Die Erfindung betrifft die Verwendung basische Acetophenone zur Herstellung von Arzneimitteln, die die enzymatische Aktivität der NO-Synthase hemmt.

NO-Synthasen (NOS) katalysieren die Umsetzung der Aminosäure L-Arginin zu Stickstoffmonoxid (NO) und L-Citrullin. Aufgrund der Beteiligung einer Überproduktion von Stickstoffmonoxid in zahlreichen pathophysiologischen Prozessen (Stuehr, 1999, Biochim Biophys Acta, 1411, 217–230) wird die Entwicklung von Hemmstoffen der NO-Synthasen als viel versprechende Strategie angesehen (Babu und Griffith, 1998, Curr Opin Chem Biol, 2, 491–500). Eine verstärkende Wirkung auf das Krankheitsgeschehen von übermäßig produziertem Stickstoffmonoxid besteht beispielsweise bei der Alzheimerkrankheit (Dorheim et al., 1994, Biochem Biophys Res Commun, 205, 659–665), Diabetes mellitus (Li und Förstermann, 2000, J Pathol, 190, 244–254), der Parkinsonkrankheit (Schulz et al., 1995, J Neurochem, 64, 936–939), multipler Sklerose (Reales et al., 1999, Biochim Biophys Acta, 1410, 215–228), rheumatoider Arthritis (Stefanovic-Racic et al., 1993, Arthritis Rheum, 36, 1036–1046), dem septischen Schock (Crossin, 1991, Trends Biochem Sci, 1991, 16, 81–82), Asthma bronchiale (Ligget et al., 1995, Am J Respir Crit Care Med, 152, 394–402), chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen (Boughton-Smith et al., 1993, Lancet, 342, 338–340), und der Migräne (Olesen et al., 1994, Trends Pharmacol Sci, 15, 149–153). Vor diesem Hintergrund wurden in den letzten Jahren zahlreiche Hemmstoffe entwickelt, die sich z. T. auch in Tiermodellen für die erwähnten Krankheiten als wirksam erwiesen haben. Besonders viel versprechend ist die pharmakologische Blockade von NO-Synthasen bei solchen Schmerzgeschehen, die eine Entzundungskomponente beinhalten. Hier wirken im Tiermodell NOS-Inhibitoren sowohl auf der Nociceptorebene als auch auf der Weiterleitungsebene (Stegmann et al., 2001, Anasthesiol Intensivmed Notfallmed Schmerzther, 36, 276–281). Leider konnte bislang keiner dieser Hemmstoffe zum Arzneistoff weiterentwickelt werden (Roman et al., 2002, Chem Rev, 102, 1179–1189).

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, Verbindungen bereitzustellen, die als Hemmstoffe für NO-Synthasen wirken und sich als pharmazeutische Wirkstoffe in Arzneimitteln eignen.

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe gelöst durch die die Merkmale des Anspruchs 1. Die Unteransprüche geben vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung an.

Als ein charakteristisches Beispiel für eine der erfindungsgemäß verwendeten Substanzen, die inhibierend auf die NO-Synthase wirkt, ist 4'-(4-Bromphenyl)-3-dimethylaminopropiophenonhydrochlorid zu nennen:

In einem in vitro Testsystem, bei dem L-Arginin in Anwesenheit von NO-Synthase zu L-Citrullin und Stickstoffmonoxid umgesetzt wird (Griess-Assay), bewirkt 4'-(4-Bromphenyl)-3-dimethylaminopropiophenonhydrochlorid eine konzentrationsabhängige Hemmung der im Zentralnervensystem vorkommenden bNOS von bis zu 88%. Die Verbindung ist zwar literaturbekannt (Niwa, H., 1957, Tohoku Yakka Daigaku Kiyo, 4, 69–78), eine NOS-inhibierende Wirkung ist bisher jedoch nicht beschrieben worden.

Als ein weiteres Beispiel für eine der erfindungsgemäß verwendeten Substanzen ist die Verbindung 4'-(4-Bromphenyl)-4-dimethylaminobutyrophenonhydrochlorid zu nennen. Diese Substanz ist nicht literaturbekannt und bewirkt eine ebenfalls konzentrationsabhängige Hemmung der bNOS von bis zu 99%.

Die erfindungsgemäß verwendeten basischen Acetophenone stellen somit hochwirksame niedermolekulare Hemmstoffe von NO-Synthasen dar. Sie sind leicht und kostengünstig über Standardmethoden und in hoher Reinheit zu synthetisieren. Überraschenderweise hat sich herausgestellt, dass die erfindungsgemäß verwendeten Substanzen eine Selektivität für die im Zentralnervensystem vorkommende bNOS aufweisen, die mit neuronalen Krankheiten wie Alzheimerkrankheit, Parkinsonkrankheit, multipler Sklerose und Migräne in Verbindung gebracht wird. In diesem Zusammenhang ist es von besonderer Bedeutung, dass die erfindungsgemäß verwendeten Hemmstoffe, aliphatische Amine mit lipophilem Rest, nach oraler Aufnahme und Resorption über das Darmepithel dazu in der Lage sind, die Blut-Hirn-Schranke zu überwinden.

Die konzentrationsabhängige Wirksamkeit der erfindungsgemäß verwendeten Substanzen wird in den vorliegenden Abbildungen genauer dargestellt. Es zeigt dabei

1 die Aktivität der bNOS in Abhängigkeit von der Konzentration an 4'-(4 Bromphenyl)-3-dimethylaminopropiophenonhydrochlorid

2 die Aktivität der bNOS in Abhängigkeit von der Konzentration an 4'-(4-Bromphenyl)-4-dimethylaminobutyrophenonhydrochlorid

Sowohl in 1 als auch in 2 wird die Aktivität der bNOS anhand der Nitritentstehung gemessen. Nitrit ist das Endprodukt von Stickstoffmonoxid in sauerstoffhaltiger wässriger Lösung. Kontrollinkubationen mit sämtlichen Cofaktoren, jedoch ohne Hemmstoffzusatz, wurden auf 100% festgelegt. Die Werte sind als Mittelwerte +/– Standardabweichung von drei Inkubationen angegeben, die jeweils doppelt vermessen wurden.

Die Synthese der erfindungsgemäß verwendeten NO-Syntase-Hemmstoffe und die Durchführung der z. T. in 1 und 2 dargestellten in vitro Tests zu deren Wirksamkeit werden im Folgenden näher erläutert.

Sämtliche erfindungsgemäß verwendeten Substanzen können nach gängigen Methoden hergestellt werden. Die Verbindungen mit der Kettenlänge n = 2 können durch Umsetzung teils substituierter Acetophenone mit Dimethylammoniumchlorid und Paraformaldehyd im Sinne einer Mannich-Reaktion erhalten werden. Die Acetophenonkomponenten wurden, soweit nicht kommerziell erhältlich, durch Friedel-Crafts-Acylierungen gewonnen. Die Reaktion ist im Folgenden beispielhaft für die Verbindung 4'-(4-Bromphenyl)-3-dimethylaminopropiophenonhydrochlorid dargestellt:

Verbindungen mit der Kettlänge n = 3 wurden durch Reaktion von substituierten 4-Chlorbutyrophenonderivaten mit Dimethylamin im Sinne einer nucleophilen Substitution erhalten. Diese Reaktion ist im Folgenden beispielhaft für die Verbindung 4'-(4-Bromphenyl)-4-dimethylaminobutyrophenonhydrochlorid angegeben:

Die angegebene freie Base wurde anschließend als Hydrochlorid gefällt. Die Butyrophenonkomponenten wurden, soweit nicht kommerziell erhältlich, ebenfalls durch Friedel-Crafts-Acylierungen gewonnen.

Die Schmelzpunkte der synthetisierten Substanzen wurden an Schmelzpunktapparatur Büchi 510 Gerät mit Mikroheiztisch Thermovar (Firma Reichert) aufgenommen. NMR-Spektren wurden an einem Kernresonanzspektrometer Broker ARX 300 aufgenommen. Die Aufnahmen von IR-Spektren (als KBr-Presslinge) erfolgten an einem Perkin-Elmer FT-IR 16 PC Spectrometer. Massenspektren wurden an einem Gerät vom Typ Hewlett-Packard 5989 aufgenommen. Elementaranalysen wurden am Institut für Anorganische Chemie der CAU zu Kiel mittels eines CHNS-Analysators der Firma Hekatech GmbH bestimmt. Soweit nicht anders angegeben wurden die Chemikalien in höchster Reinheit bei der Firma Sigma-Aldrich GmbH bezogen. (6R)-5,6,7,8-Tetrahydro-L-biopterin sowie die NO-Synthasen (bNOS, iNOS, eNOS) wurden bezogen von der Firma Axxora GmbH. Von der Firma Merck KGaA stammten Calciumchlorid Hexahydrat, Dimethylsulfoxid, Ethylendiamintetraessigsäure, Naphthylethylendiamindihydrochlorid sowie Nicotinamidadenindinucleotid-Tetranatriumsalz (reduzierte Form). Magnesiumchlorid Hexahydrat sowie L-Arginin wurde bei der Firma Fluka Chemie GmbH bezogen. Acetonitril stammte von der Firma LGC Promochem GmbH. Calmodulin (gereinigt, aus Schweinehirn) stammte von der Firma Roche Diagnostics GmbH. Die Vermessungen erfolgten an einem Spektralphotometer Varian Cary 50 Bio mit Water Peltier System PCB 150 und Einmalküvetten mikro, Zentrumshöhe 15 mm, Volumen 70–550 &mgr;l (Firma Varian GmbH).

Die Inkubationen der synthetisierten Substanzen mit den jeweiligen NO-Synthasen wurden wie folgt durchgeführt:

die Standard-Inkubationsansätze hatten folgende Zusammensetzung:

• – 60 &mgr;l einer Lösung aus dem Enzym (es handelte sich stets um rekombinante humane Isoenzyme), dem Substrat sowie den Cofaktoren
• – 10 &mgr;l des jeweiligen Inkubationspuffers
• – 10 &mgr;l einer zuvor in achtfacher Konzentration hergestellten Lösung der potenziellen Hemmstoffe, wobei ein Anlösen unter Verwendung von 10% Dimethylsulfoxid erfolgte; bei Kontrollansätzen wurden statt der Hemmstoff-Lösung weitere 10 &mgr;l Puffer pipettiert.

Die Ansätze wurden nach Herstellung für 20 min (iNOS und eNOS) bzw. für 30 min (bNOS) im Schüttelwasserbad bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden jeweils 20 &mgr;l einer Lösung zupipettiert, die Natriumpyruvat (1,6 mM, im jeweiligen Inkubationspuffer) und Lactatdehydrogenase (20 U/ml, im jeweiligen Inkubationspuffer) enthielt. Nach einer weiteren Inkubation für 20 min im Schüttelwasserbad bei 37°C wurden die Inkubationen durch Zugabe von je 50 &mgr;l eiskalten Acetonitrils abgestoppt. Dann wurden etwaige Niederschläge abzentrifugiert (ungekühlte Laborzentrifuge, 10.000 rpm, 5 min). Jeweils 120 &mgr;l der Überstände wurden mit 24 &mgr;l einer Lösung aus Sulfanilamid und Naphthylethylendiamindihydrochlorid versetzt. Nach 5 min Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Lösungen bei der Wellenlänge 543 nm vermessen, wobei als Blindwert die erwähnte nicht-enzymhaltige Probe verwendet wurde. Beim Griess-Assay wird ausgenutzt, dass Stickstoffmonoxid sich in wässrigen Lösungen äquimolar zu Nitrit umsetzt (Ignarro et al., 1993, Proc Natl Acad Sei USA, 90, 8103–8107). Das Nitrit kann quantitativ durch Reaktion mit Sulfanilamid und Naphthylethylendiamin in saurem Milieu bestimmt werden. Es entsteht ein Azofarbstoff, der spektralphotometrisch vermessen werden kann. Die Lösung enthielt Naphthylethylendiamindihydrochlorid 5,8 mM und Sulfanilamid 52 mM. Als Lösungsmittel wurde 1N HCl verwendet. Unter Bezugnahme auf die Kontroll-Ansätze, die keine Hemmstoffe enthielten, wurden die relativen Nitritbildungen ermittelt. Eine Übersicht über sämtliche in den Standard-Inkubationsansätzen verwendeten Zusätze und Konzentrationen von Substrat und Cofaktoren liefert die unten stehende Tabelle, als Lösungsmittel wurden die jeweiligen Inkubationspuffer verwendet. Im Falle des Tetrahydrobiopterins wurde aus Stabilitätsgründen 0,1 mM HCl benutzt: Inkubationszusatz Endkonzentration Lagerung L-Arginin (bNOS) 0,5 mM 4°C L-Arginin (iNOS und eNOS) 1 mM 4°C Tetrahydrobiopterin 10 &mgr;M –20°C CaCl₂ (bNOS und eNOS) 0,5 mM 4°C Calmodulin (bNOS und eNOS) 10 &mgr;g/ml –20°C Flavinadenindinucleotid, reduzierte Form 5 &mgr;M –20°C Flavinmononucleotid, reduzierte Form 5 &mgr;M –20°C MgCl₂ (iNOS) 1 mM 4°C Nicotinamiddinucleotid, reduzierte Form 0,5 mM –20°C

Der für bNOS-Inkubationen verwendete Puffer hatte folgende Zusammensetzung: Triethanolamin 50 mM, 2-Mercaptoethanol 10 mM, 3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]propansulfat 1 mM, Ethylendiamintetraessigsäure 0,5 mM. Nach Herstellung wurde der pH-Wert auf 7,0 eingestellt.

Puffer B bestand aus einer 50 mM und auf pH = 7,5 eingestellten Triethanolamin-Lösung.