problematisch und ergibt schlecht reproduzierbare Resultate.

Das Ziel der Erfindung besteht darin, ein Verfahren zu entwickeln, mit dem pathogene Keime in Körpergeweben schnell und zuverlässig bestimmt werden können. Die Erfindung hat die Aufgabe, die Vorteile des in-situ-PCR-Verfahrens (kostengünstig, geringer Zeitaufwand) zu nutzen und eine hohe Spezifität zu erreichen. Durch Erhalt der Gewebestrukturen während des Verfahrens sollen auch geringe Konzentrationen erfassbar und eine Zuordnung zu bestimmten Zellen möglich sein.

Gemäß der Erfindung werden in üblicher Weise Paraffinschnitte von zu untersuchenden Geweben angefertigt. Nach der Entparaffinierung wird die DNA im Gewebe durch Hitze – und Enzymbehandlung freigelegt. Die Freilegung der DNA erfolgt durch Hitzevorbehandlung mit der konzentrierten (10 ×) Vorbehandlungslösung im Dampfkochtopf unter Druck, wobei der Druck für 2 Minuten gehalten wird. Wesentlich ist, dass vor der Enzymbehandlung der Schnitte ein Fixieren mit 1%igem gepuffertem Formaldehyd für 10 Minuten erfolgt.

Ganz wichtig für die Realisierung der Erfindung ist die Gestaltung der nachfolgenden PCR-Amplifizierung. Sie erfolgt durch 40 bis 60, bevorzugt 50 Zyklen mit Reaktionsmixwechsel nach der Hälfte der Zyklen. Ein besonderes Merkmal besteht darin, dass die PCR auf einem Objektträger mit angepasster Temperatureinstellung durchgeführt wird. Ein Kernpunkt der Erfindung besteht darin, dass die Verlängerung bei 74°C durchgeführt wird. Niedrigere Temperaturen wie 72°C gemäß Standardprotokoll führen überraschenderweise zu wesentlich schlechteren Ergebnissen. (vgl. )

Die Hybridisierung und Sichtbarmachung des Amplikons wird durch eine Fluoreszenzsonde erreicht. Sie ist dadurch gekennzeichnet, dass die Hybridisierung nach Denaturierung (2 Minuten bei 80°C) durch 16stündige Inkubation bei 37°C erfolgt.

Alternativ kann auch eine biotinylierte Sonde eingesetzt werden.

Danach ist das „Amplidot" visuell erfassbar (vgl. ).

Die Vorteile der Erfindung liegen in Folgendem:

• – Eine Extraktion der DNA ist nicht notwendig.
• – Die morphologische Zuordnung ist möglich.
• – Auch niedrigkonzentrierte Targets sind erfassbar.
• – Die Dauer des Verfahrens beträgt 2–3 Tage, dagegen dauert das klassische Tierexperiment mehrere Wochen,
• – Das Verfahren ist einfach handhabbar, es lässt sich ohne besonderen Aufwand in Arztpraxen o. ä. etablieren

Die Erfindung soll nachfolgend durch Ausführungsbeispiele näher erläutert werden.

Paraffin eingebettete Gewebsschnitte (~2 &mgr;m dick) auf SuperFrost Gold+ Glasschnitten in der Mitte des Schnittes aufziehen.

• – Inkubation der Schnitte mit Paraffin eingelagertem Gewebe über Nacht bei 60°C.

• - Entparaffinieren der Schnitte: mind. 2 Stunden!
  
  Eintauchen der Schnitte nacheinander in
• – Xylol 2 × 1 Stunde (frisch)
• – reines Ethanol 2 × 5 Minuten
• – 80prozentiger Ethanol 5 Minuten
• – 70prozentiger Ethanol 5 Minuten
• – destilliertes Wasser 10 Minuten

Das Inkubationsvolumen wird auf 65 &mgr;l eingestellt, vgl.

Zur besseren Haftung werden die Inkubations-Rähmchen schon jetzt um den Schnitt befestigt und dann wie folgt behandelt:

• a) Verdünnen der konzentrierten (10 ×) Vorbehandlungslösung (Citratpuffer pH 8.0) auf 1 × (100 ml Lösung + 900 ml destilliertes Wasser), Füllen des Dampfkochtopfes mit dieser Lösung und Erhitzen des Puffers, bis er kocht.
• b) Platzieren der Schnitte in einen Objektträgerhalter mit HER – Puffer und einstellen in den Dampfkochtopf (beachten, dass die Schnitte vollständig bedeckt sind).
  
  Schließen des Kochtopfes, warten, dass der Druck steigt und dann diesen Druck für 2 Minuten halten.
• c) Den Kochtopf unter fließendes Wasser halten, um den Druck zu senken, öffnen und anschließend mindestens 10 Minuten stehen lassen, bis er auf Zimmertemperatur abgekühlt ist.
• d) Waschen der Schnitte mit destilliertem Wasser.

• – Vorbereiten der Proteinase K Arbeitslösung (10 mg/mL) durch Zufügen von 250 &mgr;l Proteinase K konzentrierter Lösung zu 50 ml des PBS Puffers 1 × pH 7,4 beinhaltend 2 mM CaCl₂ und Inkubieren der Schnitte in der vorgewärmten Lösung bei 37°C für 30 Minuten. (Es sollten nicht mehr als 5–6 Schnitte gleichzeitig in dieser Lösung behandelt werden).
• – Waschen mit 2 × SSC 5 Minuten lang bei Zimmertemperatur.
• – Einsetzen der Schnitte in 1%igem Pufferformaldehyd für 10 Minuten.
• – Waschen mit 2 × SSC 5 Minuten lang bei Zimmertemperatur.
• – Dehydratisieren der Schnitte in (frischem) Ethanol 70% 5 Minuten – Ethanol 80% 5 Minuten – reinem Ethanol 5 Minuten
• – Trocknen lassen der Schnitte

Primer für Mycobacterium tuberculosis-Komplex (Metabion) Amplicon 123 Gene IS 6110

• – sense 5' CCT GCG AGC GTA GGC GTC GG 3'
• – antisense 5' CTC GTC CAG CGC CGC TTC GG 3'
  
  Nachgewiesene Subtypen: M. tuberculosis complex
  
  (M. Tuberculosis, M. bovis, M. bovis BCG, M. microti, M. africanum)
• – Methode
  
  Gewebeschnitte belegt mit einer 15 × 15 mm Rahmendichtungsinkubationskammer aufgefüllt mit PCT Reaktionsmischung (65 &mgr;l). Anordnung: iQSuper Mix + Primer I/II

Der iQ Supermix enthält 100 mM KCl, 40 mMTris-HCl, pH 8,4, je 0,4 mM dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), 50 U/ml iTaq DNA Polymerase, 6 mM MgCl₂, Stabilisatoren.

Nach dem Abdecken der Schnitte mit Deckglasfolie werden sie mit einem Einsatz für 4 Schnitte im PCT 200 PCR Cycler eingebracht.

Ein Durchlauf umfasst 95°C Denaturierung, 65°C Anlagerung, 74°C Verlängerung Gesamtzeit aller Durchläufe: 9 h.

Die Deckgläser werden mit einer Skalpellspitze oder einer Präpariernadel entfernt, dann zweimal in phosphat-gepufferter Salzlösung (jeweils 5 Minuten) gewaschen und in aufsteigenden Alkoholreihen dehydriert.

• Probe für Mycobacterium. tuberculosis complex (built:Metabion)
• Probe 5'-Fam CAT AGG TGA GGT CTG CTA CC 3'
• Konz. und Vol. der Probe: 10 pmol/&mgr;l (200 nM) Probe/Schnitt: 1,3 &mgr;l

• 6.1 Der ULTRAhyb-Oligo HybPuffer (AMBION) wird auf 37°C gebracht, dann werden die Schnitte für 2 h bei 37°C im PTC 200 PCR Cycler (BIO-RAD) inkubiert.
• 6.2 2 × Waschen in Post-hybridisierungslösung (2 × SSC + NP40) für 5 min
• 6.3 Ein Aliquot (65 &mgr;l pro Schnitt) des Probengemisches besteht aus ULTRAhyb-Oligo HybPuffer (auf 37°C erwärmt) und Sonde:

• 6.4 Die Probe wird sofort auf jeden gerahmten Schnitt gebracht.
• 6.5 Der Rahmen wird mit einer Deckglasfolie bedeckt und der Schnitt wird 2 min bei 80°C auf dem Einsatz denaturiert.
• 6.6 Dann wird 16 h bei 37°C im PTC 200 PCR Cycler (BIO-RAD) inkubiert.

• 6.7 Einbringen von 50 ml der Nachhybridisierungslösung (2 × SSC + NP40) in ein Coplinglas und bei 75°+/–5°C in einem Wasserbad vorheizen und ebenso ein anderes leeres Coplinglas vorheizen (mindestens 1 h vor dem Einbringen der Schnitte)
• 6.8 Entfernung des Deckelglases und des Rahmens durch kurzes Eintauchen der Schnitte in die Nachhybridisierungslösung (phs) bei Zimmertemperatur im vorgewärmten Coplinglas.
• 6.9 Waschen der Schnitte für 2 min bei 75°C in vorgewärmter Nachhybridisierungslösung (es sollten nicht mehr als 5–6 Schnitte gleichzeitig gewaschen werden).
• 7.4 Kurzes Waschen der Schnitte in destilliertem Wasser und geschützt vor direktem Licht an der Luft trocknen lassen.
• 7.5 Auftragen von 10–15 &mgr;l DAPI/AntiFade (DCS:MAD-FISH-PK) auf den Schnitt und mit einem Deckelglas abdecken.
• 7.6 Die Schnitte bei 4°C dunkel lagern. Es wird empfohlen, mindestens 30 Minuten vor der mikroskopischen Evaluierung der Ergebnisse zu inkubieren.

Die beste Anzeige erhält man nach 24 h.

Die Ergebnisse werden in gezeigt.

• hier die zweite Möglichkeit des Amplifikatnachweises: die Alternative mit der biotinylierten Sonde
• (hat den Vorteil: der Fluoreszenzfarbstoff bleicht aus, das Reaktionsprodukt mit der biotinylierten Sonde = Fas Red nicht u. man braucht kein Fluoreszenzmikroskop

• Probe for Mycobacterium. tuberculosis complex (DESIGN:Metabion)
• Probe 5'-Biotin CAT AGG TGA GGT CTG CTA CC 3'
• konz. und vol. der Probe: 10 pmol/&mgr;l (200 nM) Probe/Schnitt: 1,3 &mgr;l

• 6.1 Die ULTRAhyb-Oligo HybPuffer (AMBION) werden auf 37°C gebracht, dann werden die Schnitte für 2 h bei 37°C im PTC 200 PCR Cycler (BIO-RAD) inkubiert.
• 6.2 2 × Waschen in Post-hybridisierungslösung (2 × SSC + NP40) für 5 min
• 6.3 Ein Aliquot (65 &mgr;l pro Schnitt) des Probengemisches besteht aus ULTRAhyb-Oligo HybPuffer (auf 37°C erwärmt) und Sonde:

• 6.4 Die Probe wird sofort auf jeden gerahmten Schnitt gebracht.
• 6.5 Der Rahmen wird mit einem Deckelglas bedeckt und der Schnitt wird 2 min bei 80°C auf dem Einsatz denaturiert.
• 6.6 Dann wird 16 h bei 37°C im PTC 200 PCR Cycler (BIO-RAD) inkubiert.

• 6.7 Kurzes Waschen der Schnitte in Tris ph 7,6
• 6.8 Aufbringen von 10–15 &mgr;l fertigem Avidin (DCS:Biogenex SS Multi Link alk. Phospatase) auf dem Schnitt und bei Zimmertemperatur 20 Minuten inkubieren.
• 6.9 Kurzes Waschen der Schnitte in Tris ph 7,6
• 6.10 Aufbringen von 10–15 &mgr;l gelöstem Fast Red Chromogen/Substrat (DCS:Biogenex), inkubieren unter mikroskopischer Kontrolle.
• 6.11 Kurzes Waschen der Schnitte in Aquadest; Kontrastfärbung mit Haemalaun und Abdecken mit einem Deckelglas.

Wie Beispiel 1, wobei die Durchführung der PCR mit einer Verlängerungstemperatur von 72°C erfolgt.

Auf den Abbildungen sind keine Ampidots zu erkennen.

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• - P. I. Schiller et al. Der Pathologe, Vol. 19, Nr. 4(1998) [0005]